KR102138832B1 - 락토바실러스 크리스파투스 kbl693 균주 및 그 용도 - Google Patents

락토바실러스 크리스파투스 kbl693 균주 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주는 세포의 알레르기 반응을 약화시키고, 아토피 피부염에 대한 증상을 현저히 개선하며, 이와 더불어 항염증 효과 및 항진균 효과를 발휘하는바, 하나의 균주로 아토피 피부염과 그 밖의 알레르기 질환 개선, 염증성 질환 개선 및 자가면역성 질환 개선을 위한 목적을 모두 달성할 수 있어 프로바이오틱 소재로 유용하게 활용될 수 있을 뿐 아니라, 상기 균주의 항진균 활성에 기초할 때, 진균에 의해 발생하는 다양한 피부 질환에 대한 피부 외용제, 기타 민감성 피부를 개선하기 위한 화장료 조성물 및 기능성 패치로도 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 및 그 용도{Lactobacillus Crispatus KBL693 and Use Thereof}
본 발명은 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및 면역 조절로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효과를 갖는 건강기능식품용 조성물, 항진균 조성물, 및 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 질환의 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물 및 상기 미생물이 생산하는 생산물을 말한다. 아울러 프로바이오틱스는 건조세포나 발효산물 형태로 사람이나 동물에 공급되어, 장내 균총을 개선하는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 프로바이오틱스가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성의 특성을 가지며, 장으로 가는 동안 살아 남아야 한다. 더 나아가 전달 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지하고, 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야 하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한, 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야 한다.
이러한 프로바이오틱스로는 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성능력이 우수한 바실러스 종(Bacillus sp.), 젖산을 생성하는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 가축의 분변에 남아있는 악취 유발물질(암모니아, 황화수소, 아민류 등)을 대사과정에 이용하여 악취유발을 막는 광합성 박테리아(Photosynthetic bacteria) 등을 그 예로 들 수 있으며, 최근 프로바이오틱스는 장 건강 개선을 비롯한 다양한 건강 기능 개선 효과가 보고되면서 기존 화합물에 기초한 치료제를 대체할 수 있는 주요한 치료 물질로 각광받고 있다.
한편, 알레르기(allergy)란 이물질(항원, allergen)에 대한 특이하고 변형된 반응을 나타내는 생화학적 현상이며, 이때 이물질이 증상을 일으키게 되면 이를 알레르겐(Allergen)이라 하고, 그 결과 생긴 질환을 알레르기 질환이라고 한다. 알레르기(Allergy)는 발생원인인 항원 항체 반응의 결과로 나타나는 생체의 병적 과정이며, 일반적으로 반응을 일으키는데 필요한 시간 및 보체 관여의 유형으로부터 크게 4종류로 분류하고 있다. 이 중 제1형은 아나필락틱(anaphylactic;즉시형) 형태로 표적기관이 주로 소화장기, 피부 및 폐장으로 일반적인 증상은 위장관 알러지, 담마진, 위축성 피부염, 알러지성 비염 및 기관지성 천식 등이 있다. 제1형의 병리기전은 항원이 비만세포와 호염기구의 표면에 부착되어 있는 IgE 항체에 접촉됨으로써 표적세포를 활성화시켜 히스타민, 루코트리엔, PAF 등의 화학매체를 분비하여 혈관과 평활근을 수축시킨다고 알려져 있는데 이는 주로 제4형(지연형)과 복합되는 경우가 많다. 즉, 이 아나필락시스와 알레르기 반응은 비만 세포 등에서 일어나는 다양한 변화에 기인된다. 탈과립을 유도하는 비만세포의 활성화는 Fc 수용제에 대한 항원, 안티(anti)-IgE, 렉틴(lectin) 등의 결합, 아나필라톡신(anaphylatoxin)등의 자극, 칼슘이오노포어(calcium ionopore), compound 48/80, 코데인(codeine) 등 합성피질 자극 호르몬과 같은 약물에 의해 야기된다.
비만세포 및 혈중 호염구는 여러 가지 알레르기 질환 즉, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 천식, 음식 알레르기 및 아나필락틱 쇼크 등을 유발하는 주요체내 세포로 알려져 있다. 이들 세포는 세포 표면에 알레르기를 유발하는 항체인 IgE에 대한 수용체(FcRI)를 가지고 있고, 그것은 알레르기를 유발하는 물질(항원, allergen)에 의해 자극을 받아 자신이 가지고 있는 다양한 알레르기를 유발시키는 물질을 세포 바깥으로 분비한다(Kim K et al, Eur J Pharmacol, 581:191-203, 2008).
알레르기 질환 중, 아토피 피부염(Atopic Dermatitis)은 잘 알려진 바와 같이 신생아 또는 아동에게 발병하며 성인이 될 때까지 지속될 수도 있는 만성 재발성 피부 질환이다. 아토피 피부염은 천식이나 알레르기성 비염과 같이 IL-4 및 IL-5를 생산하는 T 임파구의 국소 침윤과 연관된 염증성 피부 질환으로, IL-4는 잘 알려진 바와 같이, T 헬퍼2(Th2) 표현형의 발달을 제어하며 그 결과 면역글로불린(Ig)의 과생산 및 호산구증가증을 야기하며, 혈청 IgE 수준이 증가한다. 식품 및 흡입성 알레르겐에 대한 피부 테스트가 양성인 대상자의 80-90%는 아토피 피부염에 걸린 것으로 입증되었다.
알레르기 질환 및 아토피 피부염을 치료 또는 예방하기 위한 다양한 치료법이 대두되고 있으나, 아직까지 효과적인 치료 방법이 존재하지는 않는다. 일부 약물 기반 치료법이 알려져 있으나, 치료를 위한 약물의 단기간 복용에도 내성을 보이고, 장기 복용시 상당한 부작용을 야기할 수 있기 때문에, 최근 약물에 대한 알레르기 질환 및 아토피 치료를 기피하고 있으며, 현재로서는 절대적이고도 확실한 효능을 갖는 치료법이 없이 알레르기 기타 피부 가려움이나 피부 발적과 같은 자극적인 증상들을 호전시키지 못하는 경우가 많다.
이에 본 발명자들은, 종래 만족할 만한 치료법이 없는 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환의 약물 기반 치료를 대체할 수 있는 방법으로 프로바이오틱스 연구에 매진하였고, 그 결과, 신규한 락토바실러스 크리스파투스 균주가 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환에 대한 우수한 치료 효과를 보임을 확인하였고, 이와 더불어 상기 균주가 항염증, 면역 조절 및 항진균 활성에서도 우수한 효과를 발휘함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및 면역 조절에 우수한 효과를 보이는 신규한 균주 및 이의 다양한 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13519BP인 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 식품용 또는 식품 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 동물사료용 또는 동물사료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 항진균 조성물, 예컨대, 비듬방지용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 미용용 패치 또는 의료용 패치를 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주는 세포의 알레르기 반응을 약화시키고, 아토피 피부염에 대한 증상을 현저히 개선하며, 이와 더불어 항염증 효과, 면역 조절 효과 및 항진균 효과를 발휘하는바, 하나의 균주로 알레르기 질환 개선, 염증성 또는 자가면역성 질환 개선을 위한 목적을 모두 달성할 수 있어 프로바이오틱 소재로 유용하게 활용될 수 있을 뿐 아니라, 상기 균주의 항진균 활성에 기초할 때, 진균에 의해 발생하는 다양한 피부 질환에 대한 피부 외용제, 기타 민감성 피부를 개선하기 위한 화장료 조성물 및 기능성 패치로도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 RBL 2H3 세포주에 항원/항체 반응으로 히스타민 생성을 유도한 후, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 비롯한 다양한 락토바실러스 균주 및 항히스타민제인 케토티펜을 처리에 따른 히스타민 분비 저해 효과를 비교한 결과이다.
도 2는 EL4 세포주에 알레르기 반응을 유도한 후, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 비롯한 다양한 락토바실러스 균주에 의한 IL-4 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 EL4 세포주에 알레르기 반응을 유도한 후, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 비롯한 다양한 락토바실러스 균주에 의한 IL-5 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 U266B1 세포주에 알레르기 반응을 유도한 후, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 비롯한 다양한 락토바실러스 크리스파투스 균주의 IgE 분비 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포주에 염증반응을 유도한 후, 다양한 락토바실러스 균주를 처리한 경우, KBL693 균주의 처리에 의한 항염증성 사이토카인인 IL-10의 현저한 분비량 증가 효과를 관찰한 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포주에 염증반응을 유도한 후, 다양한 락토바실러스 균주를 처리한 경우, KBL693 균주의 처리에 의한 현저한 면역 조절 및 항염 효과를 IL-10/TNF-α 수치로 확인한 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포주에 염증반응을 유도한 후, 다양한 락토바실러스 균주를 처리한 경우, KBL693 균주의 처리에 의한 현저한 면역 조절 및 항염 효과를 IL-10/IL-6 수치로 확인한 결과이다.
도 8은 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 항진균 활성을 Spot Assay로 확인한 결과이다.
도 9는 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 경구 투여에 따른 피부염 스코어 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 경구 투여에 따른 가려움 완화 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 경구 투여에 따른 귀 두께 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 경구 투여에 따른 피부 두께 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 13(A)에는 난백알부민 유도 천식 마우스 모델을 사용한 실험 계획을 도시하였으며, 도 13(B)은 정상 대조군(Control-PBS), 천식 유도 대조군(OVA-PBS) 및 실험군(OVA-LC206)에서 각각 채취한 폐조직을 H&E 염색 후 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14는 정상 대조군(Control-PBS), 천식 유도 대조군(OVA-PBS) 및 실험군(OVA-KBL693)에서 각각 채취한 폐조직에서 총 IL-5 및 총 IL-13 발현량을 측정한 결과이다.
도 15는 집먼지 진드기 유도 천식 마우스 모델에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 투여에 의한 기도저항성 감소를 확인한 결과이다.
도 16은 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 투여에 의한 호산구, IL-5+ CD4 T 세포 및 IL-13+ CD4 T 세포의 감소 효과를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인간 유래 미생물의 항알레르기 효과를 확인하여, 알레르기 억제 효과가 탁월한 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주를 선별하였는데, 상기 균주의 16S rDNA를 분석한 결과, 상기 균주가 종래 공지된 바 없는 신규한 균주임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 신규한 프로바이오틱인 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주에 관한 것으로, 상기 균주는 하기 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
<서열번호 1> 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주의 16s rDNA 서열
CGCGGGGTGGCGCGAGCTATAATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATTTGTAGAGATACAAAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGAAGGAGCCGTCTAAGTAGACAATGTGCA
이에, 본 발명에서는 상기 균주에 대한 효능 실험을 진행하였고, 그 결과 상기 균주는 아토피 피부염 증상을 비롯한 알레르기 억제 효과가 탁월할 뿐 아니라, 면역 조절 효과를 나타내고, 염증 반응도 개선하며, 항진균 활성도 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 상기 균주가 생균 상태뿐만 아니라, 저온 살균 또는 고온 살균된 상태로도 상기 효과를 발휘함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 락토바실러스 크리스파투스 KBL693(기탁번호 KCTC 13519BP) 균주, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 식품용 조성물 또는 식품 첨가용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및 면역 조절로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효과를 갖는 건강기능식품용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 식품용 또는 식품 첨가용 조성물은 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및/또는 면역 조절과 그 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료로 용이하게 활용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 식품용 조성물이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 기능성 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 기능성 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및/또는 면역 조절과 상기 증상의 예방을 위한 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 식품용 또는 식품 첨가용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 100중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1중량% 내지 99중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 mL를 기준으로 0.001g 내지 10g, 바람직하게는 0.01g 내지 1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품용 조성물은 상기 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 독립적으로 또는 허용 가능한 담체에 첨가하거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 제조될 수 있다. 즉, 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품을 제조함에 있어서, 본 발명의 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이며, 특별히 제한되지 않는다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeast), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실린(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속에 속하는 세균 등이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)등을 들 수 있다. 바람직하게는, 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 항 알레르기, 항염증 및/또는 면역 조절 효과가 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명의 식품용 조성물에 추가로 포함함으로써 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물에 사용될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 상기 균주를 함유하는 동물 사료용 첨가제 또는 이를 함유하는 동물사료의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 예컨대 단백질 분해효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주, 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 상기 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주 이외에 하나 이상의 효소제제를 더 포함할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱 애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 α-1,4-글리코시드 결합(glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라제(xylase), 말토스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 동물 사료용 첨가제로 사용함에 있어서, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 가공과정은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로, 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하다. 압출성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 항진균 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur), 말라세지아 글로보사(Malassezia globosa) 및 말라세지아 레스트릭타(Malassezia restricta)로 구성된 군으로부터 선택된 하나에 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 조성물은, 지루성 피부염 또는 비듬의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있으며, 상기 지루성 피부염은 지루성 두피염일 수 있다.
또한 상기 조성물은, 피부 진균감염으로 인한 두드러기, 발진, 부스럼, 완진, 또는 무좀의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있다.
상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물은 총 중량을 기준으로, 0.1중량% ~ 50중량%로 포함될 수 있다.
상기 항진균성 조성물은, 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 건강식품 조성물일 수 있으며, 피부 외용제일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01~5 중량%, 구체적으로 0.01~3 중량%일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 본 발명의 항진균성 조성물은 피부 외용제 조성물, 예컨대, 크림, 연고, 샴푸, 트리트먼트일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 생균의 균체, 건조 균주의 형태, 균주의 배양물, 균주의 파쇄물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 담체 혹은 매체와 조합될 수 있는 조성물로 제공될 수 있다. 이용되는 담체 혹은 매체는 용매, 분산제, 코팅, 흡수 촉진제, 제어된 방출제(즉, 서방제), 및 1종 이상의 불활성 부형제(전분, 폴리올, 과립제, 극미세 셀룰로스(microfine cellulose), 미세결정형 셀룰로스(예컨대, 셀피어, 셀피어 비즈(Celphere beads), 희석제, 윤활제, 결착제(binder), 붕해제 등을 포함함) 등을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 개시된 조성물의 정제 제형은 표준 수성 혹은 비수성 수법에 의해 코팅될 수도 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체로서 이용하기 위한 부형제 그리고 상기 추가의 성분의 예로는, 결착제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 항미생물제 및 코팅제를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 연고, 크림, 페이스트제, 외용 액제, 글리세로젤라틴(glycerogelatins), 찰제(liniments), 외용산제, 에어로졸 및 경고제로 이루어진 군으로부터 선택된 제형을 포함하는 외용제로도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알레르기 질환은 IL-4 또는 IL-5의 발현과 연관된 알레르기 질환을 가리키며, 습진, 알레르기성 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 두드러기, 아나필락시스(anaphylaxis) 등을 포함한다. 바람직하게는, 유아 습진, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염 및 음식 알레르기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역성 질환 또는 면역 조절에 의해 개선될 수 있는 증상은 항염증 및 면역 조절 사이토카인인 IL-10의 발현 또는 분비를 증진시킴으로서 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 질환으로서, 류마티스성 관절염, 류마티스성 열, 루프스, 전신성 경피증, 아토피 피부염, 건선, 건선 관절염, 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 중증 근무력증, 피부근염, 다발성근염, 다발성 경화증, 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염, 하시모토 갑상선염, 측두동맥염, 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 천포창, 아프타구내염, 자가면역 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병, 크론병, 베체트병, 부종, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 만성 부비동염, 인후염, 편도염, 기관지염, 폐렴, 위궤양, 위염, 대장염, 통풍, 습진, 여드름, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 강직성 척수염, 섬유근통(fibromyalgia), 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 '치료하는'이란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는' 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 질환의 확산을 예방함,
(3) 질환을 경감시킴,
(4) 질환의 재발을 예방함, 및
(5) 질환의 증상을 완화함(palliating).
본 발명에 따른 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유효량(또는, 유효한 양)"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위 내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도로 적은 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 약제학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 예정된 양을 함유한다. 성인 환자의 경구 투여용 투여 단위는 본 발명의 미생물 0.001 g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 일회에 0.001 내지 10g, 바람직하게는 0.01 내지 5 g이다. 본 발명의 미생물의 약학적 유효량은 0.01 내지 10 g/1일이다. 그러나, 투여량은 환자의 질환의 심각도 및 함께 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 횟수로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 치료용 조성물은 해당 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl 용액과 같은 인공 위즙을 36℃ 내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8의 KH2PO4 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.
본 발명의 장용 피복은 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우가 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365~373; H.Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ~ 742, 및 766 ~ 778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689 ~ 1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.
본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, 다이클로로메탄(CH2Cl2)과 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3 (코팅 재료 대 연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.
본 발명은 또 다른 관점에서 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 상기 균주 또는 조성물의 용도 및 상기 질환 치료제의 제조를 위한 상기 균주 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 용어 '예방'은 질병을 축소시키는 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)와 관련된 것이다.
본 발명에서, 용어 '치료'는 질병의 증상을 개선, 치유 또는 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키기 위해 질병에 걸린 피험자를 돌보는 것과 관련된 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 약학적 유효량의 상기 균주 또는 조성물을 아토피 피부염을 비롯한 알레르기 질환, 및/또는 염증성 또는 자가면역성 질환의 예방 또는 치료나 알레르기 반응, 염증 반응 또는 자가면역 반응의 개선이 요구되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 질환의 예방 또는 치료방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 인간을 포함한 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 동물일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 유효량 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 피부 알레르기, 피부 두드러기, 아토피 피부염, 건선, 진균에 의한 감염 및 습진으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 민감성 피부를 개선하는 기능성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 그 기능이 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어, '화장료 조성물'은 상기 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예로 상기 화장료 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 기능성 패치에 관한 것으로, 상기 기능성 패치는 미용용 또는 의료용일 수 있다.
상기 패치는 피부 알레르기, 피부 두드러기, 아토피 피부염, 건선, 진균에 의한 감염 및 습진으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 민감성 피부를 개선하는 기능성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 그 기능이 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 패치는 전형적으로 전달하고자 하는 물질을 함유하는 소형의 접착 붕대로, 이들 붕대는 다양한 형태를 취할 수 있다. 가장 단순한 형태는 지지체 위에 위치시킨 전달하고자 하는 물질을 함유하는 저장소를 포함하는 접착성의 단일체이다. 저장소는 전형적으로는 미용학 또는 제약적으로 허용되는 감압성의 접착제로부터 형성되지만, 일부 경우에는 피부 접촉 표면에 적합한 접착제 박층이 제공된 비접착성 재료로부터 형성될 수도 있다. 전달하고자 하는 물질이 이들 패치로부터 패치를 부착한 객체에 투여되는 속도는 전달하고자 하는 물질에 대한 피부의 투과성이 보통의 사람 및 피부 위치에 따라 달라지기 때문에 변화될 수 있으며, 이는 당업자가 용이하게 선택하여 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. KBL693의 호염구에서 히스타민 분비 억제에 따른 알레르기 반응 완화 및 치료 효과
알레르기 반응에서 히스타민은 조직에서 발현되어 염증반응을 일으키고, 히스타민 분비를 억제하면 히스타민에 의한 반응을 차단하여 알레르기 증상이 완화된다고 보고되어 있다. 본 발명에서는 히스타민 분비를 억제하여 알레르기 반응 완화 및 치료 효과를 나타내는 프로바이오틱 균주를 선별하고자 하였다. 이를 위하여, 인간의 질에서 유래한 총 8종의 락토바실러스 균주의 히스타민 분비 억제능을 평가하였다. 히스타민 분비 억제능은 RBL-2H3 세포주를 배양하여 탈과립(degranulation)을 유도한 후 히스타민과 함께 분비되는 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 발현을 기질과의 발색반응으로 측정하여 확인하였다.
1-1. RBL-2H3 세포주의 배양
RBL-2H3(ATCC NO. CRL-2256) 세포는 37℃, 5% CO2의 조건하에 10% FBS(Fetal bovine serum), penicillin(100 μg/mL), streptomycin(100 μg/mL)을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하며 3일에 한번씩 계대 하였다. RBL-2H3 세포는 6 웰 플레이트에 1 × 106 cells/well의 농도로 분주하여 3시간 동안 배양한 뒤 IgE(0.5 μg/mL)를 처리하여 16 - 20시간 배양하였다.
1-2. 균주의 배양 및 배양액의 준비
사용된 락토바실러스 크리스파투스 균주들은 0.5% 시스테인을 첨가한 MRS 배지에서 배양하였고, 18시간 간격으로 총 2회의 계대배양(subculture)을 통해 활성화시킨 뒤 실험에 사용하였다. 수득한 배양액을 15,000 × g, 3min 조건에서 원심분리하여 상층액을 수거하였다.
1-3. 균주 처리 후 탈과립 유도
6 웰 플레이트에 미리 분주해 둔 RBL-2H3 세포의 배지를 제거한 뒤, 1 mL의 시라가니안 버퍼(Siraganian buffer, pH7.2)로 2회 세척하였다. 이후 미리 준비한 균 배양액 혹은 양성 대조군인 케토티펜(ketotifen, 20 μug/mL)을 각 웰 당 120 μL 처리하고, 37 ℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 20분 동안 배양하여 준 뒤, 항원(DNP-HAS, 1 μg/mL)를 60 μL 처리하여 항원-항체 반응에 따른 탈과립을 유도하였다. 음성 대조군으로는 시라가니안 버퍼를 120 μL 처리한 후 탈과립을 유도하였다. 반응은 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 20분 동안 진행시킨 뒤 상층액을 수거하였다.
1-4. 발색반응 확인
베타-헥소사미니다아제의 활성을 확인하기 위하여, 96 웰 플레이트에 실시예 1-3.에서 수거된 상층액을 25 μL씩 각 웰에 옮겨 담은 다음, 각각 기질(p-nitrophenyl N-acetyl-D-glucosaminidase)을 25 μL씩 넣고 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 90분간 반응시켰다. 그 후 반응 중지 용액 (Na2CO3/NaHCO3)을 200 μL 넣어 반응을 종료한 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군과 비교하여 각종 락토바실러스 크리스파투스를 처리하였을 때의 흡광도 값을 백분율로 환산하여 탈과립 저해 정도로 나타내었다.
그 결과, 도 1 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, KBL693 균주를 포함한 10종의 락토바실러스 크리스파투스 균주는 음성 대조군에 비해 유의하게 낮은 베타-헥소사미니다아제 분비량을 나타내었고, 그 중 9종은 양성 대조군인 시판 항히스타민제인 케토티펜(ketotifen)보다도 낮은 베타-헥소사미니다아제 분비량을 보였다. 이로써, KBL693을 비롯한 많은 락토바실러스 크리스파투스 균주는 우수한 탈과립 방지 활성을 나타내어 히스타민의 과다 분비에 따른 알레르기 증상을 효과적으로 완화할 수 있음을 알 수 있었다.
Species 처리균주 또는 처리약물 β-hexosaminidase
(fold change)
- (Negative control) Siraganian buffer 1.0
- (Positive control) Ketotifen 0.2569
Lactobaciilus crispatus KBL693 0.2140
Lactobaciilus crispatus KBL694 0.2063
Lactobaciilus crispatus KBL692 0.1904
Lactobaciilus crispatus KBL702 0.2065
Lactobaciilus crispatus KBL706 0.1943
Lactobaciilus crispatus KBL707 0.2008
Lactobaciilus crispatus KBL709 0.2128
Lactobaciilus crispatus KBL696 0.2331
Lactobaciilus crispatus KBL708 0.2464
Lactobaciilus crispatus SNUV272-1 0.3632
Lactobaciilus fermentum SNUV417 0.9284
Lactobaciilus jensenii SNUV221 0.7088
Lactobaciilus vaginalis SNUV351 1.0336
실시예 2. KBL693의 T 세포에서 Th2 type 사이토카인 억제에 따른 알레르기 반응 완화 및 치료 효과
IL-4, IL-5 등의 Type-2 helper T cell(Th2) 관련 사이토카인은 Th2 관련 면역 반응을 증가시키고 IgE의 생산을 증가시킴으로써 만성 알레르기 반응에 기여한다고 보고되어 있다 (Passante E, Inflamm. Res. 2009). 본 발명에서는 상기 실시예 1에서 히스타민 분비 억제에 좋은 효과를 보이는 락토바실러스 크리스파투스 균주 간의 만성 알레르기 반응 억제 효과를 추가로 비교하고자 하였다. 이를 위하여, 마우스 T 세포주인 EL4 세포주를 이용하여 IL-4 및 IL-5의 분비 억제 효과를 하기와 같이 실험하였다.
2-1. EL-4 세포주의 배양
EL4(ATCC NO. TIB-39) 세포는 37℃, 5% CO2의 조건하에 10% FBS, penicillin(100 μg/mL), streptomycin(100 μg/mL)을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하며 3일에 한번씩 계대 하였다. EL4 세포는 24 웰 플레이트에 4 x 105 cells/well의 농도로 분주하여 16~20시간 동안 배양한 뒤 알레르기 반응을 유도하고 균주를 처리하였다.
2-2. 균주의 배양 및 회수
사용된 KBL693을 포함하여 총 9종의 락토바실러스 크리스파투스 균주(KBL693, KBL709, KBL702, KBL696, KBL708, KBL707, KBL692, KBL694, KBL706)들은 0.5% 시스테인을 첨가한 MRS 배지에서 배양하였고, 18시간 간격으로 총 2회의 계대배양(subculture)을 통해 활성화시킨 뒤 실험에 사용하였다. 수득한 배양액을 15,000 × g, 3min 조건에서 원심분리 한 뒤, 그 침전물을 PBS 버퍼로 세척하였다. LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit, for flow cytometry (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 SYTO9과 PI로 균주를 15분 동안 염색하였다. 그 후 내장된 비드(bead)를 넣어주어 유세포분석기(Flow cytometry)로 염색된 생균수를 산출하였다.
2-3. 알레르기 반응 유도 후 균주 처리 및 IL-4, IL-5 분비량 측정
24 웰 플레이트에 미리 분주해 둔 EL4 세포에 알레르기 반응을 유도하기 위하여 PMA(20 ng/mL)와 ionomycin(1 μg/mL)를 각 웰 당 100 μL 처리하였다. 이후 미리 준비한 균주를 세포:균주가 1:10의 비율이 되도록 300 μL씩 처리하였다. 37 ℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 준 뒤, 상층액을 수거하고 mouse IL-4 ELISA set (Cat NO. 555232, BD OptEIATM)과 mouse IL-5 ELISA set (Cat NO. 555236, BD OptEIATM)를 이용하여 IL-4 및 IL-5의 분비량을 제조사 방식에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 2 및 3에서와 같이 락토바실러스 크리스파투스 균주에서는 전반적으로 IL-4 및 IL-5 분비를 억제하는 효과를 나타내었는데, 특히 KBL693에서 가장 낮은 IL-4 분비를 확인하였고, 두번째로 낮은 IL-5 분비를 확인할 수 있었다. 따라서 KBL693은 알레르기 반응을 매개하는 Th2 type 사이토카인 분비 억제를 통한 알레르기를 치료 및 예방 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3. KBL693의 IgE 억제에 따른 알레르기 반응 완화 및 치료 효과
IgE (Immunoglobulin E)는 면역글로불린의 한 종류로서 알레르기 질환의 발생에 관여한다고 알려져 있다. 일반적으로 알레르기 질환을 진단하기 위해서 가장 우선적인 방법의 하나로 혈청 내 총 IgE를 측정하는바, 본 발명에서는 인간 B 세포주인 U266B1 세포주를 이용하여 KBL693에 의한 IgE 분비 억제 효과를 확인하고자 하였다.
3-1. U266B1 세포주의 배양
U266B1(ATCC NO. TIB-196) 세포는 37℃, 5% CO2의 조건하에 10% FBS, penicillin(100 μg/mL), streptomycin(100 μg/mL)을 첨가한 RPMI-1640 배지에서 배양하며 3일에 한번씩 계대 하였다. U266B1 세포는 24 웰 플레이트에 1 x 105 cells/well의 농도로 분주하여 16~20시간 동안 배양한 뒤 염증반응을 유도하고 균주를 처리하였다.
3-2. 균주의 배양 및 회수
본 실험에 사용된 균주들은 실시예 2-2에서와 동일한 방식으로 준비하였다.
3-3. 알레르기 반응 유도 후 균주 처리 및 IgE 분비량 측정
24 웰 플레이트에 미리 분주해 둔 U266B1 세포에 알레르기 반응을 유도하기 위하여 LPS(10 μg/mL)와 IL-4(5 ng/mL)를 각 웰 당 100 μL 처리하였다. 이후 미리 준비한 균주를 세포:균주의 비율이 1:10이 되도록 300 μL 부피로 처리하였다. 37 ℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하여 준 뒤, 상층액을 수거하고 human IgE ELISA kit (Cat NO. E88-108, Bethyl Laboratories)를 이용하여 제조사 방식에 따라 측정하였다.
그 결과 도 4에서와 같이, KBL693을 포함한 7종의 락토바실러스 크리스파투스 균주의 처리군에서 음성 대조군에 비해 IgE 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 KBL693은 알레르기 반응에 관여하는 중요 인자인 IgE를 억제하여 알레르기 질환의 치료 및 예방에 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. KBL693의 면역 조절 및 염증 억제 효과 분석
KBL693의 항알레르기 효능과 더불어 면역 조절 및 항염증 효과도 함께 확인하였다. 이를 위하여 염증반응에서 중요한 역할을 하는 대식세포(macrophage)를 이용하여 면역 조절 기능을 가지는 대표적인 사이토카인 IL-10과 염증반응의 주요 지표가 되는 사이토카인 TNF-α 및 IL-6 간의 비율(IL-10/TNF-α, IL-10/IL-6)을 측정하였다.
4-1. RAW264.7 세포주의 배양
RAW264.7(ATCC NO. TIB-71) 세포는 37℃, 5% CO2의 조건하에 10% FBS, penicillin(100 μg/mL), streptomycin(100 μg/mL)을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하며 3일에 한번씩 계대 하였다. 배양된 RAW264.7 세포를 24 웰 플레이트에 1 x 105 cells/well의 농도로 분주하여 16 - 20시간 동안 배양한 후 실시예 4-3에 사용하였다.
4-2. 균주의 배양 및 시료의 준비
사용된 시료는 동일한 생균수로 보정된 배양액을 생균(live bacteria), 저온살균(pasteurization), 고온살균(heat kill) 세 가지 시료로 준비하였다. 생균, 저온살균, 고온살균에 사용된 시료는 실시예 2-2와 동일한 방법으로 준비하였다.
그 후 저온살균 시료의 경우, 70℃에서 30분 동안 반응시켜 동일한 원심분리 과정으로 준비하였다. 고온살균 시료는 121℃에서 15분 동안 살균한 후 동일한 과정으로 준비하였다. 음성 대조군으로는 0.5% 시스테인을 첨가한 MRS 배지를 사용하였다.
4-3. 염증 반응 유도 후 균주 처리 및 염증성 사이토카인 분비량 측정
24 웰 플레이트에 미리 분주해 둔 RAW264.7 세포에 염증반응을 유도하기 위하여 LPS(20 ng/mL)를 각 웰 당 500 μL 처리하였다. 이후 미리 준비한 균주를 세포:균주의 비율이 1:10이 되도록 300 μL 부피로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포:균주 혼합물의 상층액을 수거하고 Mouse TNF ELISA Set II (Cat No. 558534, BD OptEIA™), Mouse IL-6 ELISA Set (Cat No. 555240, BD OptEIA™), Mouse IL-10 ELISA Set (Cat No. 555252, BD OptEIA™)를 이용하여 각 사이토카인의 양을 제조사 방식에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이, 락토바실러스 크리스파투스 균주 중에서 특히 KBL693이 IL-10 분비를 유도하여 면역 조절 효과 및 염증반응을 억제하는 우수한 효과를 나타내었으며, 도 6 및 도 7에 도시한 바와 같이, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 TNF-α 및 IL-6로 보정한 IL-10 분비능으로부터도 역시 KBL693 처리군에서 비교 실험군에 비해 매우 높은 염증 억제 효과 및 면역 조절능력을 보임을 확인하였다. 따라서, KBL693은 IL-10 분비를 통한 면역 조절 및 염증 억제 활성이 있음을 알 수 있었다. 또한, 이와 같은 효과는 생균 뿐만 아니라 저온살균 또는 고온살균된 사균체에서도 유사하게 확인되어 (표 2 및 표 3), KBL693은 사균 등의 다양한 형태로 면역 조절 및 염증반응 억제에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
Figure 112019053179346-pat00001
Figure 112019053179346-pat00002
실시예 5. KBL693의 항진균 효과 분석
KBL693의 항진균 효과를 spot assay 방법으로 확인하였다. KBL693을 MRS 액체 배지에 약 1% 접종 후, 37℃ 배양기에서 혐기적 조건으로 약 24시간 동안 정치배양 하였다. 균체가 배양된 배양액은 혐기적 조건에서 제작된 MRS 고체 배지에 10 μL씩 spotting 후 37℃에서 혐기적 조건으로 약 24시간 동안 배양하였다. 진균성 미생물인 Malassezia furfur KCTC 7545는 호기적 조건에서 제작된 mYPG 액체 배지에 1%의 비율로 접종하여 37℃ 배양기에서 약 24 - 48시간 배양하여 준비하였다. 항진균 효능 평가에 사용될 mYPG soft 배지는 표 4의 성분으로 제작하였으며, 제작된 배지 2.5 mL에 500 μL의 M. furfur가 배양된 배양액을 접종하였다. M. furfur가 접종된 mYPG soft 배지 2.5 mL을 KBL693이 spotting 되어있는 MRS 배지에 부어준 후 1시간 동안 건조하였다. 건조된 배지는 37 ℃ 배양기에서 호기적 조건으로 24 - 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 배지에 생성된 투명환(clear zone)이 확인되면 spotting한 유산균의 외부부터 투명환까지의 길이를 측정하여 항진균 활성도를 측정하였다. 투명환은 진균의 성장이 저해된 부분으로, 투명환까지의 길이를 통해 유산균에 의한 항진균 활성을 판단할 수 있다.
세 번의 반복 실험 결과, KBL693에 의해 spotting된 부위에서 약 4.33 mm의 간격으로 투명환이 확인되었으며(도 8), 이에 KBL693이 진균성 미생물의 생장을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Components Proportion (g/L)
Malt extract 5.0
Peptone 10.0
Glucose 20.0
Tween 40 1.0
Tween 80 1.0
Agar 4.5
실시예 6. KBL693의 아토피 완화 효과
In vitro 스크리닝 실험 결과를 종합한 결과, 면역 조절 효과가 가장 뛰어났던 락토바실러스 크리스파투스 KBL692, KBL693, KBL702 균주를 선택하여 동물실험을 진행하였다. 알레르기 개선 효과 중 아토피 완화 효과를 확인하고자 아토피성 피부질환 동물 모델인 NC/Nga 마우스 모델을 이용하였다.
NC/Nga 마우스를 각 그룹당 5마리씩 그룹핑한 후, 마우스의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 제모하고 24시간 방치하였다. 그 후 1%의 DNCB(dinitrochlorobenzene) 용액 (아세톤:올리브 오일 = 3:1) 200 μL를 제모 부위에 1주일에 2회씩 도포하여 아토피 피부염을 유발하였다. 피부염 유발 3주차부터 대조군 마우스에는 PBS를 매일 200 μL씩 경구 투여하였고, 실험군 마우스에는 배양된 시험 균주를 원심분리, PBS 희석 후 회수 과정으로 세척한 후 200 μL의 PBS에 최소 2 x 109 CFU가 첨가되도록 준비하여 매일 200 μL씩 경구 투여하였다. 한편, 양성 대조군 마우스에는 덱사메타손(Dexamethasone, 60 μg/mL)을 200 μL씩 투여하였다. 이후, 균을 투여하는 3주 동안, 대조군 및 실험군 마우스의 피부염 스코어(Dermatitis Score)를 매주 측정하였고, 균을 투여한 후 3주째 되는 날 마우스의 긁는 시간(scratching time)과 피부 두께를 측정하였다.
6-1. 피부염 스코어의 측정
DNCB로 유발된 피부 병변의 평가를 위해 아래와 같은 방법을 통해 피부염 스코어를 측정하였다. 피부 상태는 균주를 투여하기 시작한 3주째부터 1주 간격으로 3주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 피부의 건조상태(dryness), 부종(edema), 홍진과 출혈(erythema/hemorrhage) 그리고 미란과 상처 (erosion/excoriation) 4가지 지표를 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 가벼운 상태를 1점(mild), 중간 상태를 2점(moderate), 심한 상태를 3점(severe)을 주었고, 총점으로 평가하였다.
그 결과 도 9에서 볼 수 있듯이, 아토피 피부염이 유도된 대조군(Negative) 및 다른 락토바실러스 크리스파투스 균주를 투여한 군에 비해 KBL693을 투여한 군에서 DNCB를 통해 피부염 스코어가 유의하게 감소되었다. 이로써, KBL693의 투여에 따른 아토피 피부염 치료 효과를 확인할 수 있었다.
6-2. 가려움 완화 효과
DNCB로 유발된 아토피 피부염 마우스 모델에서 KBL693 투여에 따른 가려움 완화 효과를 확인하고자, 균주 투여 3주 후 10분간 마우스 모델을 동영상 촬영하며 긁는 시간(scratching time)을 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, KBL693을 투여한 실험군은 아토피 피부염이 유도된 대조군(Negative) 및 다른 락토바실러스 크리스파투스 균주를 투여한 군에 비해 긁는 시간이 현저히 감소하는 것으로 나타나, KBL693의 투여로 아토피 피부염의 가려움 증상이 많이 완화되는 것을 확인할 수 있었다.
6-3. 피부 두께의 감소
DNCB로 유발된 아토피 피부염 마우스 모델에서 KBL693의 투여에 따른 가려움 완화 효과를 확인하고자, 균주 투여 3주 후 양각기(calipers)을 이용하여 마우스의 귀 및 등 피부의 두께를 측정하고 아토피 피부염에 의한 부종 증상의 완화를 관찰하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에서 볼 수 있듯이, KBL693을 투여한 실험군 및 양성 대조군에서 유의미하게 귀 및 피부의 두께가 감소되는 효과를 관찰할 수 있었다. 도 11 및 도 12에서 693-7, 693-8, 693-9는 각각 200 μL의 PBS에 KBL693가 최소 2 x 107 / 2 x 108 / 2 x 109 CFU가 첨가되도록 준비하여 매일 200 μL씩 경구투여한 실험군을 의미한다.
실시예 7. 난백알부민(ovalbumin, OVA) 유도 천식 마우스 모델에서의 KBL693의 천식 치료 및 예방 효과
KBL693(LC206)의 알레르기성 천식에 대한 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 난백알부민 유도 천식 마우스 모델을 제작하고, 조직병리학적 검사 및 총 IL-5 및 총 IL-13의 발현 정도를 분석하였다.
7-1. 난백알부민 유도 천식 마우스 모델 제작
평균 체중 15 g 내외의 5주령 Balb/c 마우스를 대상으로 1 주 간의 적응기간(acclimation)을 거친 후에 기본적인 신체검사상에서 이상이 관찰되지 않은 마우스를 선별하였다. 도 13(A)에 도시한 바와 같이, 정상 대조군(Control-PBS; 난백알부민을 투여 및 흡입하지 않음; n = 8), 천식 유도 대조군(OVA-PBS; 난백알부민을 투여 및 흡입함; n = 9), 및 실험군(OVA-LC206; n = 8)의 3군으로 나누어 마우스를 사용하였다. 실험 개시일로부터 31일째 마우스를 희생시키기 전까지 정상 대조군 및 천식 유도 대조군에는 PBS를 매일 200μL씩 경구 투여하였고, 실험군에는 KBL693을 PBS에 최소 2x109 CFU/0.2 mL이 되도록 희석시킨 후 매일 200μL씩 경구 투여하였다.
1 주 간의 적응기간을 거친 마우스에 1주 후(D7) 및 3주 후(D21)에 각각 2 mg의 수산화알루미늄(ImjectTM Alum Adjuvant, Thermofisher)과 20 μg의 난백알부민(Ovalbumin, Sigma-aldrich)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 μL를 복강에 주입하여 감작(sensitization)시켰다. 실험 개시 후 28일부터 30일까지 1% 난백알부민을 비강 투여를 통해 폐로 흡입시켰다(3회의 챌린지). 마지막 챌린지 후 24 시간 뒤(D31)에 펜토바비탈을 투여한 뒤 기관지 절개를 실시하여 폐 조직 샘플을 채취하였다.
7-2. 조직병리학적 검사
항원이 야기된 기관지에서는 호산구, 호중구 및 대식세포로 이루어진 염증성 세포의 침윤이 관찰된다. 이에, KBL693의 천식에 대한 효과를 확인하고자 실시예 7-1에서 확보한 각 군의 폐 조직 샘플의 조직병리학적 검사를 수행하였다. 실시예 7-1에서 얻은 폐 조직 샘플을 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded(FFPE))를 거쳐 4 μm 두께의 조직 절편으로 제작하여 각각 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신 와이(Eosin Y; ThermoShandon, Pittsburgh, PA)로 H&E 염색을 수행하였다. H&E 염색 후 각 군의 조직 절편을 광학현미경으로 관찰하였다(도 13(B)).
그 결과, 도 13(B)에서와 같이 천식 유도 대조군(OVA-PBS)에서는 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었으며 과다 증식된 상피 세포와 비후된 기관지 평활근도 확인되었다. 반면, KBL693을 투여한 실험군(OVA-LC206)에서는 호산구를 비롯한 염증세포의 침윤이 현저하게 감소되었으며, 기관지 조직의 두께가 경감되었고, 상피세포의 손상이 거의 보이지 않았다. 이로써, KBL693의 난백알부민 유도 알레르기성 천식에 대한 치료 효과를 확인할 수 있었다.
7-3. 총 IL-5 및 총 IL-13 발현량 분석
상기 각 군별로 채취한 폐 조직 샘플에서 폐의 면역세포를 측정하기 위해, 유세포 분석기(LSRFortessa X-20, BD)를 이용하였다. IL-5+CD4+ T, IL-13+CD4+ T 세포를 염색하기 위해 여러 마커에 대한 항체 (Anti-Mouse CD45, BioLegend; Anti-Mouse CD3ε, BD; Anti-Mouse/Human IL-5, BioLegend; Anti-Mouse IL-13, Invitrogen)를 이용하였다. IL-5+, IL-13+ 세포는 CD45, CDε를 마커로 하는 림프구 중, IL-5 또는 IL-13을 생산하는 세포를 계수함으로써 측정하였다(도 14).
그 결과, 도 14에 도시한 바와 같이 천식 유도 대조군(OVA-PBS) 마우스의 IL-5 및 IL-13 수준은 모두 정상 대조군(PBS)에 비해 현저히 증가한 반면, 본 발명의 KBL693을 투여한 실험군(OVA-KBL693)의 총 IL-5 및 총 IL-13 수준은 천식 유도 대조군에 대하여 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 KBL693은 알레르기 반응을 매개하는 Th2 유형 사이토카인인 IL-5 및 IL-13의 분비 억제를 통해 알레르기성 천식을 치료 및 예방하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 8. 집먼지 진드기(house dust mite, HDM) 유도 천식 모델에서의 KBL693의 천식 치료 및 예방 효과
집먼지 진드기는 외인성 천식의 가장 큰 원인 알러지원이다. KBL693의 알레르기성 천식에 대한 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 집먼지 진드기 유도 천식 마우스 모델을 제작하고, 기도과민성 측정 및 CD45+ 세포 중 호산구의 비율, CD4+ T 세포 중 IL-5+ CD4 T 세포의 비율 및 CD4+ T 세포 중 IL-13+ CD4 T 세포의 비율을 측정하였다.
8-1. 집먼지 진드기 유도 천식 마우스 모델 제작
평균 체중 15 g 내외의 5주령 Balb/c 마우스를 대상으로 1 주 간의 적응기간(acclimation)을 거친 후에 기본적인 신체검사상에서 이상이 관찰되지 않은 마우스를 선별하였다. 정상 대조군(Control-PBS; 집먼지 진드기를 투여하지 않음), 천식 유도 대조군(HDM-PBS; 집먼지 진드기를 투여함), 및 실험군(HDM-KBL693)의 3군으로 나누어 기도저항성 측정에는 각 군당 5마리, 폐의 면역세포 측정에는 각 군당 8마리의 마우스를 사용하였다.
1 주 간의 적응기간을 거친 마우스에 1주 후(D7)에 10 μg의 집먼지 진드기 (House dust mite, Greer)를 현탁한 인산완충용액 (pH 7.4) 50 μL를 비강을 통해 투여함으로써 감작시켰다. 감작 후, 1 주 뒤, 5일간(D14~D18) 10 μg의 집먼지 진드기를 현탁한 인산완충용액 50 μL를 비강을 통해 투여하여 폐로 흡입시켰다(5회의 챌린지). 마지막 챌린지 후 24시간 뒤(D19)에 펜토바비탈을 투여한 뒤, 기도저항성을 측정하고 (실시예 8-2), 기관지 절개를 실시하여 폐 조직 샘플을 채취하였다.
8-2. 기도저항성(airway hyperresponsiveness, AHR) 측정
펜토바비탈을 투여하여 마취된 마우스를 기도저항측정기(FinePointe Resistance and Compliance, DSI-Buxco)에 연결하고, PBS에 녹인 여러 농도의 메타콜린(0,5, 10, 20 및 40 mg/mL)을 투여한 후 기도를 통과하는 공기의 부피를 측정함으로써 기도저항성 값을 산출하였다(도 15).
그 결과, 도 15에 도시한 바와 같이 정상 대조군(CTRL)에서는 메타콜린 농도 증가에 따라 완만하게 기도 저항성(RL)이 증가하는 것을 확인하였으나, 천식 유도 대조군(HDM)에서는 기도 저항성이 급격히 증가한 것을 확인하였다. 반면, KBL693을 투여한 실험군(HDM+KBL693)에서는 메타콜린 전체 농도에서 기도 저항성이 천식 유도 대조군(HDM)에 비하여 현저히 감소하였으며, 이러한 차이는 저농도의 메타콜린보다는 고농도의 메타콜린을 투여 시 더욱 뚜렷하였다. 이로써, KBL693이 천식의 원인인 기도저항성을 효과적으로 억제하므로 알레르기성 천식의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
8-3. CD45 + 세포 중 호산구의 비율, CD4 + T 세포 중 IL-5 + CD4 T 세포의 비율 및 CD4 + T 세포 중 IL-13 + CD4 T 세포의 비율 측정
폐의 면역세포를 측정하기 위해, 유세포 분석기(LSRFortessa X-20, BD)를 이용하였다. 호산구와 IL-5+CD4+ T, IL-13+CD4+ T 세포를 염색하기 위해 여러 마커에 대한 항체 (Anti-Mouse CD45, BioLegend; Rat Anti-Mouse Siglec-F, BD; Anti-Mouse CD11b, BD; Anti-Mouse CD3ε, BD; Anti-Mouse TCRβ, BioLegend; Anti-Mouse CD4, BioLegend; Anti-Mouse/Human IL-5, BioLegend; Anti-Mouse IL-13, Invitrogen)를 이용하였다. 호산구는 백혈구의 공통 마커인 CD45를 발현하는 세포 중, Siglec-f+CD11b+ 세포를 계수함으로써 측정하였으며, IL-5+CD4+T, IL-13+CD4+ T 세포는 CDε, TCRβ, CD4를 마커로 하는 CD4+ T 세포 중, IL-5 또는 IL-13을 생산하는 세포를 계수함으로써 측정하였다(도 16).
그 결과, 도 16에 도시한 바와 같이 천식 유도 대조군(HDM)의 경우, 염증세포인 호산구, IL-5+ CD4 T 세포 및 IL-13+ CD4 T 세포의 비율이 모두 정상 대조군(PBS)에 비해 현저히 증가한 반면, 본 발명의 KBL693을 투여한 실험군(HDM+KBL693)의 경우, 호산구, IL-5+ CD4 T 세포 및 IL-13+ CD4 T 세포의 비율이 천식 유도 대조군에 비하여 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 KBL693은 염증세포인 호산구, IL-5+ CD4 T 세포 및 IL-13+ CD4 T 세포의 억제를 통해 알레르기성 천식을 치료 및 예방하는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC13519BP 20180427
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Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 기탁번호 KCTC 13519BP인 락토바실러스 크리스파투스 KBL693 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 식품용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 알레르기 증상 개선, 염증 증상 개선 및 면역 조절로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효과를 갖는 건강기능식품용 조성물인 것을 특징으로 하는 식품용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 알레르기 증상은 습진, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염 및 음식 알레르기로 구성된 군에서 선택된 것인 식품용 조성물.
  6. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 동물 사료용 조성물.
  7. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하며, 말라세지아 퍼퍼(Malassezia furfur)에 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
  8. 삭제
  9. 제7항의 항진균 조성물을 포함하는 피부 외용제.
  10. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는, 피부 알레르기, 피부 두드러기, 아토피 피부염, 건선, 말라세지아 퍼퍼에 의한 감염 또는 습진을 개선하기 위한 의료용 패치.
  11. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 알레르기 질환, 또는 염증성 또는 자가면역성 질환 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 알레르기 질환은 히스타민, IL-4, IL-5, IL-13 및 IgE의 분비 억제를 통해 치료 또는 예방될 수 있는 질환이고,
    상기 염증성 질환은 IL-10의 분비 촉진 및 TNF-α, IL-6의 분비 억제를 통해 치료 또는 예방될 수 있는 질환이고,
    상기 자가면역 질환은 IL-10의 분비 촉진을 통해 치료 또는 예방될 수 있는 질환인, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 습진, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 알레르기성 결막염 및 음식 알레르기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 염증성 또는 자가면역성 질환은 류마티스성 관절염, 류마티스성 열, 루프스, 전신성 경피증, 아토피 피부염, 건선, 건선 관절염, 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 중증 근무력증, 피부근염, 다발성근염, 다발성 경화증, 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염, 하시모토 갑상선염, 측두동맥염, 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 천포창, 아프타구내염, 자가면역 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병, 크론병, 베체트병, 부종, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 만성 부비동염, 인후염, 편도염, 기관지염, 폐렴, 위궤양, 위염, 대장염, 통풍, 습진, 여드름, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 강직성 척수염, 섬유근통(fibromyalgia), 골관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 패혈증, 맥관염, 및 활액낭염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 화장료 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 피부 알레르기, 피부 두드러기, 아토피 피부염, 건선, 말라세지아 퍼퍼에 의한 감염 또는 습진을 개선하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 미용용 패치인 화장료 조성물.
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