KR20140053981A - 구강 내 질환의 예방 또는 치료제 - Google Patents

구강 내 질환의 예방 또는 치료제 Download PDF

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Abstract

구강 세균에 의한 휘발성 황 화합물의 산생을 억제할 수 있고, 또한 우식성 및 감염성 심내막염의 기염성이 없고, 구강 내에서 안전한 신규 유산균주 및 이것을 사용한 구강 내 질환이나 불쾌 증상의 예방, 개선 및/또는 치료제의 제공.
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 유효 성분으로 하는 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다

Description

구강 내 질환의 예방 또는 치료제 {PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR ORAL DISEASES}
본 발명은 우식증, 치주병, 구취 등의 구강 내 질환이나 불쾌 증상의 예방, 개선 및/또는 치료제에 관한 것이다.
구취는 보이지 않는 심미로서 쾌적한 개인 생활 및 사회 생활을 보내는 데에 있어서 그 중요성이 지적되고 있다. 구취가 구강의 QOL (quality of life：생활의 질) 에 주는 영향을 정량적으로 측정한 결과, 형태적인 심미 이상으로 관여하고 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1). 또한, 급격한 고령화 사회를 맞이한 일본에 있어서, 구취는 고령자 시중을 곤란하게 하는 한 요인으로서도 우려되고 있다 (비특허문헌 2).
구취의 주된 원인은 황화수소, 메틸메르캅탄, 디메틸설파이드의 3 종류의 휘발성 황 화합물 (VSC) 이다 (비특허문헌 3, 4). VSC 는 구강 내의 박리 상피 세포나 백혈구의 잔해, 음식물 등에 포함되는 시스테인, 메티오닌 등이 구강 세균에 의해 분해됨으로써 발생하는 것으로 생각되고 있다. 구강 세균을 사용한 배양 시험에서, 푸소박테리움속, 포르피로모나스속, 베일로넬라속 및 스피로헤타 등의 치주 병원성 세균이 다량의 VSC 를 산생하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 5). 또, 구강 내로부터 분리된 락토바실러스·올리스 (Lactobacillus olis) 에 강한 VSC 산생 능력이 있는 것도 밝혀져 있다. VSC 는 그 자체가 강한 불쾌취임과 함께, 저농도에서도 생체 조직에 대한 독성을 갖는 점에서, 단순히 구취 원인 물질로서 뿐만 아니라, 치주병의 병태 (病態) 를 악화시키는 인자일 가능성이 높은 것도 보고되어 있다 (비특허문헌 6). 그 때문에, 구강 세균, 특히 치주 병원성 세균에 의한 VSC 의 산생을 억제하여 구취를 예방 또는 개선하는 것은 QOL 을 높일 뿐만 아니라, 구강의 건강 유지에 있어서도 중요하다.
최근, 프로 바이오틱스 기술을 구강 내에서도 이용하는 시도가 이루어져, 예를 들어, 락토바실러스·살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) TI 2711 주 (특허문헌 1) 가 구취나 우식증, 치주병, 구강 내 감염증 등에 유용하다는 것이 보고되어 있다.
일본특허공보 제4203855호
일본 공중 위생 잡지 49, 2002, p298 (재) 의료 경제 연구 기구 평성 7년도 조사 연구 보고 Arch Oral Biol 16, 1971：587-597 Int. Dent. J 28, 1978：309-319 구강 위생 회지 51, 2001, p778-792 니가타 치학 회지 32, 2002, p309-310 J Med Microbiol 39, 1991：179-182 Eur J Clin Microbiol Infect Dis 24, 2005：31-40 Journal of Infection 53, 2006：e5-e10
그러나 한편으로, 구강 내의 락토바실러스속이나 스트렙토콕쿠스속의 세균은 우식이나 감염성 심내막염 원인의 하나일 가능성이 지적되고 있다. 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) 는 우식원성 균으로서 알려져 있으며, 그 유해성에 관해서는 스트렙토콕쿠스·무탄스 (Streptococcus mutans) 보다 강하고, 우식의 원인으로서 임상 분야에서 문제시되고 있는 세균이다. 또, 최고 빈도로 검출되는 감염성 심내막염의 기인 미생물은 스트렙토콕쿠스·상귀니스 (Streptococcus sanguinis), 스트렙토콕쿠스·오랄리스 (Streptococcus oralis) 등의 구강 내의 스트렙토콕쿠스속의 세균이며 (비특허문헌 7), 락토바실러스속의 세균 중에도, 심내막염을 야기하는 주가 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 8, 9).
그 때문에, 구강 내 균총의 정상화를 위해서 사용하는 세균은 VSC 의 산생을 억제할 수 있는 것에 더하여, 우식성 및 감염성 심내막염의 기염성이 없는 것이 바람직하지만, 이들 성질을 갖는 안전한 균은 지금까지 보고되어 있지 않다.
따라서, 본 발명의 과제는 구강 세균에 의한 휘발성 황 화합물의 산생을 억제할 수 있고, 또한 우식성 및 감염성 심내막염의 기염성이 없고, 구강 내에서 안전한 신규 유산균주 및 이것을 사용한 구강 내 질환이나 불쾌 증상의 예방, 개선 및/또는 치료제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 구강 내 미생물에 대하여 예의 검토한 바, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에 속하는 특정 유산균이 치면 및 구강 내 세포로의 접착성이 높고, 구취 원인균이기도 한 치주 병원성 세균의 증식 저해 작용을 가져, VSC 산생을 억제할 수 있는 것, 또, 유산균 자체도 VSC 및 비수용성 글루칸을 산생하지 않는 것을 알아내었다. 또한 당해 유산균은 우식성 및 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않으므로 구강 내 균총의 정상화를 위해서 사용하는 세균으로서 유용한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 유효 성분으로 하는 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제를 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 유효 성분으로 하는 구취의 예방 및/또는 개선제를 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 라고 명명되고, FERM BP-11500 으로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 이라고 명명되고, FERM BP-11501 로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 이라고 명명되고, FERM BP-11502 로서 기탁된 유산균, 또는 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 라고 명명되고, FERM BP-11503 으로서 기탁된 유산균을 제공하는 것이다.
또, 본 발명은 상기 유산균을 함유하는 음식품을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유산균을 함유하는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의, 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의, 구취의 예방 및/또는 개선제 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 구취의 예방 및/또는 개선 방법을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또한 본 발명은 구취의 예방 및/또는 개선을 위한, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 제공하는 것이다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 본 발명은 배열 번호 4 ∼ 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 제공하는 것이다.
또, 본 발명은 배열 번호 4 및 8, 배열 번호 5 및 8, 배열 번호 6 및 8, 배열 번호 7 및 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 특이적인 프라이머 페어를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머, 프라이머 페어 또는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 유산균은 치면 및 구강 내에 정착하여, 우식원성 세균이나 구취 원인균이기도 한 치주 병원성 세균의 증식 저해 작용을 갖고, 한편으로 VSC 산생능, 비수용성 글루칸 산생능, 우식성 및 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않으므로, 구강 내 균총의 정상화를 도모하고, 우식증, 치주병, 구취 등의 다양한 구강 내 질환 또는 불쾌 증상의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘하는 의약품, 음식품, 페트 푸드, 구강 내 조성물 등에 유용하다.
도 1 은 YIT 12319 ∼ 12321 을 접촉시킨 소 에나멜질의 경도 변화를 나타내는 도면이다.
도 2 는 YIT 12319 ∼ 12321 을 접촉시킨 소 에나멜질로부터 회수된 바이오 필름 중의 비수용성 글루칸량을 나타내는 도면이다.
도 3 은 YIT 12322 를 접촉시킨 소 에나멜질의 경도 변화를 나타내는 도면이다.
도 4 는 YIT 12322 를 접촉시킨 소 에나멜질로부터 회수된 바이오 필름 중의 비수용성 글루칸량을 나타내는 도면이다.
도 5 는 YIT 12321 을 접촉시킨 소 에나멜질의 경도 변화를 나타내는 도면이다.
도 6 은 YIT 12321 의 수크로오스 자화성을 나타내는 도면이다.
도 7 은 YIT 12319 에 특이적인 프라이머 페어로 증폭시킨 DNA 밴드를 나타내는 도면이다 (화살표는 특이적인 DNA 밴드를, 또 사용한 프라이머 페어를 옆에 기술한다).
본 발명에 사용되는 유산균으로는, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에 속하는 유산균주를 들 수 있고, 이들 균주의 1 종 또는 2 종 이상이어도 된다.
구체적으로는, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 라고 명명되고, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터 (주소：이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6) 에 2011년 4월 28 일자로 (이하, 동일) FERM BP-11500 으로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 이라고 명명되고, FERM BP-11501 로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 이라고 명명되고, FERM BP-11502 로서 기탁된 유산균, 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 라고 명명되고, FERM BP-11503 으로서 기탁된 유산균을 들 수 있다. 당해 유산균에는, 이들을 친주로 하는 자손주 (자연 변이주, 변이 처리에 의한 변이주, 유전자 조작에 의한 변이주 등) 도 포함된다.
상기 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 는, 후기 실시예에 나타내는 바와 같이, 사람 구강 내로부터 본 발명자들에 의해 처음으로 분리된 것이며, 16S-rDNA 유전자 배열에 따라 상동성 검색을 실시한 결과, 락토바실러스·크리스파투스, 락토바실러스·퍼멘텀, 락토바실러스·가세리 또는 스트렙토콕쿠스·미티스에 속하는 균주로 판정되었다. 이들 유산균주는 다음의 특징적인 성질 (1) ∼ (6) 을 갖는 점에서 신규 균주인 것이 판명되었다.
(1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
(2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
(3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
(4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
(5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
(6) 우식성을 갖지 않는다
또, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 은 다음의 성질 (7) 을 갖는 것이 확인되었다.
(7) 수크로오스를 자화하지 않는다
또한, 본 명세서에 있어서, (1) 「휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 2) 에서, VSC 의 산생능이 ＋/－ (H2S＜0.70 ㎍ / 10 ㎖ / O. D., CH3SH＜1.17 ㎍ / 10 ㎖ / O. D.) 인 것을 말하며, 보다 바람직하게는 － (검출 하한값 이하) 인 것을 말한다. 당해 성질 (1) 을 갖는 유산균은 구취 원인 물질이고, 나아가서는 치주병의 병태를 악화시키는 인자인 VSC 를 산생하지 않는 점에서 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서, (2) 「비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 3) 에서, 비수용성 글루칸 산생능이 ＋/－ (균체가 부착된다) 인 것을 말하며, 보다 바람직하게는 － (산생하지 않는다) 인 것을 말한다. 당해 성질 (2) 를 갖는 유산균은 우식의 원인이 되는 비수용성 글루칸을 산생하지 않는 점에서 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서, (3) 「치면으로의 접착성을 갖는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 5) 에서, S-HA 로의 접착률이 1.0 ％ 이상인 것을 말하며, 보다 바람직하게는 10 ％ 이상의 것을 말한다. 또, 본 명세서에 있어서, (3) 「구강 내 세포로의 접착성을 갖는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 6) 에서, 구강 내 세포로의 접착성이 Total 30 cells / 0.16 ㎟ 이상인 것을 말한다. 당해 성질 (3) 에 있어서, 치면 또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는 유산균은 경구적으로 투여되었을 경우 등, 짧은 체류 시간이더라도 구내 (口內) 에 의해 정착되기 쉬운 점에서 바람직하고, 동일한 점에서, 치면 및 구강 내 세포로의 접착성을 갖는 유산균이 보다 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서, (4) 「구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 7) 에서 저지원 직경 (직경) 의 합계가 9 ㎜ 이상인 것을 말한다. 당해 성질 (4) 를 갖는 유산균은 구취 및/또는 치주병 등에 대한 우수한 예방·치료 효과를 발휘하는 점에서 바람직하다.
또, 본 명세서에 있어서, (5) 「감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 8) 에서, 래트 심내막염 기염성이 음성인 것을 말한다. 당해 성질 (5) 를 갖는 유산균은 안전성이 매우 높아, 음식품, 구강용 조성물 등으로서 바람직하게 이용할 수 있다.
또, 본 명세서에 있어서, (6) 「우식성을 갖지 않는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 9) 에서, 인공 구강 장치에 의한 시험 후의 소 에나멜질의 경도 저하 비율이 5 ％ 미만인 것을 말한다. 당해 성질 (6) 을 갖는 유산균은 우식의 원인이 되는 비수용성 글루칸을 산생하지 않고, 에나멜질을 탈회하지 않는 점에서 바람직하다.
나아가 또, 본 명세서에 있어서, (7) 「수크로오스를 자화하지 않는다」 란, 후기 실시예에 나타내는 시험 (시험예 9) 에서, 수크로오스를 균의 증식 기질로서 이용할 수 없는 것을 말한다. 당해 성질 (7) 을 갖는 유산균은 락트산을 잘 발생시키지 않아, 우식 리스크를 저감할 수 있는 점에서 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 유산균의 균체를 유산균 배양의 통상적인 방법에 따라 배양하고, 얻어진 배양물로부터 원심 분리 등의 집균 수단에 의해 분리된 것을 그대로 사용하는 것 뿐만 아니라, 배양 종료 후의 유산균 배양물을 그대로, 혹은 배지를 농축한 농축물로서 사용할 수도 있다. 또, 생균체 뿐만 아니라 균체의 처리물이어도 된다. 그 처리물은 통상적인 방법의 처리에 의해 얻어지는 것이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들어, 가열 처리, 항생 물질 등의 약물에 의한 처리, 포르말린 등의 화학 물질에 의한 처리, 자외선에 의한 처리, γ 선 등의 방사선 처리 등에 의한 사균체, 그 동결 건조물, 이들을 함유하는 배양물；세균의 초음파 등에 의한 파쇄액, 세균의 효소 처리액, 이들을 여과나 원심 분리 등의 고액(固液) 분리 수단에 의해 분리한 고체 잔류물 등；세포벽을 효소 혹은 기계적 수단에 의해 제거한 처리액, 당해 처리액의 농축물, 그들의 희석물, 그들의 건조물 등；세균을 계면 활성제 등에 의해 용해한 후, 에탄올 등에 의해 침전시켜 얻어지는 핵산 함유 획분；상기 세균의 초음파 등에 의한 파쇄액이나 세포의 효소 처리액 등에 대해, 각종 크로마토그래피 등에 의한 분리 등의 분리·정제 처리를 실시한 것 등을 들 수 있다.
유산균을 배양하는 배지는 특별히 한정되지 않고, 다양한 배지를 사용할 수 있다.
예를 들어, 글루코오스, 프락토오스, 갈락토오스, 수크로오스 등의 탄소원, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 황산마그네슘, 아황산 소다, 티오황산 소다, 인산암모늄 등의 무기염류, 폴리펩톤, 효모 엑기스, 콘 스팁 리커 등의 유기 영양원 외에, 필요에 따라 각종 아미노산, 비타민류가 첨가되어 이루어지는 유산균 증식용으로서 통상적으로 이용되는 영양 배지 외에, 젖을 포함하는 유배지 (乳培地) 를 사용할 수 있다.
배양은 균체가 양호하게 생육하는 조건이면 된다. 배양 방법은 특별히 한정되지 않고, 통기 배양, 혐기 배양, 교반 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등을 들 수 있으며, 생산성을 고려하여, 호기적 조건하에서 정치 배양하는 것이 바람직하다.
또, 배양 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 25 ∼ 37 ℃ 이며, 배양 기간은 통상적으로 6 시간 ∼ 3 일간, 바람직하게는 8 시간 ∼ 3 일간이다.
또, 배지의 pH (25 ℃) 는 3 ∼ 10, 바람직하게는 5 ∼ 8 이다. 배지의 pH 를 조정하는 완충제로는, 예를 들어, 탄산, 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 말산, 락트산, 글루콘산, 타르타르산 등의 유기산염, 인산, 염산, 황산 등의 무기염, 수산화나트륨 등의 수산화물, 암모니아 또는 암모니아수 등을 들 수 있으며, 이들을 단독 또는 2 종 이상 조합하여 사용해도 된다.
본 발명의 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제에 있어서의 「구강 내 질환」 으로는, 우식원성 세균, 치주 병원성 세균, 칸디다균 등의 구강 내의 병원성 세균에 의해 야기되는 구강 내 질환을 말하며, 예를 들어, 우식증, 치은염, 치주염 등의 치주병, 구강 칸디다증을 들 수 있다. 구강 내 질환은 바람직하게는 치은염, 치주염 등의 치주병이다.
우식원성 세균으로는, 예를 들어, 스트렙토콕쿠스·무탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus), 치주 병원성 세균으로는, 예를 들어, 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라·인터메디아 (Prevotella intermedia), 트레포네마·덴티콜라 (Treponema denticola), 탄네렐라·포사이시어 (Tannerella forsythia), 어그리게이티벡터·액티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 등을 들 수 있고, 구강 칸디다증 원인균으로는, 예를 들어, 칸디다·알비칸스 (Candida albicans) 등을 들 수 있다.
본 발명의 구취의 예방 및/또는 개선제에 있어서의 「구취 원인균」 으로는, 예를 들어, 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라·인터메디아 (Prevotella intermedia), 트레포네마·덴티콜라 (Treponema denticola), 베이로넬라·디스파 (Veillonella dispar) 등을 들 수 있다.
후기 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 유산균은 치면 및 구강 내에 접착하여, 구취 원인균·치주 병원성 세균인 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라·인터메디아 (Prevotella intermedia) 및 어그리게이티벡터·액티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomi tans) 에 대해 증식 저해 작용을 갖는다. 또, 본 발명의 유산균은 구취의 원인이 되는 VSC 나, 우식의 원인이 되는 비수용성 글루칸을 산생하지 않고, 또, 에나멜질을 탈회하지 않고, 또한 감염성 심내막염을 야기하지 않는 것이 확인되었다.
따라서, 본 발명의 유산균은 구강 내 세균총의 정상화를 도모하여, 구강 내의 병원성 세균에 의해 야기되는 우식증, 치은염, 치주염 등의 치주병, 구강 칸디다증, 구취 등의 다양한 구강 내 질환 또는 불쾌 증상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약품, 음식품, 페트 푸드, 구강용 조성물 등으로서 사용할 수 있다.
의약품으로서 사용하는 경우에 있어서의 경구 투여 제제의 제형으로는, 예를 들어, 정제, 캡슐제, 과립제, 당의정, 환제, 세립제, 산제, 분제, 서방성 제제, 현탁액, 에멀션제, 시럽제, 동결 건조제, 액제, 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
상기 제제는 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있으며, 또, 본 발명의 유산균을 단독으로 사용해도 되고, 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 사용해도 된다. 그 담체로는, 예를 들어, 유당, 백당, 염화나트륨, 포도당, 우레아, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 규산 등의 부형제；전분, 덱스트린, 아라비아 고무 분말, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 결정 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 매크로골 등의 결합제；하이드록시프로필 스타치, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스, 저치환 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 붕괴제；라우릴황산나트륨, 대두 레시틴, 자당 지방산 에스테르, 폴리소르베이트 80 등의 계면 활성제；탤크, 납류, 수소 첨가 식물유, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아르산알루미늄, 폴리에틸렌글리콜 등의 활택제；경질 무수 규산, 건조 수산화 알루미늄 겔, 합성 규산알루미늄, 규산마그네슘 등의 유동성 촉진제；주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 수용액, 올리브유, 참기름, 땅콩유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 희석제 등을 들 수 있다. 또, 필요에 따라, 교미제, 착색제, 향료, 살균제, 삼투압 조정제, pH 조정제, 유화제, 흡수 보조제, 산화 방지제, 증점제, 등장화제 등의 관용의 첨가제를 적절히 첨가할 수도 있다.
또, 음식품, 페트 푸드 등으로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 유산균에 필요에 따라 각종 영양 성분을 첨가하여, 상기 음식품 등에 함유시키면 된다. 이 음식품 등은, 예를 들어, 우식증, 치주병, 구취의 예방 또는 개선에 유용한 보건용 식품 또는 식품 소재로서 이용할 수 있으며, 이들 음식품 등 또는 그 용기에는 상기 효과를 갖는 취지의 표시를 붙여도 된다.
음식품 등의 형태로는, 음식품 등으로서 사용 가능한 첨가제를 적절히 사용하여, 관용 수단을 이용하여 식용에 적절한 형태, 예를 들어, 과립상, 입상, 정제, 캡슐, 페이스트 등으로 성형해도 되고, 또 각종 식품, 예를 들어, 햄, 소세지 등의 식육 가공품, 어묵, 대롱 어묵 등의 수산 가공품；빵, 과자, 버터, 분유, 발효 음식품에 첨가하여 사용하고, 또는 물, 과즙, 우유, 청량 음료, 차 음료 등의 음료에 첨가하여 사용해도 된다. 이들 중에서도, 유효 성분인 유산균을 함유하는 발효유, 발효 음료 (유산균 음료), 발효 두유, 발효 과즙, 발효 식물액 등의 발효 제품, 정제, 캡슐 등의 서플리먼트 제품이 바람직하다.
발효 제품의 제조는 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 발효유는 살균한 유배지에 유산균을 접종 배양하고, 이것을 균질화 처리하여 발효유 베이스를 얻는다. 이어서 별도 조제한 시럽 용액을 첨가 혼합하여, 호모게나이저 등으로 균질화하고, 추가로 플레이버를 첨가하여 최종 제품으로 할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 발효유는 플레인 타입, 소프트 타입, 후루츠 플레이버 타입, 고형상, 액상 등 어느 형태의 제품으로 할 수도 있다.
구강용 조성물로서 사용하는 경우의 구체적인 형태로는, 세구제, 마우스 워시, 크림 치약, 분말 치약, 물 치약, 구강용 연고제, 겔제, 정제, 과립제, 세립제, 구미젤리, 트로치, 태블릿, 캡슐, 캔디, 츄잉검 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 크림 치약, 세구제, 구미젤리, 트로치, 정제, 태블릿을 들 수 있다.
상기 의약품, 음식품, 페트 푸드, 구강용 조성물 등에 있어서의 본 발명의 유산균의 함유량은 특별히 한정되지 않고, 하루 투여량 또는 섭취량에 맞추어 적절히 조절하면 되지만, 예를 들어 제형이 액체인 경우에는, 유산균체 농도를 1×106 CFU/㎖ ∼ 1×108 CFU/㎖ 로 하는 것이 바람직하고, 고체인 경우에는, 1×107 CFU/g ∼ 1×1010 CFU/g 로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유산균을 사용할 때의 투여량 또는 섭취량에 엄격한 제한은 없다. 대상자나 적용 질환 등의 다양한 사용 양태에 따라 얻어지는 효과가 다르기 때문에, 적절히 설정하는 것이 바람직하지만, 유산균의 균수를, 1×103 CFU 이상을 1 일량으로서 함유하는 양이 바람직하고, 1×103 ∼ 1×1013 CFU 를 1 일량으로서 함유하는 양이 보다 바람직하며, 1×106 ∼ 1×1010 CFU 를 1 일량으로서 함유하는 양이 특히 바람직하다.
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 및 다른 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의 게놈 DNA 를 해석한 바, 배열 번호 4 ∼ 8 에서 선택되는 염기 배열이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 에 특이적인 것, 및 이들 염기 배열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 사용하면, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 의 유전자가 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 것을 알아내었다.
본 발명의 프로브 또는 프라이머는 배열 번호 4 ∼ 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지고, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 균주 특이적인 프로브 또는 프라이머이다.
상기 프라이머로는, 배열 번호 4 및 배열 번호 5, 배열 번호 4 및 6, 배열 번호 4 및 7, 배열 번호 4 및 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지는 프라이머가 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 대한 특이성이 높은 점에서 보다 바람직하다.
상기 프로브 또는 프라이머를 사용함으로써, 생리·생화학적 성상의 확인 등 번잡한 조작을 실시하지 않고 검체로부터 추출한 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 유래의 DNA 를 사용한 PCR 반응에 의해, 신속하고 간편하게 당해 균주의 동정·해석·검출 등을 실시하는 것이 가능해진다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
시험예 1 구강 세균의 분리
1) 피험자와 시료의 채취
피험자 56 명 (남성 34 명, 여성 22 명, 25 ∼ 66 세, 평균 연령 40.6 세) 으로부터 치석 (타액을 포함한다) 과 설태를 별개로 채취하였다. 이 구강 시료는 채취 후, 사용할 때까지 얼음 위에 정치하였다. 균의 분리시에는, 이들 시료를 등량 혼합 후, 그 300 ㎕ 를 2.7 ㎖ 의 멸균 혐기 수송 배지에 첨가하고, 10-1 희석액을 제조하였다 (호기·혐기 배양용 3.0 ㎖ × 각 1 개).
2) 구강 세균의 배양과 분리
브루셀라 토끼 용혈 평판 배지 (BRU 평판 배지, 트립토펜 10.0 g, 펩타민 10.0 g, 효모 엑기스 2.0 g, 글루코오스 1.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 산성 아황산나트륨 0.1 g, 헤민 5.0 ㎎, 비타민 K1 1.0 ㎎, 발육 보조액 10.0 ㎖, 토끼 용혈액 60.0 ㎖, 한천 15.0 g, pH 7.0) 로의 구강 시료의 도포 조작은 혐기 글로브 박스 내에서 실시하였다. 디스포저블 시험관 (FALCON2058) 에 멸균 혐기 희석액을 1.8 ㎖ 분주하고, 10-1 희석액을 200 ㎕ 첨가하여 10-2 희석액을 제조하였다. 이하 동일하게 하여 10-10 희석액까지 제조하고, 각 희석액 100 ㎕ 를 평판 배지에 도포한 후, 표 1 에 나타내는 조건으로 배양하였다.
한편, 5.0 ％ 양 혈액 첨가 TSA 평판 배지 (TSA 평판 배지, 카세인 펩톤 15.0 g, 대두 펩톤 5.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 양 탈섬유 혈액 50.0 ㎖, 한천 15.0 g, DW 1000 ㎖, pH 7.3), MRS 평판 배지 (Proteose Peptone No. 3 10.0 g, Beef Extract 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, Dextrose 20.0 g, Polysorbate 80 1.0 g, Ammonium Citrate 2.0 g, Sodium Acetate 5.0 g, Magnesium Sulfate 0.1 g, Manganese Sulfate 0.05 g, Dipotassium Phosphate 2.0 g, Agar 15 g, DW 1000 ㎖), LBS 평판 배지 (Pancreatic Digest of Casein 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, Monopotassium Phosphate 6.0 g, Ammonium Citrate 2.0 g, Dextrose 20.0 g, Polysorbate 80 1.0 g, Sodium Acetate Hydrate 25.0 g, Magnesium Sulfate 0.575 g, Manganese Sulfate 0.12 g, Ferrous Sulfate 0.034 g, Agar 15.0 g, Lab-lemco powder (Oxoid) 8 g, Sodium acetate, trihydorate 15 g, DW 1000 ㎖ Acetate 3.7 ㎖), 및 Mitis-Salivarius 평판 배지 (MS 평판 배지, Bacto Tryptose 10 g, Bacto Proteose Peptone No. 3 5 g, Bacto Proteose Peptone 5 g, Bacto Dextrose 1 g, Bacto Saccharose 50 g, Dipotassium Phosphate 4 g, Trypan Blue 0.075 g, Bacto Crystal Violet 0.0008 g, Bacto Agar 15 g DW 1000 ㎖, pH 7.0±0.2) 에 대해서는, 스파이럴 시스템 (자동 평판 도포 장치) 을 사용하여 시료를 도포한 후, 표 1 에 나타내는 조건으로 배양하였다.
Figure pct00001
각종 평판 배지에 생육한 구강 내 세균 수를 표 2 에 나타낸다.
MRS, MS 및 LBS 평판 배지에 대해, 희석율이 높은 희석액을 도포한 평판 배지부터 순서대로, 형태가 상이한 콜로니로부터 조균 (釣菌) 하고, MRS 혹은 BHI 액체 배지 (송아지 뇌 침출물 12.5 g, 소 심근 침출물 5.0 g, 프로테오스 펩톤 10.0 g, 포도당 2.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 인산수소이나트륨 2.5 g, DW 1000 ㎖, pH 7.4±0.2) 에서 증식시킨 후, 2×BHI：글리세롤 = 1：1 용액에 현탁하고, －80 ℃ 에서 보존하여, 이하의 시험에 제공하였다.
Figure pct00002
시험예 2 VSC 산생능의 평가
시험예 1 에서 분리한 동결 보존 균주를 사용하였다. 또, 양성 대조주로서 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) YIT 6069 를 사용하였다.
상기 분리 균주를 MRS 액체 배지에 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 이 균체의 배양액 0.04 ㎖ 를 1 ％ D-(＋)-글루코오스, 66 mM DL-메티오닌 (최종농도 500-1, 500 μM) 을 포함하는 변법 GAM 액체 배지 (펩톤 5.0 g, 대두 펩톤 3.0 g, 프로테오제 펩톤 5.0 g, 소화 혈청 분말 10.0 g, 효모 엑기스 분말 2.5 g, 고기 엑기스 분말 2.2 g, 간장 엑기스 분말 1.2 g, 포도당 0.5 g, 용성 전분 5.0 g, L-트립토판 0.2 g, L-시스테인 염산염 0.3 g, 티오글리콜산나트륨 0.3 g, L-아르기닌 1.0 g, 비타민 K1 5 ㎎, 헤민 10 ㎎, 인산이수소칼륨 2.5 g, 염화나트륨 3.0 g, DW 1000 ㎖, pH 7.3) 4 ㎖ 에 이어 심고, 37 ℃ 에서 혐기적으로 배양하였다. 배양 개시 24 시간 후, 배양액에 6.0 N 의 염산 용액 0.16 ㎖ 를 첨가하여 pH 를 1 이하로 저하시키고, 균체의 물질 대사를 정지시켰다.
그 후, 헤드 스페이스에 휘발된 휘발성 황 화합물 (VSC) 을 가스 크로마토그래프 혹은 오랄 크로마에 의해 분석하였다. 또한, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기적으로 인큐베이트한 배지를 음성 대조로 하였다.
시험예 3 비수용성 글루칸 산생능의 평가
시험예 1 에서 분리한 동결 보존 균주를 BHI 또는 MRS 액체 배지에 2 백금이 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 이 균체의 배양액 0.04 ㎖ 를 1 ％ 수크로오스를 포함하는 HI (소 심근 침출물 5.0 g, 프로테오스 펩톤 10.0 g, 포도당 2.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 인산수소이나트륨 2.5 g, DW 1000 ㎖, pH 7.4 ± 0.2), 또는 MRS＋HI 의 혼합 (7：3) 액체 배지 4 ㎖ 에 이어 심고, 시험관을 45 도로 기울여 37 ℃ 에서 혐기적으로 배양하였다.
비수용성 글루칸의 산생능은 시험관 벽에 부착되는 글루칸의 양 및 그 부착 강도로 평가하였다. 배양 24 시간 후에, 시험관으로부터 배양액을 제거하고, PBS 4 ㎖ 를 첨가하여 부드럽게 3 회전시켜, 관 벽을 세정하였다. PBS 를 제거한 후, 시험관의 벽면에 부착되어 있는 비수용성 글루칸량을 표 3 의 기준에 따라, 시각적으로 판정하였다.
시험예 2 및 3 의 결과를 표 3 에 나타낸다. 시험예 1 에서 분리한 동결 보존 균주 중, 표 3 의 점선으로 둘러싼 합계 241 주를 선발하였다. 이 중, MRS 및 MS 배지로부터 단리한 스트렙토콕쿠스형 세균이 176 주, LBS 배지로부터 단리한 락토바실러스형 세균이 65 주였다.
또한, 양성 대조주인 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) YIT 6069 는 메티오닌의 첨가량에 의존하여 VSC 를 산생하였다.
Figure pct00003
시험예 4 균종의 동정
DNA 를 벤질·클로라이드법에 의해 추출하였다. 배양 후의 균체를 830×g, 10 분간 원심 분리하여, 균체를 얻었다. 이 균체에 200 ㎕ DNA Extraction 버퍼, 400 ㎕ 염화벤질, 300 ㎎ 의 유리 비즈 (직경 0.1 ㎜) 를 첨가하였다. FastPrep 에 의해 진탕한 후 (스피드 6.5, 30 초간), 원심 분리 (20,000×g, 5 분간, 4 ℃) 하여 얻어진 상청에 당량의 이소프로판올을 첨가하여 잘 교반하였다. 원심 분리 (20,000×g, 10 분간, 4 ℃) 하여 상청을 제거한 후, 150 ㎕ 의 70 ％ 에탄올을 첨가하고, 재차 원심 분리하여 얻어진 침전을 풍건시키고, 적량의 TE (Tris-EDTA) 에 용해하였다. PCR 반응액은 전체량 25 ㎕ 중에 3.2 ㎕ 의 10×PCR buffer (1×PCR buffer = 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 2.5 ㎕ 의 2.5 mM dNTP (deoxynucleotide triphosphate), 0.5 ㎕ 의 25 p㏖/㎕ primers (Forward primer 63F；배열 번호 1, Reverse primer 15R；배열 번호 2), 0.5 units 의 DNA Taq polymerase (Takara Ex Taq hotstart), 1 ㎕ 의 10 ng/㎖ template DNA 로 하였다. PCR 반응은 94 ℃, 20 초, (94 ℃, 20 초, 55 ℃, 20 초, 72 ℃, 90 초) × 30 cycles, 72 ℃ 3 분으로 하였다. 다이 터미네이터법에 의해 분리주의 16S-rDNA 염기 배열을 결정하였다. 시퀀스 반응용 프라이머는 520R (배열 번호 3) 로 하고, DNA Data Bank of Japan 에 등록되어 있는 균종 배열과의 호몰러지를 비교하여, 98 ％ 이상의 유사성을 갖는 것을 동일종으로 하였다. 사용한 프라이머를 표 4 에 나타낸다. 진정 세균 및 고 세균의 16S-rDNA 에는, 그 양단 혹은 내부에 10 개소 정도 고도로 보존된 영역이 있어, 63F, 15R 및 520R 등의 이들 배열에 기초하여 디자인된 프라이머를 사용함으로써, 세균의 종류에 상관없이 유전자를 증폭하거나, 배열을 해석하거나 할 수 있다.
Figure pct00004
시험예 2 및 3 에서 선발한 241 주에 대해, 16S-rDNA 염기 배열을 사용하여 균종을 동정한 결과, 스트렙토콕쿠스형 세균은 주로 스트렙토콕쿠스·오랄리스 (Streptococcus oralis), 스트렙토콕쿠스·살리바리우스 (Streptococcus salivarius), 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis), 스트렙토콕쿠스·상귀니스 (Streptococcus sanguinis) 등으로 동정되었다. 또, 락토바실러스형 세균 중에서 가장 분리수가 많았던 것은 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 였다.
시험예 5 치면으로의 접착성의 평가
시험예 2 및 3 의 결과에서 선발한 241 주 중에서, 동정 시험의 결과, 안전성에 문제가 있다고 판단된 균주를 제외하고, 이하의 시험에 사용하였다.
시료의 조제 방법 및 하이드록시아퍼타이트 (HA) 로의 접착성 평가는 Gibbons 들의 방법 (Gibbons, R. J., E. C. Moreno, and D. M. Spinell “Model delineating the effect of a salivary pellicle on the adsorption of Streptococcus mitior onto hydroxyapatite.” Infect. Immun. 1976：14：1109-1112) 에 따랐다.
각 분리 균주를 MRS 액체 배지 4 ㎖ 에 접종하고, 24 시간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리 (1,912×g, 10 분간, 4.0 ℃) 하고, PBS 로 2 회 세정하였다. 550 ㎚ 에서의 흡광도가 1.0 이 되도록 PBS 로 희석한 균액을 HA 로의 접착성 시험에 사용하였다.
본 시험에서 사용하는 타액은 하기와 같이 채취하였다. 증류수로 양치질 후, 파라핀 검을 씹어, 그 자극에 의해 분비되는 타액을 원심관에 모았다. 단백 분해 효소를 실활시키기 위해서, 60 ℃ 에서 30 분간 가열한 후, 원심 분리 (10,000×g, 10 분간, 4.0 ℃) 를 실시하여, 상청을 얻었다. 5 명분의 타액을 등량씩 혼합한 후, 필터 멸균 (0.22 ㎛) 하고, 사용할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.
하이드록시아퍼타이트 비즈 (Bio-Rad 40 ㎛) 5 ㎎ 을 PBS 로 세정한 후, 가열 조제한 타액을 4 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 진탕하였다. 진탕 후, PBS 로 2 회 세정한 비즈를 타액 처리 HA (S-HA) 로서 사용하였다. 또, 타액 대신에 PBS 를 첨가하여 동일 조건으로 조제한 비즈를 PBS 처리 HA (P-HA) 로서 사용하였다.
균액 2 ㎖ 를 S-HA 및 P-HA 에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 진탕시켰다. 또, 대조로서 균액만을 동일 조건으로 진탕하였다. 반응 후 10 분간 실온에서 정치하고, 상청 1 ㎖ 를 새로운 튜브에 채취하였다. 미세한 HA 를 용해시키기 위해서 상청에 0.1 M EDTA 를 100 ㎕ 첨가하고, 교반 후 1 시간 실온에서 정치하였다. 그 후, 550 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하고, 하기 식 (1) 에 의해 HA 비즈에 접착된 균의 비율을 접착률 (％) 로서 산출하였다.
Figure pct00005
결과를 표 5 및 6 에 나타낸다. 시험예 2 및 3 에서 선발한 241 주 중, 스트렙토콕쿠스속으로 분류된 균주의 76 ％ 가 S-HA 에 접착하였다. 또, 일반적으로 락트산 간균의 치면으로의 접착성은 낮은 것으로 여겨지고 있지만 (H. J. Busscher. “In vitro Adhesion to Enamel and in vivo Colonization of Tooth Surfaces by Lactobacilli from a Bio-Yoghurt” Caries Res 1999：33：403-404.), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 의 순서로 높은 S-HA 로의 접착성을 나타내었다.
Figure pct00006
Figure pct00007
시험예 6 구강 내 세포로의 접착성 평가
시험예 2 및 3 의 결과에서 선발한 241 주 중에서, 동정 시험의 결과, 안전성에 문제가 있다고 판단된 균주를 제외하고, 이하의 시험에 사용하였다.
1) 세포주의 배양
HO-1-N-1 세포 (JCRB0831：사람 볼 점막 편평 상피암 유래 세포, 이하 「HO」 라고 약기한다) 및 HSC-3 세포 (JCRB0623：사람 혀 편평 상피암 유래 세포, 이하 「HSC」 라고 약기한다) 를 5.0 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하였다. HO 세포에는, 10 ％ 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (GIBCO 사 11885) 를, HSC 배지에는 10 ％ 우태아 혈청을 포함하는 DMEM/F12 배지 (GIBCO 사 11320) 를 사용하였다.
2) 세포로의 접착성 평가
10 ％ 우태아 혈청을 포함하는 배지를 사용하여, 세포를 1.0×105 개/㎖ 가 되도록 현탁하였다. 이 현탁액을, Lab-Tek II 챔버 슬라이드 (Nalge Nunc) 에 1 웰당 200 ㎕ 첨가하고, 48 ∼ 96 시간 배양하였다. 그 후, 슬라이드 글라스 표면에 부착되지 않은 세포를 RPMI1640 으로 세정·제거하였다. MRS 액체 배지에서 하룻밤 배양 후, 생균수를 OD660 = 0.25 로 조정한 분리주를 1 웰당 200 ㎕ 첨가한 후, 37 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 그 후, 세포를 RPMI1640 으로 3 회 세정하고, 세포에 접착되어 있지 않은 균을 제거하였다. 슬라이드 상의 부착물을 그램 염색한 후, 0.16 ㎟ 당 포함되는 세포 상에 접착된 균수를 광학 현미경을 사용하여 측정하였다. 또한, 측정은 임의로 선택한 6 시야에 대해 실시하였다.
결과를 표 7 및 8 에 나타낸다. 락토바실러스속에서는 7 주, 스트렙토콕쿠스속에서는 17 주에, 0.16 ㎟ 에 포함되는 세포에 대해, HO 세포와 HSC 세포의 합계 10 개 이상의 균의 접착이 확인되었다.
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 에는, 모두 단위 면적당 30 개 이상의 강한 접착성이 확인되었다.
Figure pct00008
Figure pct00009
시험예 7 구취 원인균 (치주 병원성 세균) 에 대한 증식 저해 평가
상기 시험예의 결과에서, 표 10 및 11 에 나타내는 균주를 선발하였다. 대상 균주로서, 구취 원인균 또한 치주 병원성 세균인 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis) ATCC 33277, 프레보텔라·인터메디아 (Prevotella intermedia) ATCC 25611, 어그리게이티벡터·액티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans) Y4, 우식원성 세균인 스트렙토콕쿠스·무탄스 (Streptococcus mutans) ATCC 25175, 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) ATCC 33478 을 사용하였다.
분리 균주를 4.0 ㎖ 의 MRS 액체 배지에 1 백금이를 식균하였다. 24 시간 배양 후, 원심 분리 (1,912×g, 10 분간, 4 ℃) 하여 상청을 얻었다. 또한 이 상청을 0.22 ㎛ 의 필터로 여과한 여과액을 시험 시료로 하였다. 각 시료의 항균 활성은 Radial diffusion assay 에 의해 측정하였다. TS 배지 (Tryptic soy broth (Difco) 6.0 ㎎, Tween 20 2.0 ㎕, agarose 100 ㎎, H2O 10 ㎖) 10 ㎖ 에 각 대상 균주의 BHI 배양액 100 ㎕ 를 첨가하여 충분히 교반한 후, 샬레 내에서 굳혔다. 배지가 굳어지면, 직경 2.5 ㎜ 의 구멍을 만들고, 그곳에 시험 시료 5.0 ㎕ 를 첨가하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 배양 후에 TS 배지 (Tryptic soy broth (Difco) 0.6 ㎎, agarose 100 ㎎, H2O 10 ㎖) 를 중층시키고, 37 ℃ 에서 배양하였다. 배양 조건은 표 9 에 기재하였다. 배양 후, 구멍의 외측에 생긴 균이 증식하고 있지 않은 클리어 존 영역 (저지원 직경) 의 직경을 다음 식 (2) 로 계측하였다.
저지원 직경 (㎜) =
시험 시료의 클리어 존의 직경 (㎜) － 구멍의 직경 (㎜) (2)
Figure pct00010
결과를 표 10 및 11 에 나타낸다. 분리 균주 중 락토바실러스속의 배양 상청에, 포르피로모나스·진지발리스에 대한 강한 증식 저해 효과가 확인되었다. 또, 프레보텔라·인터메디아나 어그리게이티벡터·액티노마이세템코미탄스에 대해서도 증식 저해 효과가 확인되었다. 이번 시험에서는, 배양 상청의 pH 를 7.0 으로 조정해도 포르피로모나스·진지발리스에 대한 저해 효과를 나타내는 주가 확인되었으므로, 이들 주는 유기산 이외에도, 과산화수소나 박테리오신 등의 항균 물질을 산생하고 있을 가능성이 높은 것으로 생각되었다. 또, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 에는, 우식원성 세균인 무탄스 연쇄구균 (스트렙토콕쿠스·무탄스 (Streptococcus mutans) 및 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus)) 에 대한 증식 저해 효과가 확인되었다. 배양 상청의 pH 를 7.0 으로 조정하여 시험한 결과, 증식 저해 효과는 확인되지 않았지만, 스트렙토콕쿠스·무탄스 (Streptococcus mutans) 및 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) 는 산을 산생하고, 균 자체는 내산성이기 때문에, pH 의 저하에 의해 증식이 억제될 가능성은 낮은 것으로 생각된다. 따라서, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 는 과산화수소나 박테리오신 등의 항균 물질을 산생하고 있을 가능성이 있는 것으로 생각되었다.
스트렙토콕쿠스속에서도, 15 주의 배양 상청에 구취 원인균 (치주 병원성 세균) 에 대한 증식 저해 효과가 확인되었지만, 효과의 힘은 락토바실러스속의 분리주와 비교하면 약하였다. 이들은, pH 를 7.0 으로 조정해도 포르피로모나스·진지발리스의 증식을 저해하는 것이 가능하였으므로, 락토바실러스속의 분리 균주와 마찬가지로, 과산화수소나 박테리오신 등의 항균 물질을 산생하고 있을 가능성이 생각되었다.
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 에는, 모두 저지원 직경 (직경) 의 합계가 9 ㎜ 이상인 강한 증식 저해 효과가 확인되었다.
Figure pct00011
Figure pct00012
시험예 8 래트 실험적 심내막염 모델을 사용한 감염성 심내막염의 기염성 평가
상기 시험예의 결과에서, 표 12 및 13 에 나타내는 균주를 선발하였다. 양성 대조로서 심내막염 기염균인 락토바실러스·람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) YIT 0227 을 사용하였다.
시험 동물로서 생후 8 주의 Crl：CD (SD) 계 웅성 래트 102 마리 (닛폰 찰스·리버 주식회사) 를 사용하였다.
실험적 심내막염 (비세균성 심내막염) 모델 동물의 작출 (作出) 은 이하와 같이 실시하였다. 마취제로서 케탈라 (염산 케타민 50 ㎎/㎖ 함유) 와 세라크탈 (염산자일라진 20 ㎎/㎖ 함유) 을 18：5 의 비율로 혼합한 후, 2 ㎖/kg 의 투여량으로 복강 내에 투여하였다. 그 후, 마취하에서 경부 피부를 절개하여 오른쪽 경동맥을 노출시키고, 외경 0.61 ㎜ 의 폴리에틸렌 튜브 (나츠메 제작소, SP10) 를 사용한 약 20 ㎝ 의 카테터를 우경동맥으로부터 좌심실로 삽입·유치하였다. 비세균성 혈전성 심내막염 동물을 작출한 다음날에, 1 ㎖ 디스포저블 시린지와 주사 바늘 27 G 를 사용하여 균액을 0.5 ㎖/래트가 되도록 꼬리 정맥 내 투여하였다.
투여 균액은 다음과 같이 조제하였다. 먼저, MRS 배지 4 ㎖ 에 분리주 10 ㎕ 를 식균하고, 37 ℃ 에서 20 시간 배양하였다. 이 배양액 100 ㎕ 를 신선한 MRS 배지 10 ㎖ 에 식균하고, 추가로 37 ℃ 에서 20 시간 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액을 원심 분리 (1,670×g, 10 분간, 4.0 ℃) 하여 상청을 제거하였다. 배지와 등량의 생리 식염수를 첨가하고, 보텍스에 의해 충분히 교반·세정한 후, 재차 원심 분리 (1,670×g, 10 분간, 4.0 ℃) 하여 상청을 제거하였다. 이 세정 조작을 세 번 반복한 후, 규격 균수 (4.0 ∼ 9.0×106 CFU/㎖) 가 되도록 생리 식염수를 첨가하여 희석하고, 투여용 균액으로 하였다.
피험 균주 투여일부터 4 일 후에 채혈한 말초 정맥혈을 생리 식염수로 단계 희석하고, 원액 0.5 ㎖ 및 10-2 희석액 1.0 ㎖ 를 혼석법에 의해 MRS 평판 배지에 플레이팅하였다. 37 ℃ 에서 3 일간 배양 후, 평판 상에 생육한 콜로니를 계수하여, 혈액 1 ㎖ 중의 생균수를 산출하였다. 마찬가지로 우췌를 포함하는 심장의 호모게네이트액을 생리 식염수로 단계 희석하고, 원액, 10-2, 10-4, 10-6 희석액 1.0 ㎖ 를 혼석법에 의해 MRS 평판 배지에 플레이팅하였다. 37 ℃ 에서 3 일간 배양 후, 평판 상에 생육한 콜로니를 계수하여, 생균수를 산출하였다. 또한, 2 매의 플레이트 어느 쪽에도 콜로니를 검출하지 않은 경우에, 어느 쪽 1 매의 플레이트로부터 1 개의 콜로니가 확인된 것으로 가정하여, 1 을 우췌 중량으로 나눈 수치를 검출 한계값으로 하였다.
결과를 표 12 및 13 에 나타낸다. 양성 대조인 YIT 0227 을 투여한 래트에서는, 혈액으로부터 6 예 중 5 예 (1 ∼ 28 CFU/㎖) 에서, 우췌로부터는 전체 검체 (1.4×103 ∼ 1.7×106 CFU/heart) 에서 투여균이 검출되었다. 한편, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) LBS 17-11, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 및 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 을 투여한 래트에서는, 혈액 및 우췌로부터는 투여균이 검출되지 않았다. 따라서, 이들 균주는 래트에서의 심내막염 기염성은 음성이라고 판정되었다.
또, 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 를 투여한 래트에서는, 혈액으로부터는 투여균이 검출되지 않고, 우췌로부터도 1 검체만 균이 검출되는 것에 머물렀으므로, 음성이라고 판정되었다. 그 이외의 균주를 투여한 래트에서는, 전체 개체의 우췌로부터 투여균이 검출되고, 검출균수도 많았으므로 (6.2×104 ∼ 9.4×106 CFU/heart), 어느 주도 양성으로 판정되었다.
Figure pct00013
Figure pct00014
시험예 9 인공 구강 장치를 사용한 우식성 평가
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321, 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) LBS 17-11 및 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) LBS 46-52 를 사용하였다. 또, 양성 대조로서 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) 6715, 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) ATCC 33478 을 사용하였다.
분리 균주를 스톡한 시험관으로부터 신선한 TS 배지 또는 MRS 배지 4 ㎖ 가 들어간 시험관에 3 백금이 식균하여 37 ℃ 에서 16 시간 혐기 배양하였다. 이 배양액 4 ㎖ 를 1 ℓ 의 신선한 TS 또는 MRS 배지에 식균하고, 37 ℃ 에서 16 시간 혐기 배양하였다. 이 배양액을 원심 분리 (4,830×g, 20 분간, 4 ℃) 하여 집균하였다. 이것을 PBS 로 세정한 후, 추가로 원심 분리한 균체를 200 ㎖ 의 PBS 에 현탁하였다. 일부를 샘플링하여 PBS 로 1/10 희석한 후, 그 탁도를 540 ㎚ 로 측정하고, 전체를 OD540 = 0.5 혹은 1.0 이 되도록 PBS 를 사용하여 조정하였다.
이 균액에 의한 소 에나멜질의 경도 변화를 인공 구강 장치에 의해 측정하였다. 구체적으로는, pH 의 시간 경과적 변화를 인공 바이오 필름 하에 설치한 pH 미터에 의해 측정하였다. 또, 소 에나멜질의 경도 변화를 실험 전과 실험 후에 있어서의 치편 (齒片) 의 Vickers 경도의 변화로부터 구하였다. 또한, 각 소 에나멜질 절편을 0.5 N NaOH (2 ㎖) 에 0 ℃ 에서 10 분간 침지하고, 인공 바이오 필름을 유리시킨 후에 원심 분리하고 (4,830×g, 20 분간), 균체와 상청 (비수용성 글루칸 분획) 으로 분획하였다. 균체를 PBS 에 현탁하여 OD540 ㎚ 의 탁도를 측정한 값으로부터 치편 ㎟ 당 균체량을 구하였다. 또, 상청 중의 비수용성 글루칸량을 Phenol 황산법에 의해 측정하였다.
또한, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 에 대해서는, 균체 농도와 반응 시간을 각각 2 배로 한 조건으로 인공 구강 장치에 의한 우식성을 평가하였다.
결과를 도 1 ∼ 4 에 나타낸다. 우식원성 세균인 스트렙토콕쿠스·소브리누스 (Streptococcus sobrinus) 6715 의 경우, 수크로오스 존재하에서 20 시간, 본 균과 접촉시킨 소 에나멜질의 경도는 시험 개시 전과 비교하여 약 60 ∼ 80 ％ 저하되어 있었다 (도 1, 3). 또, 에나멜질로부터는, 비수용성 글루칸과 균체가 회수되었으므로 (도 2), 본 균이 에나멜질 표면에 비수용성 글루칸을 주체로 하는 바이오 필름을 형성하고, 그 중에서 산을 산생함으로써 탈회를 진행시킨 결과, 경도가 저하된 것으로 생각되었다.
한편, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 의 경도의 저하 비율은 어느 주도 5 ％ 미만이었다 (도 1, 3). 또, 어느 균주를 작용시킨 에나멜질로부터도 비수용성 글루칸은 회수되지 않았다 (도 2, 4).
락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 에 대해, 균체 농도와 반응 시간을 각각 2 배로 한 조건으로 인공 구강 장치에 의한 우식성을 조사한 결과를 도 5 에 나타낸다. 에나멜질 경도의 저하 비율은 원래의 조건과 거의 동일한 정도 (4.4 ％ 저하) 였으므로, 본균을 과잉 섭취해도 우식을 유발할 가능성은 낮은 것으로 생각되었다.
소 에나멜질의 경도가 저하되지 않는 원인을 조사하기 위해서, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 의 수크로오스 자화성을 조사하였다. 수크로오스 자화성은, ILS 액체 배지 (BBL Trypticase Peptone (BD) 10 g, Yeast Extract (BD) 5 g, Bacto Tryptose (BD) 3 g, KH2PO4 3g, K2HPO4 3g, (NH4)3C6H5O7 2 g, Lactose 20 g, L-cysteine·HCl 0.2 g, CH3COONa 1 g, Tweeen 80 1 g, Salt solution (MgSO4·7H2O 11.5 g / 100 ㎖, FeSO4·7H2O 0.68 g / 100 ㎖, MnSO4·5H2O 2.4 g / 100 ㎖) 5 ㎖, DW 1000 ㎖) 의 락토오스를 수크로오스로 치환한 배지를 사용하여, 37 ℃, 24 시간 배양하였다. 균의 증식은 OD660 ㎚ 로 측정한 배양액의 흡광도로 나타내었다.
그 결과, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 은 수크로오스를 증식 기질로서 이용할 수 없는 것이 분명해졌다 (도 6). 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 의 표준 균주 (YIT 0192T) 는 수크로오스를 자화할 수 있는 점에서, 이 성질은 주 특이적이라고 생각되었다.
이상의 결과로부터, 금회 시험한 분리 균주의 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 는 우식의 원인이 되지 않는 것으로 생각되었다. 특히 YIT 12321 은 수크로오스를 자화하지 않기 때문에, 보다 유용한 것으로 생각되었다.
이들, YIT 12319, YIT 12320, YIT 12321 및 YIT 12322 는 신규 균주이며, 각각 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터 (주소：이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6) 에, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 로서 기탁되었다.
상기한 시험예 2, 3 및 5 에 있어서 양호한 결과가 얻어진 균주 (VSC 산생능 및 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않고, 치면으로의 접착성을 갖는 균주) 에 대해, 시험예 6 내지 9 의 결과 (일람) 를 표 14 에 나타낸다. 본 발명자들이 구강 내로부터 분리한 약 1600 주의 미생물에 대해 예의 검토한 결과, 본 발명에 관련된 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 유산균은 불과 4 균주가 발견되었을 뿐으로, 그러한 특이적인 성질을 갖는 유산균은 다양한 구강 내 질환 또는 불쾌 증상의 예방 또는 개선을 위한 음식품, 구강용 조성물 등으로서 매우 유용한 것이 확인되었다.
Figure pct00015
시험예 10 사람에서의 구강 내 환경 개선 효과의 검증
구강 내 환경에 대한 본 발명에 관련된 유산균 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 섭취의 효과를 조사하기 위해서, 구취가 있는 피험자 17 명을 대상으로 1 립당 3.3×108 cfu 이상의 생균을 포함하는 시험 식품을 1 일 1 회 3 립, 4 주간 연속 섭취시켰다.
시험 식품 섭취기의 개시일 (0 주) 및 섭취 4 주째에 피험자로부터 자극 타액 (파라핀 검을 5 분간 씹으면서 분비되는 타액) 을 채취하고, 하기의 구강 내 세균 수를 측정하였다.
치주 병원성 세균량 (PCR 인베이더법), 우식원성 세균량 (배양법), 유산균량 (배양법)
또, 임상 파라미터로서, 섭취 개시일, 섭취 4 주에 이하의 각 항목을 측정하였다. 치은염 지수 및 프로빙시의 출혈은 치과 의사가 측정하였다.
평가 항목
1) 치은염 지수 (GI：Lee ＆ Sillness, 1963 변법)
평가 기준
0：임상적으로 정상인 잇몸
1：경도의 염증, 잇몸에 약간 색조 변화가 있는 것으로, 프로브에 의한 잇몸 변연 내연부의 찰과에 의해 출혈이 확인되지 않는다.
2：중등도의 염증, 잇몸에 발적을 수반한 부종과 광택이 있고, 잇몸 변연 내연부의 찰과에 의해 출혈이 확인된다.
3：고도의 염증, 현저한 발적, 부종이 있고, 자연 출혈, 궤양 형성이 있다.
진단 부위
하기 6 치아의 설측, 순측 (脣側)·협측 (頰側), 근심측 (近心側), 원심측 (遠心側) 의 합계 24 치면으로 하였다.
Figure pct00016
평가 방법
하기 식을 이용하여 진단 부위의 총 점수로부터 피험자마다의 평균 치은염 스코어를 산출하였다.
Figure pct00017
2) 프로빙시의 출혈 (BOP)
평가 기준
0：출혈이 확인되지 않는다
1：출혈이 확인된다
진단 부위
하기 6 치아의 설측, 순측·협측, 근심측, 원심측의 합계 24 치면으로 하였다.
Figure pct00018
평가 방법
하기 식을 이용하여 진단 부위의 총 점수로부터 피험자마다의 평균 프로빙시의 출혈 스코어를 산출하였다.
Figure pct00019
사람 시험에 관한 모든 통계 해석에 대해서는, 통계 해석 소프트 (SAS 전 (前) 임상 패키지 Ver. 5.0, SAS Institute Inc.) 를 사용하였다. 각 통계 처리 모두 유의 수준은 5 ％ 로 하였다. 0 주째의 값에 대해, 섭취 4 주째 혹은 8 주째의 값에 대해, 유의차 검정을 실시하고, 시험 기간 중의 변동을 해석하였다.
피험자 17 명의 타액 중의 균수 측정 결과를 표 17 에 나타내었다. 구취 원인 물질을 산생하는 치주 병원성 세균인 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 및, 탄네렐라·포사이시어 (Tannerella forsythia) 의 균수가 당해 유산균 섭취 4 주째에 감소하고 (P = 0.019, 0.006, 0.005), 락트산 간균수가 당해 유산균 섭취 4 주째에 증가하였다 (P = 0.001). 무탄스 연쇄구균은 시험 기간 중에 변화가 확인되지 않았다.
Figure pct00020
즉, 본 발명에 관련된 유산균의 섭취에 의해, 구취 원인 물질을 산생하는 치주 병원성 세균 (포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis), 푸소박테리움·뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) 및, 탄네렐라·포사이시어 (Tannerella forsythia) 등) 의 균수가 감소하는 것이 확인되고, 당해 유산균이 구강 내 질환·구취의 예방 및/또는 치료제로서 매우 유용하다는 것이 확인되었다. 또, 시험 기간 내내 우식의 원인균인 무탄스 연쇄구균의 균수에 변화는 확인되지 않았다. 그 때문에, 본 발명에 관련된 유산균을 섭취함으로써 우식의 리스크가 높아질 가능성은 낮은 것으로 생각되었다.
또한, 프로빙시의 출혈 및 치은염 지수는 당해 유산균 섭취 4 주째에 섭취 개시시에 비해 유의하게 낮은 값을 나타내었다. 평가 항목의 해석 결과를 표 18 에 나타내었다.
Figure pct00021
즉, 본 발명에 관련된 유산균의 섭취에 의해, 치은염 등의 치주병의 임상 파라미터를 개선하는 효과가 확인되고, 당해 유산균이 구강 내 질환·구취의 예방 및/또는 치료제로서 매우 유용한 것이 확인되었다.
시험예 11 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis) 양성 피험자에서의 구취 억제 효과의 검증
구취에 대한 본 발명에 관련된 유산균 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 섭취의 효과를 조사하기 위해서, 치주 병원성 세균의 하나로 구취 원인 물질을 산생하는 포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis) 양성 피험자 7 명을 대상으로 1 립당 3.3×108 cfu 이상의 생균을 포함하는 시험 식품을 1 일 1 회 3 립, 8 주간 연속 섭취시켰을 때의 휘발성 황 화합물 (VSC) 농도를 가스 크로마토그래피로 측정하였다.
포르피로모나스·진지발리스 (Porphyromonas gingivalis) 양성 피험자군의 VSC 농도의 해석 결과를 표 19 에 나타내었다. VSC 농도를 측정한 결과, H2S 에서는, 당해 유산균 섭취 4, 8 주째에 섭취 개시시에 비해 유의하게 낮은 값을 나타내었다. 또, Total VSC 에서는 당해 유산균 섭취 8 주째에서 섭취 개시시에 비해 유의하게 낮은 값을 나타내었다.
Figure pct00022
즉, 본 발명에 관련된 유산균의 섭취에 의해, 실제로 구취 원인 물질이 저감되는 효과가 확인되고, 당해 유산균이 구강 내 질환·구취의 예방 및/또는 치료제로서 매우 유용한 것이 확인되었다.
시험예 12 프라이머의 설계 및 합성
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 와 다른 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 17 주의 게놈 DNA 를 RAPD 법에 의해 비교하고, 목적으로 하는 균주 (락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319) 에 특이적인 DNA 배열을 3 부위 알아내었다. 그리고, 이들 염기 배열을 해독하여, 표 20 에 나타내는 프라이머의 후보군을 선발하고, 이들을 적절히 조합함으로써, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 에 특이적인 프라이머 페어를 35 종 설계하였다.
Figure pct00023
시험예 13 동종 (락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 에 대해 특이적인 프라이머 페어의 선발
락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 및 다른 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 20 주의 게놈 DNA 에 대해, 설계한 35 종의 프라이머 페어를 사용한 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 표 21 에 나타내는 4 종의 프라이머 페어에서는, PCR 에 의한 DNA 의 증폭 산물이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 만 확인되었다 (표 21, 도 7).
여기서, Lc(X)2a 는 배열 번호 4, Lc(X)2b 는 배열 번호 5, Lc(X)2c 는 배열 번호 6, Lc(X)2d 는 배열 번호 7, Lc(X)7a 는 배열 번호 8 을 나타낸다.
Figure pct00024
시험예 14 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 이외의 27 속 143 균주에 대해 특이적인 프라이머 페어의 선발
표 22 에 나타내는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 및 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 이외의 Lactobacillus 속 65 균주, Lactobacillus 속에 근연인 7 균주, 구강의 우선균 22 속 71 균주 (합계 27 속 143 균주) 의 게놈 DNA 에 대해, 표 21 에 나타내는 4 종의 프라이머 페어를 사용한 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 모든 프라이머 페어에서 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 만의 DNA 증폭 산물이 확인되었다.
시험예 13 의 결과와 합하여, 27 속 163 균주에 대해 반응하지 않고, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 만 반응하는 4 종의 프라이머 페어가 얻어졌다.
Figure pct00025
시험예 15 태블릿의 제조
표 23 에 나타내는 성분 (1 립당) 을 혼화하여, 그 혼합물을 타정하였다.
Figure pct00026
얻어진 태블릿은 안정적인 것이며, 복용하기 쉬운 것이었다.
Figure pct00027
얻어진 태블릿은 안정적인 것이며, 복용하기 쉬운 것이었다.
독립행정법인 제품평가 기술기반기구 특허생물 기탁센터 FERMBP-11500 20110428 독립행정법인 제품평가 기술기반기구 특허생물 기탁센터 FERMBP-11501 20110428 독립행정법인 제품평가 기술기반기구 특허생물 기탁센터 FERMBP-11502 20110428 독립행정법인 제품평가 기술기반기구 특허생물 기탁센터 FERMBP-11503 20110428
SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> Prophylactic or therapeutic agent for oral diseases <130> YK0069 <150> JP 2011-171891 <151> 2011-08-05 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 1 gcytaayaca tgcaagtmg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 2 aaggaggtga tccarccgca 20 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 3 accgcggctg ctggc 15 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 4 gcacatcgtt atagtgaacg gcgc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 5 cacatcgtta tagtgaacgg cgct 24 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 6 acggttcaat acttctaaca catccgc 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 7 acacatccgc ttgatcttgt tgttc 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 8 gtagaaacca agttttaagg tctatg 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 9 ttggttgggt taccgtcaac 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 10 ctttcactag tggagtgtat ttac 24 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 11 gtctttcact agtggagtgt atttac 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 12 ctttcactag tggagtgtat ttactc 26 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 13 gttgacggta acccaaccaa 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 14 gtaaatacac tccactagtg aaag 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 15 gtaaatacac tccactagtg aaagac 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 16 gagtaaatac actccactag tgaaag 26 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence for amplifying a chromosome DNA region <400> 17 ttaaggtcta tggaaacaac tccaa 25

Claims (27)

  1. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 유효 성분으로 하는 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  2. 제 1 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    구강 내 질환이 치주병인 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제.
  4. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균을 유효 성분으로 하는 구취의 예방 및/또는 개선제.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  5. 제 4 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 구취의 예방 또는 개선제.
  6. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 라고 명명되고, FERM BP-11500 으로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 이라고 명명되고, FERM BP-11501 로서 기탁된 유산균, 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 이라고 명명되고, FERM BP-11502 로서 기탁된 유산균, 또는 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 라고 명명되고, FERM BP-11503 으로서 기탁된 유산균.
  7. 제 6 항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품.
  8. 제 7 항에 있어서,
    발효 제품인 음식품.
  9. 제 6 항에 기재된 유산균을 함유하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
  10. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의, 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료제 제조를 위한 사용.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  11. 제 10 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 사용.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    구강 내 질환이 치주병인 사용.
  13. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의, 구취의 예방 및/또는 개선제 제조를 위한 사용.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  14. 제 13 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 사용.
  15. 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  16. 제 15 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 유산균.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    구강 내 질환이 치주병인 유산균.
  18. 구취의 예방 및/또는 개선을 위한, 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  19. 제 17 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 유산균.
  20. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 구강 내 질환의 예방 및/또는 치료 방법.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  21. 제 20 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    구강 내 질환이 치주병인 방법.
  23. 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) 에서 선택되고, 또한 하기 (1) ∼ (6) 의 모든 성질을 갖는 1 종 또는 2 종 이상의 유산균의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 구취의 예방 및/또는 개선 방법.
    (1) 휘발성 황 화합물 (VSC) 산생능을 갖지 않는다
    (2) 비수용성 글루칸 산생능을 갖지 않는다
    (3) 치면 및/또는 구강 내 세포로의 접착성을 갖는다
    (4) 구취 원인균 및/또는 치주 병원성 세균에 대한 증식 저해 작용을 갖는다
    (5) 감염성 심내막염의 기염성을 갖지 않는다
    (6) 우식성을 갖지 않는다
  24. 제 23 항에 있어서,
    유산균이 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500), 락토바실러스·퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) YIT 12320 (FERM BP-11501), 락토바실러스·가세리 (Lactobacillus gasseri) YIT 12321 (FERM BP-11502) 및 스트렙토콕쿠스·미티스 (Streptococcus mitis) YIT 12322 (FERM BP-11503) 에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 방법.
  25. 배열 번호 4 ∼ 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 특이적인 프라이머 또는 프로브.
  26. 배열 번호 4 및 8, 배열 번호 5 및 8, 배열 번호 6 및 8, 배열 번호 7 및 8 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 염기 배열에 상보적인 배열로 이루어지는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 에 특이적인 프라이머 페어.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 기재된 프라이머, 프라이머 페어 또는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스·크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) YIT 12319 (FERM BP-11500) 의 검출 방법.
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