CN112384611B - 卷曲乳杆菌kbl693菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)KBL693菌株及其用途。根据本发明的卷曲乳杆菌KBL693(登记号KCTC 13519BP)菌株减弱了细胞的变应性应答，显著改善了特应性皮炎的症状，并且表现出抗炎和抗真菌作用。因此，仅单菌株就可实现减轻特应性皮炎和其他变应性疾病、炎性疾病以及自身免疫病的所有目的，从而找到作为益生菌物质的有利应用。另外，基于其抗真菌活性，所述菌株可有利地用于针对由真菌引起的多种皮肤病的皮肤表面剂中，以及用于减轻敏感性皮肤的化妆品组合物和功能性贴剂中。

Description

卷曲乳杆菌KBL693菌株及其用途
技术领域
本发明涉及卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)KBL693菌株及其用途。更具体地，本发明涉及抗真菌组合物；以及用于治疗选自变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病中的至少一种疾病的药物组合物，其包含选自以下的至少一种：新的益生菌卷曲乳杆菌KBL693菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
背景技术
益生菌(probiotics)是指具有抗微生物活性和酶活性以帮助肠微生物平衡的微生物及由其产生的产物。另外，益生菌也定义为当以干的细胞或发酵产品的形式提供给人或动物时，改善肠道菌群的作为单一或多种菌株形式的活细菌。益生菌必须栖息在人肠道，必须是非病原性的和无毒性的，并且存活足够长的时间，直至它们到达肠。此外，益生菌必须保持生存力和活性，直至其在所递送的食品中被消耗为止，对用于预防感染的抗生素敏感，并且不具有抗生素抗性质粒。同样，益生菌必须对肠环境中的酸、酶和胆汁具有抗性。
这些益生菌可包括，例如具有优异的产生消化酶(例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和磷酸酶)的能力的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；产生乳酸的乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；以及在代谢过程中通过利用残留在牲畜粪便中的臭味产生物质(例如氨、硫化氢和胺)来防止臭味的光合细菌(photosynthetic bacteria)。最近，据报道益生菌具有多种健康功能改善作用，包括改善肠健康，并因此作为可替代现有的基于化合物的治疗剂的主要治疗性物质而受到关注。
同时，变态反应(allergy)是表现出对外来物质(抗原、变应原)的独特、改变的应答的生物化学现象。引起症状的外来物质称为变应原，而由那些症状引起的疾病称为变应性疾病。变态反应是由抗原-抗体反应引起的活体中的病理过程。一般而言，根据补体参与和触发反应的时期，存在四种类型的变态反应。其中的1型是过敏型(即刻型)，其中靶器官主要是消化器官、皮肤和肺，并且常见症状包括胃肠变态反应、荨麻疹、萎缩性皮炎、变应性鼻炎和支气管哮喘，等。已知1型的病理机制如下：当抗原接触附着于肥大细胞和嗜碱性白细胞的表面的IgE抗体时，靶细胞被活化以分泌化学递质，例如组胺、白三烯和PAF，并随后血管和平滑肌收缩。这样的机制通常可与4型(迟发型)组合。换言之，由于肥大细胞等的多种变化，可引起这样的过敏反应和变应性反应。导致脱颗粒的肥大细胞的活化由以下引起：抗原、抗IgE、凝集素等与Fc受体的结合；过敏毒素等或另一些药物(例如钙离子载体、化合物48/80、可待因和合成促肾上腺皮质激素)的刺激。
已知血液中的肥大细胞和嗜碱性白细胞是在身体中引起多种变应性疾病，例如变应性鼻炎、变应性皮炎、哮喘、食物变态反应和过敏性休克的主要细胞。这些细胞在其表面上具有针对IgE的受体(FcRI)，所述IgE是引起变态反应的抗体，并且所述细胞被变态反应引起物质(抗原、变应原)刺激而从所述细胞中分泌出其自身的多种变态反应引起物质(KimK et al,Eur J Pharmacol,581:191-203,2008)。
在变应性疾病中，如公众公知的，特应性皮炎是一种影响新生儿或儿童并可能持续直至成年期的慢性复发性皮肤病。像哮喘或变应性鼻炎一样，特应性皮炎是与产生IL-4和IL-5的T淋巴细胞的局部浸润相关的炎性皮肤病。如公众公知的，IL-4控制T辅助2(Th2)表型的发生，导致免疫球蛋白(Ig)的过度产生和嗜酸性粒细胞增多，以及血清IgE水平的提高。发现对于针对食品和吸入性变应原的皮肤测试呈阳性的对象中的80％至90％患有特应性皮炎。
存在用于治疗或预防变应性疾病和特应性皮炎的不同治疗，但尚未找到有效的治疗。一些基于药物的治疗是已知的，但是甚至用于治疗的药物的短期施用也会产生耐受性，并且长期施用可引起严重的副作用，并因此最近已避免变应性疾病和特应性皮炎的这样的基于药物的治疗。在这种情况下，在不进行具有任何绝对、明显作用的治疗的情况下，刺激性症状(例如除变态反应之外的皮肤的发痒和发红)通常无法得到改善。
在这种情况下，本发明人致力于益生菌的研究，以找到替代针对没有令人满意的治疗的变应性疾病(包括特应性皮炎)的基于药物治疗的方法。并因此，通过确定对变应性疾病(例如特应性皮炎)显示出优异治疗作用的新的卷曲乳杆菌菌株，并进一步确定所述菌株还对于抗炎症、免疫调节、和抗真菌活性显示出优异作用而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供对以下显示出优异作用的新菌株及其多种用途：减轻变应性症状(例如特应性皮炎)、减轻炎性症状以及免疫调节。
为了实现该目的，本发明提供了卷曲乳杆菌KBL693菌株(登记号KCTC 13519BP)。
本发明还提供了饲料组合物或饲料添加剂组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了抗真菌组合物，例如去头皮屑组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了用于治疗变应性疾病(例如特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的药物组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了用于治疗变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的方法，其包括向有此需要的对象施用选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了包含选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物中的至少一种的组合物，其用于预防或治疗变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的用途。
本发明还提供了组合物用于制备用于变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的预防性或治疗性药物的用途，所述组合物包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了化妆品组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明还提供了化妆品贴剂或医用贴剂，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
附图说明
图1示出了在RBL 2H3细胞系中通过抗原-抗体反应诱导组胺产生之后，对多种乳杆菌菌株包括卷曲乳杆菌KBL693菌株和抗组胺剂酮替芬的处理对组胺分泌的抑制作用进行比较的结果。
图2示出了确定在EL4细胞系中诱导变应性反应之后，多种乳杆菌菌株包括卷曲乳杆菌KBL693菌株对IL-4表达的抑制作用的结果。
图3示出了确定在EL4细胞系中诱导变应性反应之后，多种乳杆菌菌株包括卷曲乳杆菌KBL693菌株对IL-5表达的抑制作用的结果。
图4示出了确定在U266B1细胞系中诱导变应性反应之后，多种乳杆菌菌株包括卷曲乳杆菌KBL693菌株对IgE分泌的抑制作用的结果。
图5示出了当在RAW 264.7细胞系中诱导炎性反应之后用多种乳杆菌菌株处理时，通过KBL693菌株的处理使抗炎细胞因子IL-10分泌的量提高的显著作用的观察结果。
图6示出了确定当在RAW 264.7细胞系中诱导炎性反应之后用多种乳杆菌菌株处理时，通过IL-10/TNF-α值下的KBL693菌株的处理的显著免疫调节和抗炎作用的结果。
图7示出了确定当在RAW 264.7细胞系中诱导炎性反应之后用多种乳杆菌菌株处理时，通过IL-10/IL-6值下的KBL693菌株的处理的显著免疫调节和抗炎作用的结果。
图8示出了确定卷曲乳杆菌KBL693菌株的抗真菌活性的斑点测定的结果。
图9示出了确定通过将卷曲乳杆菌KBL693菌株经口施用于诱导了特应性皮炎的小鼠模型，皮炎评分降低效果的结果。
图10示出了确定通过将卷曲乳杆菌KBL693菌株经口施用于诱导了特应性皮炎的小鼠模型，发痒减轻效果的结果。
图11示出了确定通过将卷曲乳杆菌KBL693菌株经口施用于诱导了特应性皮炎的小鼠模型，耳厚度降低效果的结果。
图12示出了确定通过将卷曲乳杆菌KBL693菌株经口施用于诱导了特应性皮炎的小鼠模型，皮肤厚度降低效果的结果。
图13(A)示出了使用患有经卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘的小鼠模型的实验计划，以及图13(B)示出了在H&E染色之后通过光学显微镜进行的对从正常对照组(对照-PBS)、哮喘诱导的对照组(OVA-PBS)和测试组(OVA-LC206)中的每组中收集的肺组织的观察。
图14示出了从正常对照组(对照-PBS)、哮喘诱导的对照组(OVA-PBS)和测试组(OVA-KBL693)中的每组中收集的肺组织中总IL-5和总IL-13的表达水平的确定结果。
图15示出了确定通过将卷曲乳杆菌KBL693菌株施用于患有经屋尘螨(HDM)诱导的哮喘的小鼠模型，气道高反应性(AHR)降低效果的结果。
图16示出了确定通过施用卷曲乳杆菌KBL693菌株使嗜酸性粒细胞、IL-5+CD4 T细胞和IL-13+CD4 T细胞降低的作用的结果。
具体实施方式
除非另外限定，否则本说明书中使用的所有技术、科学术语具有与本领域普通技术人员(“本领域技术人员”)所理解的相同的含义。一般而言，本说明书中使用的术语是本领域公知的并且是常用的。
本发明发现了来源于人体的微生物的抗变应性作用，并且选择了具有优异的变态反应抑制作用的卷曲乳杆菌KBL693菌株(登记号KCTC 13519BP)。对所述菌株的16s rDNA的分析表明，所述菌株是从未为公众所知的新菌株。
根据本发明的一个实施方案，本发明涉及新的益生菌卷曲乳杆菌KBL693菌株(登记号KCTC 13519BP)，并且所述菌株的特征在于其包含SEQ ID NO:1的16s rDNA序列。
<SEQ ID NO:1>卷曲乳杆菌KBL693菌株(登记号KCTC 13519BP)的16s rDNA序列
然后，本发明就所述菌株的效力进行了实验，并从而证实了所述菌株对变态反应(例如特应性皮炎)具有优异的抑制作用，具有免疫调节特性，减轻炎性反应，并且具有抗真菌活性。此外，本发明人确定，不仅在活细菌的条件下，而且在低温灭菌或高温灭菌下也可以提供所述作用。
本发明的组合物也可以以包含所述菌株的饲料添加剂或包含所述菌株的饲料的形式提供。
本发明的饲料添加剂可以是干燥或液体制剂的形式，并且除所述卷曲乳杆菌KBL693菌株之外还包含其他非病原性微生物。可添加至饲料添加剂的微生物可包括，例如，可产生蛋白酶、脂肪酶和糖转化酶的枯草芽孢杆菌，在厌氧条件下例如在牛胃中具有生理活性和有机化合物可降解性的乳杆菌菌株，对提高动物的体重、乳产量和饲料的消化率显示出作用的丝状真菌(例如米曲霉(Aspergillus oryzae))(Slyter,L.L.J.AnimalSci.1976,43.910-926)，以及酵母，例如酿酒酵母(Johnson,D.E et al.J.Anim.Sci.,1983,56,735-739；Williams,P.E.V.et al,1990,211)。
本发明的饲料添加剂除所述卷曲乳杆菌KBL693菌株之外，可另外包含至少一种酶制剂另外的酶制剂可以是干燥或液体的形式，并且可包括例如脂肪分解酶(例如脂肪酶)，通过降解植酸来产生磷酸和肌醇磷酸的植酸酶，淀粉酶(即，水解包含在例如淀粉和糖原中的α-1,4-糖苷键的酶)，磷酸酶(即，水解有机磷酸酯的酶)，降解纤维素的羧甲基纤维素酶，降解木糖的木糖酶，将麦芽糖水解成两个葡萄糖分子的麦芽糖酶，以及糖产生酶(例如通过水解蔗糖产生葡萄糖-果糖混合物的转化酶)。
在本发明的卷曲乳杆菌KBL693菌株作为饲料添加剂的用途中，可使用饲料的原料成分，例如花生、豌豆、甜菜、果肉、谷物副产物、动物肠粉和鱼粉粉末包括多种谷物和大豆蛋白质。可将其加工或不进行加工，并且可不受限制地使用。该加工可包括这样的过程(但不限于此)：装载饲料的原料成分并且可在针对给定出口的压力下将其压缩，并且对于蛋白质，可优选地使用挤压(extrusion)，通过挤压降解蛋白质以提高可用性。挤压通过热处理使蛋白质变性以破坏抗酶因子，这是有利的。此外，对于大豆蛋白质，其消化率可通过挤压以使抗营养物(例如胰蛋白酶抑制剂，其是存在于大豆中的一种蛋白酶抑制剂)失活来提高。此外，挤压可促进蛋白酶的消化率的提高，从而增强大豆蛋白质的营养价值。
根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及抗真菌组合物，其包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
所述组合物的特征可在于对选自糠秕马拉色菌、球形马拉色菌(Malasseziaglobosa)和限制性马拉色菌(Malassezia restricta)中的一种显示出抗真菌活性，但不限于此。
所述组合物可以是用于预防、减轻或治疗脂溢性皮炎或头皮屑的组合物，并且所述脂溢性皮炎可以在头皮上。
此外，所述组合物可以是用于预防、减轻或治疗由于霉菌感染引起的荨麻疹、皮疹、体癣、股癣或足癣的组合物。
基于所述组合物的总重量，所述菌株，以及所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物可以以按重量计0.1％至按重量计50％的量包含在内。
所述抗真菌组合物可以是药物组合物或化妆品组合物，并且其还可以是皮肤外用制剂。
所述化妆品组合物可以以适合于表面施加的所有剂型提供，例如作为液体剂、水包油型乳剂油包水型乳剂混悬剂/>固体剂/>凝胶剂/>散剂/>糊剂/>泡沫剂(foam)或气雾剂/>的形式提供。上述剂型的所述组合物可以以本领域中使用的常规方法来制备。
除以上成分之外，所述组合物可包含不损害主要作用的量的，优选对主要作用提供协同作用的量的其他成分。根据本发明的组合物可包含选自维生素、多肽、多糖和鞘脂的物质。此外，本发明的化妆品组合物可包含保湿剂、润肤剂、表面活性剂、UV吸收剂、防腐剂、灭菌剂抗氧化剂、pH调节剂、有机和无机颜料、矫味剂、清凉剂或止汗剂。所述成分的组合百分比可由本领域技术人员在不妨碍本发明的目的和效果的范围内选择，并且可以为基于所述组合物的总重量的按重量计0.01％至按重量计5％，并且特别地为按重量计0.01％至按重量计3％。
根据以上实施方案，本发明的抗真菌组合物可以是皮肤外用制剂，例如霜剂软膏剂/>洗发剂/>或治疗剂。
根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及用于治疗或预防变应性疾病(包括特应性皮炎)、和/或炎性疾病或自身免疫病的药物组合物，其包含选自以下的至少一种：卷曲乳杆菌KBL693菌株的细胞组分、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本发明的药物组合物可以以活菌的细胞组分、干菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物或者与可药用载体或介质组合的组合物的形式提供。本文中可使用的载体或介质可包括溶剂、分散剂、包衣、增强剂、控释制剂(即缓释制剂)或至少一种惰性赋形剂，包括淀粉、多元醇、颗粒、微细纤维素、微晶纤维素(例如Celphere、Celphere珠)、稀释剂、润滑剂、黏合剂、崩解剂。如果期望的话，可通过标准的水性或非水性技术对上述组合物的片剂进行包衣。可药用载体和用作可药用惰性载体的赋形剂以及所述另外的成分的一些实例可包括例如黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、抗微生物剂和包衣剂，但不限于此。
此外，本发明的药物组合物可用作外用制剂，其包含选自以下的剂型：软膏剂、霜剂、糊剂、用于皮肤施加的液体剂和溶液剂甘油明胶(glycerogelatin)、搽剂(liniment)、用于皮肤施加的散剂/>气雾剂和膏剂/>
在本发明中，所述变应性疾病是指与IL-4或IL-5表达相关的病症，并且可包括例如湿疹、变应性哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、荨麻疹或过敏反应。优选地，本发明的特征可在于：所述疾病选自婴儿湿疹、变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、变应性结膜炎和食物变态反应，但不限于此。
在本发明中，所述炎性疾病或自身免疫病或可通过免疫调节减轻的症状是可通过促进作为抗炎、免疫调节性细胞因子的IL-10的表达或分泌来治疗、减轻或预防的那些，并且可包括，例如，类风湿性关节炎、风湿热、狼疮、系统性硬皮病、特应性皮炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、吉兰-巴雷综合征(Guilian-Barre syndrome)、重症肌无力、皮肌炎、多肌炎、多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎、结节性多动脉炎、桥本甲状腺炎、颞动脉炎、青少年糖尿病、斑秃、天疱疮、口疮性口炎、自身免疫性溶血性贫血、韦氏肉芽肿病舍格伦综合征、艾迪生病、克罗恩病、白塞病、水肿、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、慢性鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎、支气管炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、结肠炎、痛风、湿疹、痤疮、接触性皮炎、脂溢性皮炎、强直性脊柱炎、纤维肌痛、骨关节炎、肩周关节炎、腱炎、腱鞘炎肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、脓毒症、血管炎、滑囊炎等，但不限于此。
除非另外提及，否则术语“治疗”是指逆转或减轻与所述术语一起使用的疾病或病症或者其一种或更多种症状，抑制所述疾病或病症或者其一种或更多种症状的进展，或者预防所述疾病或病症或者其一种或更多种症状。本发明中使用的术语“治疗”是指如上所定义的“治疗”行为。因此，哺乳动物中疾病的治疗或治疗方案可包括以下中的一项或更多项：
(1)抑制疾病的增长，即抑制其发展，
(2)预防疾病的传播，
(3)减轻疾病，
(4)预防疾病的复发，以及
(5)减轻疾病的症状。
用于预防或治疗变应性疾病(例如特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的本发明的组合物可包含单独的或与可药用载体、赋形剂或稀释剂中的至少一种组合的药学有效量的卷曲乳杆菌KBL693菌株。
在本发明中，术语“有效量”意指足够高以提供期望的效果但是足够低以防止在医学判断下严重的副作用的量。鉴于施用途径和施用目标，可适当地调整通过本发明的组合物施用于身体的微生物的量。
本发明的组合物可以以每天一次或更多次施用于对象。单位剂量意指适合于单位施用于人对象和其他哺乳动物的物理上离散的单位，并且每个单位包含合适的药物载体和预定量的本发明的卷曲乳杆菌KBL693菌株以提供治疗作用。用于经口施用于成年患者的剂量单位优选地包含0.001g或更多的本发明微生物，并且本发明组合物的经口剂量为0.001g至10g，并且优选0.01g至5g/剂量。本发明微生物的药学有效量为0.01g至10g/天。然而，剂量取决于患者疾病的严重程度和微生物以及一起使用的辅助有效成分而变化。另外，总每天剂量可根据需要分为数次并连续施用。因此，以上剂量范围不以任何方式限制本发明的范围。
此外，上文使用的术语“可药用”是指在生理上可接受并且当施用于人时不引起变应性反应例如胃肠病症、或头晕或类似反应的组合物。
本发明的组合物可使用本领域已知的方法来配制，以使得在施用于哺乳动物之后，可提供活性成分的迅速、持续或延迟释放。剂型可以是散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射溶液剂或无菌散剂。此外，用于预防或治疗变应性疾病(例如特应性皮炎)、和/或炎性疾病或自身免疫病的本发明组合物可通过数种途径来施用，包括经口、经皮、皮下、静脉内或肌内施用。活性成分的剂量可根据多种因素来适当地选择，例如施用途径，患者的年龄、性别、体重，以及患者的严重程度。用于治疗变应性疾病(例如特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的本发明组合物可与具有预防、减轻或治疗相关症状的作用的已知化合物组合施用。
特别地，本发明的药物组合物可以以经肠溶包衣制剂的经口单位剂型提供。本文中使用的术语“肠溶包衣”包含可保留在胃中而不被胃酸降解并且可在肠道中充分崩解以在其中释放活性成分的任何已知的可药用包衣。本发明的“肠溶包衣”是指当在36℃至38℃下使人工胃液(例如pH1的HCl溶液)与之接触时可维持2小时或更多时间并且随后可优选地在人工肠液(例如pH 6.8的KH2PO4缓冲溶液)中在30分钟内降解的包衣。
本发明的肠溶包衣以约16mg至30mg，优选16mg至20mg或者25mg或更少的量对一个核芯进行包衣。当本发明的肠溶包衣的厚度为5μm至100μm，并且优选为20μm至80μm时，作为肠溶包衣可获得令人满意的结果。肠溶包衣的材料可从已知的聚合物材料中适当地选择。合适的聚合物材料列出于许多已知文献[L.Lachman等,The Theory and Practice ofIndustrial Pharmacy,第3版,1986,pp.365～373；H.Sucker等,PharmazeutischeTechnologie,Thieme,1991,pp.355-359；Hagers Handbuchder pharmazeutischenPraxis,第4版,Vol.7,pp.739～742和766～778,(SpringerVerlag,1971)；以及Remington’s Pharmaceutical Sciences,第13版,pp.1689～1691(Mack Publ.,Co.,1970)]中，并且纤维素酯衍生物、纤维素醚、丙烯酸树脂与丙烯酸甲酯的共聚物以及马来酸与邻苯二甲酸衍生物的共聚物可包括在其中。
本发明的肠溶包衣可使用其中将肠溶包衣溶液喷涂在核芯上的常规肠溶包衣方法来制备。用于肠溶包衣过程的合适的溶剂是醇，例如乙醇；酮，例如丙酮；卤代烃溶剂，例如二氯甲烷(CH2Cl2)，以及这些溶剂的混合溶剂。以1:约0.05至约0.3(包衣材料:软化剂)的比率向包衣溶液添加软化剂，例如邻苯二甲酸二正丁酯或三乙酸甘油酯。连续进行喷涂过程是合适的，并且可鉴于包衣条件来调节喷涂量。可对喷涂压力进行多种调节，并且通常在约1巴至约1.5巴的喷涂压力下可获得令人满意的结果。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了所述菌株或所述组合物用于预防或治疗变应性疾病(例如特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的用途，以及所述菌株或所述组合物用于制备用于以上疾病的治疗剂的用途。
特别地，本发明涉及包含选自所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物中的至少一种的组合物，其用于预防或治疗变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的用途。
本发明还涉及组合物用于制备用于变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的预防性或治疗性药物的用途，所述组合物包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
本文中使用的术语“预防”与避免、延迟、阻碍(impeding)或妨碍(hindering)疾病以减少该疾病相关。
本文中使用的术语“治疗”与护理患有疾病的对象以改善、治愈或者减轻疾病的症状或者减轻或停止疾病的进展相关。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的方法，其包括向需要预防或治疗所述疾病、或者需要减轻所述疾病的对象施用药学有效量的所述菌株或所述组合物。
特别地，本发明提供了用于治疗变应性疾病(包括特应性皮炎)和/或炎性疾病或自身免疫病的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
由于上文已经描述了用于预防或治疗所述疾病的方法的药物组合物及其施用方法，因此本文中将省略所述组合物与所述方法之间的重叠内容以避免本说明书的过度复杂性。
同时，可向其施用用于预防或治疗所述疾病的组合物的所述对象包括所有动物，包括人。例如，对象可以是动物，例如狗、猫或小鼠。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及包含药学有效量的选自以下的至少一种的化妆品组合物：卷曲乳杆菌KBL693菌株的细胞组分、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物。
化妆品组合物的特征可在于其减轻选自皮肤变态反应、皮肤荨麻疹、特应性皮炎、银屑病、霉菌感染和湿疹中的至少一种敏感性皮肤病症的功能，但不限于此。
本文中使用的术语“化妆品组合物”是指包含选自以下的至少一种的组合物：卷曲乳杆菌KBL693菌株的细胞组分、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物，并且可采取任何类型的剂型。例如，通过使用所述化妆品组合物制备的化妆品可包括乳霜、剥撕式面膜化妆水/>精华/>爽肤水/>粉底/>和妆前底霜/>并且可以以上文列出的任何剂型商业化以实现本发明的目的，但不限于此。除以上成分之外，本发明的化妆品组合物中所包含的成分还包括通常用于化妆品组合物中的那些，例如，常规的辅料，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料以及载体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及功能性贴剂，其包含选自以下的至少一种：卷曲乳杆菌KBL693菌株的细胞组分、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物以及所述菌株的提取物，并且所述功能性贴剂可用于美容或医学目的。
贴剂的特征可在于其减轻选自皮肤变态反应、皮肤荨麻疹、特应性皮炎、银屑病、霉菌感染和湿疹中的至少一种敏感性皮肤病症的功能，但不限于此。
在本发明中，贴剂通常是包含待递送物质的小的黏性绷带，并且所述绷带可采取多种形式。最简单的形式是包含含有置于支持物上的待递送物质之储器的黏性单体。储器通常由化妆品上可接受的或可药用的压敏黏合剂形成，但是在一些情况下也可由提供适合于接触皮肤的表面的薄黏性层的非黏性材料形成。可改变从贴剂到佩戴该贴剂的对象施用待递送物质的速率，因为皮肤对待递送物质的渗透性通常取决于个体和皮肤的位置，这可由本领域技术人员容易地选择。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，并且对于本领域技术人员将明显的是，本发明的范围不应理解为受这些实施例的限制。
实施例1.由于抑制嗜碱性粒细胞中组胺分泌引起的KBL693对变应性反应的减轻和治疗作用
据报道，在变应性反应中，组胺在组织中表达，引起炎性反应，并且抑制组胺分泌通过阻断经由组胺的反应而导致对变应性症状的减轻。本发明试图选择可通过抑制组胺分泌对变应性反应的减轻和治疗显示出作用的益生菌菌株。为此，对总共8种来源于人阴道的乳杆菌菌株的抑制组胺分泌的能力进行了评价。所述抑制组胺分泌的能力通过以下来确定：在培养RBL-2H3细胞系之后诱导脱颗粒，并随后利用与底物的比色反应，测量与组胺共分泌的β-氨基己糖苷酶的活性。
1-1.RBL-2H3细胞系的孵育
将RBL-2H3(ATCC NO.CRL-2256)细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中于37℃、5％CO2下培养，并随后将其每3天1次传代培养。将RBL-2H3细胞以1×106个细胞/孔的浓度接种到6孔板上，然后将其培养3小时，并随后用IgE(0.5μg/mL)处理以孵育16至20小时。
1-2.菌株的孵育和培养液的制备
将待使用的卷曲乳杆菌菌株在补充有0.5％半胱氨酸的MRS培养基中培养，通过18小时间隔下的总共2次传代培养使其活化，并随后将其用于实验中。将所得培养液以15,000×g离心3分钟以收集上清液。
1-3.菌株处理之后诱导脱颗粒
在除去先前接种到6孔板上的RBL-2H3细胞的培养基之后，将细胞用1mL的Siraganian缓冲液(pH 7.2)洗涤两次。之后，将细胞用120μL先前制备的细菌培养液或阳性对照组酮替芬(20μg/mL)/孔进行处理，将其在5％CO2培养箱中于37℃下孵育20分钟，随后用60μL的抗原(DNP-HAS，1μg/mL)进行处理，以通过抗原-抗体反应诱导脱颗粒。作为阴性对照，在用120μL的Siraganian缓冲液处理之后诱导脱颗粒。反应在5％CO2培养箱中于37℃下进行20分钟，并随后收集上清液。
1-4.显色反应的确定
为了确定β-氨基己糖苷酶的活性，将25μL的实施例1-3中收集的上清液转移至96孔板的每个孔，并随后向其中添加25μL的每种底物(对硝基苯基N-乙酰基-D-氨基葡糖苷酶(p-nitrophenyl N-acetyl-D-glucosaminidase))，并随后在5％CO2培养箱中于37℃下反应90分钟。然后，添加200μL终止溶液(Na2CO3/NaHCO3)以终止反应，并随后在405nm下测量吸光度。将用每种类型的卷曲乳杆菌处理时的吸光度与阴性对照组进行比较，并转换为显示抑制脱颗粒的水平的百分比。
作为结果，如在图1和表1中可见的，与阴性对照组相比，10种类型的卷曲乳杆菌菌株包括KBL693菌株显示出显著更低的β-氨基己糖苷酶分泌量，并且其中的9种类型显示出甚至低于阳性对照市售抗组胺剂酮替芬中的β-氨基己糖苷酶分泌量。作为结果，发现卷曲乳杆菌菌株包括KBL693菌株表现出优异的预防脱颗粒活性以有效地减轻由过度的组胺分泌引起的变应性症状。
【表1】
实施例2.由于抑制T细胞中Th2型细胞因子引起的KBL693对变应性反应的减轻和治疗作用
据报道，2型辅助T细胞(Th2)相关的细胞因子，例如IL-4和IL-5，通过提高Th2相关的免疫反应和提高IgE产生而促进慢性变应性反应(Passante E,Inflamm.Res.2009)。本发明试图进一步比较实施例1中对抑制组胺分泌显示出优异作用的卷曲乳杆菌菌株中对慢性变应性反应的抑制作用。为此，使用作为小鼠T细胞系的EL4细胞系如下测试抑制IL-4和IL-5的分泌的作用。
2-1.EL-4细胞系的孵育
将EL4(ATCC NO.TIB-39)细胞在补充有10％FBS、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中于37℃、5％CO2下培养，并随后每3天1次传代培养。将EL4细胞以4×105个细胞/孔的浓度接种到24孔板上，然后将其培养16至20小时以诱导变应性反应，并用菌株处理。
2-2.菌株的孵育和回收
将待使用的总共9种卷曲乳杆菌菌株(包括KBL693)(KBL693、KBL709、KBL702、KBL696、KBL708、KBL707、KBL692、KBL694和KBL706)在补充有0.5％半胱氨酸的MRS培养基中培养，通过18小时间隔下的总共2次传代培养使其活化，并随后将其用于实验中。将所得培养液以15,000×g离心3分钟，并用PBS缓冲液洗涤沉淀物。通过使用用于流式细胞术的LIVE/DEADTMBacLightTM细菌生存力和计数试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)将所述菌株用SYTO9和PI染色15分钟。然后，添加所包含的珠，并且通过使用流式细胞术测定来计算被染色的活细菌的数目。
2-3.诱导变应性反应之后的菌株处理以及IL-4和IL-5分泌量的测量
为了在先前接种到24孔板上的EL4细胞中诱导变应性反应，将每个孔用100μL的PMA(20ng/mL)和离子霉素(1μg/mL)进行处理。然后，以1:10的细胞与菌株的比率对300μL先前制备的菌株进行处理。在5％CO2培养箱中于37℃下孵育24小时之后，收集上清液，并使用Mouse IL-4ELISA set(目录号555232，BD OptEIATM)和Mouse IL-5ELISA set(目录号555236，BD OptEIATM)，根据制造商的方法测量分泌的IL-4和IL-5的量。
作为结果，如图2和3中所示，那些卷曲乳杆菌菌株通常显示出对IL-4和IL-5分泌抑制的作用，并且在那些中尤其是在菌株KBL693中，发现最低的IL-4分泌量，并且发现第二低的IL-5分泌量。因此，发现KBL693可通过抑制介导变应性反应的Th2型细胞因子的分泌而对变态反应提供治疗性和预防性作用。
实施例3.由于IgE抑制引起的KBL693对变应性反应的减轻和治疗的作用
免疫球蛋白E(IgE)是一种类型的免疫球蛋白，并且已知其参与变应性疾病的发展。一般而言，测量血清中IgE的总量作为用于诊断变应性疾病的最优先方法之一。因此，本发明试图通过使用作为人B细胞系的U266B1细胞系来验证KBL693对IgE分泌的抑制作用。
3-1.U266B1细胞系的孵育
将U266B1(ATCC NO.TIB-196)细胞在补充有10％FBS、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2下培养，并随后每3天1次传代培养。将U266B1细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种到24孔板上，然后将其培养16至20小时以诱导炎性反应，并随后从而用菌株处理。
3-2.菌株的孵育和回收
待用于本实验的菌株以与实施例2-2相同的方式制备。
3-3.诱导变应性反应之后的菌株处理以及IgE分泌量的测量
为了在先前接种到24孔板上的U266B1细胞中诱导变应性反应，将每个孔用100μL的LPS(10μg/mL)和IL-4(5ng/mL)进行处理。然后，以1:10的细胞与菌株的比率对300μL先前制备的菌株进行处理。在5％CO2培养箱中于37℃下孵育48小时之后，收集上清液，并使用Human IgE ELISA试剂盒(目录号E88-108，Bethyl Laboratories)，根据制造商的方法进行测量。
作为结果，如图4中所示，确定了与阴性对照组相比，用7种卷曲乳杆菌菌株包括KBL693处理的组显示出对IgE分泌抑制的作用。本实验表明，KBL693可通过抑制IgE(参与变应性反应的主要因子)对变应性疾病提供治疗性和预防性作用。
实施例4.KBL693的免疫调节和炎症抑制作用的分析
除其抗变应性效力之外，还验证了KBL693的免疫调节和炎性抑制作用。为此，通过使用在炎性反应中发挥关键作用的巨噬细胞测量具有免疫调节功能的代表性细胞因子IL-10与作为炎性反应的主要指标的细胞因子TNF-α和IL-6之间的比率(IL-10/TNF-α、IL-10/IL-6)。
4-1.RAW264.7细胞系的孵育
将RAW264.7(ATCC NO.TIB-71)细胞在补充有10％FBS、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中于37℃、5％CO2下培养，并随后将其每3天1次传代培养。将孵育的RAW264.7细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种到24孔板上，然后将其培养16至20小时，并随后用于实施例4-3。
4-2.菌株的孵育和样品的制备
将培养液用相同数目的活细菌进行校正，并随后将其制备为3个样品：活细菌、巴氏灭菌和热灭活(heat kill)。根据与实施例2-2中的相同方法制备用于活细菌、巴氏灭菌和热灭活的样品。
然后，将用于巴氏灭菌的样品在70℃下反应30分钟，并通过相同的离心过程制备。将热灭活的样品在121℃下灭菌15分钟，并通过相同的过程制备。作为阴性对照组，使用补充有0.5％半胱氨酸的MRS培养基。
4-3.诱导炎性反应之后的菌株处理和分泌的炎性细胞因子的量的测量
为了在先前接种到24孔板上的RAW264.7细胞中诱导炎性反应，将每个孔均用500μL的LPS(20ng/mL)处理。然后，以1:10的细胞与菌株的比率对300μL先前制备的菌株进行处理，并将其在5％CO2培养箱中于37℃下孵育24小时。收集经培养的细胞株混合物中的上清液，并使用Mouse TNF ELISA Set II(目录号558534，BD OptEIATM)、Mouse IL-6ELISA Set(目录号555240，BD OptEIATM)和Mouse IL-10ELISA Set(目录号555252，BD OptEIATM)，根据制造商的方法测量每种细胞因子的量。
作为结果，如图5中所示，确定了在卷曲乳杆菌菌株中，尤其是KBL693诱导IL-10分泌，并因此在免疫调节和炎性反应抑制方面显示出优异的作用。如图6和7中所示，根据用促炎细胞因子TNF-α和IL-6校正的分泌IL-10的能力，确定了与对照组相比，KBL693处理组显示出更加增强的炎症抑制作用以及免疫调节能力。因此，发现了KBL693通过IL-10分泌具有免疫调节和炎症抑制活性。另外，这些作用不仅在活细菌中，而且在经巴氏灭菌或经热灭活的死体中也同样得到确定(参见表2和表3)，表明KBL693可以以多种形式(例如死菌)用于调节免疫和抑制炎性反应。
【表2】
N.D.:未确定
【表3】
N.D.:未未确定
实施例5.KBL693的抗真菌作用的分析
KBL693的抗真菌作用通过斑点测定方法来确定。将约1％的KBL693接种在MRS液体培养基上，并随后将其在厌氧条件下于37℃培养箱中孵育约24小时以进行静置培养。每次以10μL的量将在其中孵育细胞的培养液点样(spot)到在厌氧条件下制备的MRS固体培养基中，并随后将其在37℃下于厌氧条件下孵育约24小时。糠秕马拉色菌KCTC 7545(一种真菌微生物)是通过将其以1％的比率接种于在有氧条件下制备的mYPG液体培养基中并随后在37℃培养箱中孵育约24至48小时来制备的。用示于表4中的组分来制备待用于抗真菌效力评价的mYPG软培养基，并将2.5mL制备好的培养基与在其中孵育500μL糠秕马拉色菌(Mfurfur)的培养液一起接种。将接种有糠秕马拉色菌的2.5mL的mYPG软培养基倒入到点样有KBL693的MRS培养基中，并干燥1小时。将经干燥的培养基在有氧条件下在37℃培养箱中孵育24至48小时。当在培养基中鉴定出透明区(clear zone)时，通过测量从所点样的乳酸菌的外部到透明区的长度来确定抗真菌活性。透明区是其中真菌生长受到抑制的部分，并且通过到透明区的长度来确定由乳酸菌引起的抗真菌活性。
作为三个重复实验的结果，在点样有KBL693的部分在约4.33mm的间隔处鉴定出透明区(图8)，这表明KBL693可有效地抑制真菌微生物的生长。
【表4】
组分 比例(g/L)
麦芽提取物 5.0
蛋白胨 10.0
葡萄糖 20.0
吐温40 1.0
吐温80 1.0
琼脂 4.5
实施例6.KBL693对减轻特应性病症的作用
基于对体外筛选测试结果的综述，通过选择具有最优异免疫调节作用的卷曲乳杆菌KBL692、KBL693和KBL702进行了动物试验。为了验证对KBL693的变态反应改善作用中的特应性减轻的作用，使用了NC/Nga小鼠模型，其是特应性皮肤病的动物模型。
在将NC/Nga小鼠分成5只小鼠的组之后，将每只小鼠的背从下耳至上尾脱毛，并将小鼠放置24小时。然后，一周两次将200μL的1％DNCB(二硝基氯苯)溶液(丙酮:橄榄油＝3:1)施加到经脱毛部分，以诱导特应性皮炎。自皮炎诱导的第三周起，每天向对照组中的小鼠经口施用200μL的PBS；将经培养的受试菌株离心，通过具有PBS的稀释物洗涤并回收，并随后进行制备以使得可将至少2×109CFU添加至200μL的PBS，将其以200μL/天经口施用于测试组中的小鼠。同时，向阳性对照组中的小鼠施用200μL的地塞米松(dexamethasone，60μg/mL)。然后，在施用细菌的三周期间，每周测量对照组和测试组中小鼠的皮炎评分，并且在施用细菌之后的第3周时，测量小鼠的抓挠时间和皮肤厚度。
6-1.皮炎评分的评价
为了评价经DNCB诱导的皮肤病变，通过以下方法测量皮炎评分。自施用菌株以来的第3周起，通过以1周间隔拍照来监测皮肤状况，持续3周。检查皮肤的干燥、水肿、红斑/出血(erythema/hemorrhage)和糜烂/脱落(erosion/excoriation)四个指标。并且，将不具有病变的状况评分为0分，轻度状况评分为1分，中度状况评分为2分，并且严重状况评分为3分，并对总评分进行评价。
作为结果，如图9中所示，与在其中诱导了特应性皮炎的对照组(阴性)以及用其他卷曲乳杆菌菌株给药的组相比，在用KBL693给药的组中，由DNCB诱导的皮炎评分显著降低。作为结果，验证了根据KBL693的施用治疗特应性皮炎的作用。
6-2发痒缓解作用
为了验证根据KBL693的施用在患有由DNCB诱导的特应性皮炎的小鼠模型中减轻发痒的作用，在3周的菌株施用之后通过拍摄持续10分钟的小鼠模型视频来测量抓挠时间。
作为结果，如在图10中可见的，显示出与在其中诱导了特应性皮炎的对照组(阴性)以及用其他卷曲乳杆菌菌株给药的组相比，在施用了KBL693的测试组中，抓挠时间显著降低，这确定了通过施用KBL693大大减轻了特应性皮炎的发痒症状。
6-3.皮肤厚度的降低
为了验证在向患有由DNCB诱导的特应性皮炎的小鼠模型施用KBL693之后减轻发痒的作用，在施用菌株之后3周，用卡尺(caliper)测量小鼠的耳厚度和背皮肤厚度，并观察到由于特应性皮炎引起的水肿症状的缓解。
作为结果，如在图11和12中可见的，观察到在用KBL693给药的测试组和阳性对照组中，耳厚度和背皮肤厚度均显著降低。在图11和12中，693-7、693-8和693-9，分别意指这样的测试组，制备KBL693以使得可将至少2×107、2×108和2×109CFU添加至200μL的PBS，将其以200μL/天经口施用于测试组中的小鼠。
实施例7.KBL693在经卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘的小鼠模型中对哮喘的治疗和预防作用
为了验证KBL693(LC206)对变应性哮喘的作用，如下制备经OVA诱导的哮喘的小鼠模型，进行组织病理检查并评估IL-5和IL-13的表达水平。
7-1.经OVA诱导的哮喘的小鼠模型的制备
使平均重量为约15g的5周龄Balb/c小鼠适应1周，并随后选择在基础体格检查中未显示出异常的小鼠。如图13(A)中所示，将待使用的小鼠分类为正常对照组(对照组-PBS；未施用或吸入OVA；n＝8)、哮喘诱导的对照组(OVA-PBS；施用或吸入了OVA；n＝9)以及测试组(OVA-LC206；n＝8)。在从实验开始的第31天将小鼠处死之前，每天向正常对照组和哮喘诱导的对照组经口施用200μL PBS，并每天向测试组经口施用在PBS中稀释为至少2×109CFU/0.2mL的200μL KBL693。
分别在适应1周之后的1周后(D7)和3周后(D21)，通过向小鼠腹膜内注射其中混悬了2mg氢氧化铝(ImjectTMAlum Adjuvant，Thermofisher)和20μg OVA(卵清蛋白，Sigma-aldrich)的200μL磷酸缓冲液(pH 7.4)来进行致敏。从实验开始的第28天至第30天，通过鼻内施用使1％的OVA吸入肺(3次攻击)。在最后攻击之后经过24小时(D31)时施用戊巴比妥，并随后进行支气管切口以收集肺组织样品。
7-2.组织病理学检查
可在其中处理抗原的支气管中观察到由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞组成的炎性细胞的浸润。因此，为了验证KBL693对哮喘的作用，进行实施例7-1中获得的每组肺组织样品的组织病理学检查。将实施例7-1中获得的肺组织样品通过常规的经福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded，FFPE)组织切片程序制备成4μm厚的组织切片，并随后将其用苏木精和伊红Y(Eosin Y；ThermoShandon，Pittsburgh，PA)进行H&E染色。在H&E染色之后，用光学显微镜观察各组的组织切片(图13(B))。
作为结果，如图13(B)中所示，在哮喘诱导的对照组(OVA-PBS)中，许多炎性细胞包括嗜酸性粒细胞浸润到细支气管周围，并且还发现过度增殖的上皮细胞和增厚的支气管平滑肌。在另一方面，在用KBL693给药的测试组(OVA-LC206)中，炎性细胞包括嗜酸性粒细胞的浸润显著降低，支气管组织的厚度降低，并且上皮细胞几乎未受损。作为结果，确定了KBL693对经OVA诱导的变应性哮喘的治疗作用。
7-3.总IL-5和总IL-13的表达水平的测定
使用流式细胞仪(LSRFortessa X-20，BD)以评价来自从每组收集的肺组织样品的肺中的免疫细胞。为了对IL-5+CD4+T、IL-13+CD4+T细胞进行染色，使用针对数种标志物的抗体(抗小鼠CD45，BioLegend；抗小鼠CD3ε，BD；抗小鼠/人IL-5，BioLegend；抗小鼠IL-13，Invitrogen)。通过对具有CD45和CDε作为标志物的淋巴细胞中产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5+和IL-13+细胞(图14)。
作为结果，如图14中所示，发现与正常对照组(PBS)相比，哮喘诱导的对照组(OVA-PBS)的小鼠中的IL-5和IL-13水平均显著提高，而与哮喘诱导的对照组相比，用KBL693给药的测试组(OVA-KBL693)的小鼠中的总IL-5和总IL-13水平均显著降低。因此，发现本发明的KBL693可通过抑制作为介导变应性反应的Th2型细胞因子的IL-5和IL-13的分泌来提供对变应性哮喘的治疗性和预防性作用。
实施例8.KBL693在经屋尘螨(HDM)诱导的哮喘模型中对哮喘的治疗和预防的作用
屋尘螨是作为外源性哮喘的主要原因的变应原。为了验证KBL693对变应性哮喘的作用，如下制备经HDM诱导的哮喘的小鼠模型，评价气道超敏反应，并且确定CD45+细胞中嗜酸性粒细胞的比例，CD4+T细胞中IL-5+CD4 T细胞的比例以及CD4+T细胞中IL-13+CD4 T细胞的比例。
8-1.经HDM诱导的哮喘的小鼠模型的制备
使平均重量为约15g的5周龄Balb/c小鼠适应1周，并随后选择在基础体格检查中未显示出异常的小鼠。将待使用的小鼠分类为正常对照组(对照-PBS；未施用HDM)、哮喘诱导的对照组(HDM-PBS；施用了HDM)以及测试组(HDM-KBL693)，并且将5只小鼠/每组用于评价气道高反应性(AHR)，并将8只小鼠/每组用于评价肺中的免疫细胞。
在适应1周之后的1周后(D7)，通过向小鼠鼻内施用其中混悬了10μg HDM(Housedust mite,Greer)的50μL磷酸缓冲液(pH 7.4)来进行致敏。自致敏之后1周，通过鼻内施用使其中混悬了10μg HDM的50μL磷酸缓冲液吸入肺，持续5天(D14至D18)(5次攻击)。在最后攻击之后经过24小时(D19)时施用戊巴比妥，并随后评价气道高反应性(AHR)(实施例8-2)，以及进行支气管切口以收集肺组织样品。
8-2.AHR(airway hyperresponsiveness)的评价
将通过施用戊巴比妥麻醉的小鼠与AHR仪(FinePointe Resistance andCompliance，DSI-Buxco)连接，并向其施用溶解于PBS中的不同浓度的乙酰甲胆碱(0、5、10、20和40mg/mL)。然后，通过测量通过气道的空气体积来计算AHR值(图15)。
作为结果，如图15中所示，确定了随着乙酰甲胆碱浓度提高，正常对照组(CTRL)中AHR(RL)缓慢提高，而哮喘诱导的对照组(HDM)中AHR迅速提高。在另一方面，在乙酰甲胆碱的全部浓度中，与哮喘诱导的组(HDM)相比，在用KBL693给药的测试组(HDM+KBL693)中，AHR显著降低。当与用低浓度的乙酰甲胆碱相比用高浓度的乙酰甲胆碱施用时，这种差异更明显。因此，发现KBL693可有效抑制引起哮喘的AHR，并因此可有效地用于治疗和预防变应性哮喘。
8-3.CD45+细胞中嗜酸性粒细胞的比例、CD4+T细胞中IL-5+CD4 T细胞的比例以及CD4+T细胞中IL-13+CD4 T细胞的比例的确定
使用流式细胞仪(LSRFortessa X-20，BD)以评价肺中的免疫细胞。为了对嗜酸性粒细胞和IL-5+CD4+T、IL-13+CD4+T细胞进行染色，使用针对数种标志物的抗体(抗小鼠CD45，BioLegend；大鼠抗小鼠Siglec-F，BD；抗小鼠CD11b，BD；抗小鼠CD3ε，BD；抗小鼠TCRβ，BioLegend；抗小鼠CD4，BioLegend；抗小鼠/人IL-5，BioLegend；抗小鼠IL-13，Invitrogen)。通过对表达常见白细胞标志物CD45的细胞中的Siglec-f+CD11b+细胞进行计数来确定嗜酸性粒细胞，并且通过对具有CDε、TCRβ和CD4作为标志物的CD4+T细胞中的产生IL-5或IL-13的细胞进行计数来确定IL-5+CD4+T、IL-13+CD4+T细胞(图16)。
作为结果，如图16中所示，确定了与正常对照组(PBS)相比，在哮喘诱导的对照组(HDM)的情况下，免疫细胞，即嗜酸性粒细胞、IL-5+CD4 T细胞和IL-13+CD4 T细胞的比例均显著提高，而与哮喘诱导的对照组相比，在用KBL693给药的测试组(HDM+KBL693)的情况下，嗜酸性粒细胞、IL-5+CD4 T细胞和IL-13+CD4 T细胞的比例均显著降低。因此，发现KBL693可通过抑制炎性细胞，即嗜酸性粒细胞、IL-5+CD4 T细胞和IL-13+CD4 T细胞来提供对变应性哮喘的治疗性和预防性作用。
以上已经详细描述了本发明的一些特定方面，并且对于本领域技术人员而言明显的是，这些特定方面仅是一些优选的实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围实质上由所附权利要求书以及权利要求书的等同方案限定。
保藏组织的名称：韩国生命科学与生物技术研究所
登记号：KCTC13519BP
登记日期：20180427
工业实用性
根据本发明的卷曲乳杆菌KBL693菌株(登记号KCTC 13519BP)减弱了细胞的变应性反应，显著改善了特应性皮炎的症状，并且表现出抗炎、免疫调节和抗真菌作用。因此，仅单菌株就可实现减轻变应性疾病以及改善炎性疾病和自身免疫病的所有目的，从而找到作为益生菌物质的有利应用。另外，所述菌株基于其抗真菌活性可有利地用于针对由真菌引起的多种皮肤病的皮肤外用制剂中，以及用于减轻敏感性皮肤的化妆品组合物和功能性贴剂中。
独立文本的序列表
所附电子文件
保藏微生物或其他生物材料的证明
(PCT细则13bis)
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表PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月重印)。
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cgcggggtgg cgcgagctat aatgcagtcg agcgagcgga actaacagat ttacttcggt 60
aatgacgtta ggaaagcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac ctgccccata 120
gtctgggata ccacttggaa acaggtgcta ataccggata agaaagcaga tcgcatgatc 180
agcttttaaa aggcggcgta agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt 240
tggtaaggta aaggcttacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa 420
gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa 480
ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc 600
ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatctag tgccatttgt agagatacaa agttcccttc 1020
ggggacgcta agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttat tagttgccag cattaagttg ggcactctaa 1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagtacaac gagaagcgag cctgcgaagg 1260
caagcgaatc tctgaaagct gttctcagtt cggactgcag tctgcaactc gactgcacga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtct gcaatgccca aagccggtgg cctaaccttc 1440
ggaaggagcc gtctaagtag acaatgtgca 1470

Claims (8)

1.卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)KBL693菌株，其保藏编号为KCTC 13519BP。
2.饲料组合物，其包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、以及所述菌株的裂解物。
3.抗真菌组合物，其包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、以及所述菌株的裂解物。
4.皮肤外用制剂，其包含根据权利要求3所述的抗真菌组合物。
5.医用贴剂，其用于改善皮肤变态反应、皮肤荨麻疹、特应性皮炎、银屑病、霉菌感染或湿疹，所述医用贴剂包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、以及所述菌株的裂解物。
6.药物组合物，其用于治疗变应性疾病、炎性疾病或自身免疫病，所述药物组合物包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、以及所述菌株的裂解物。
7.化妆品组合物，其包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、以及所述菌株的裂解物。
8.根据权利要求7所述的化妆品组合物，其中所述化妆品组合物是化妆品贴剂。
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