JP4726109B2 - 皮膚外用剤、それを用いる皮膚有害微生物の付着予防方法及び増殖防止方法 - Google Patents
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Description
さらに詳しくいえば、本発明は、特にラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する微生物により生産され、細胞外マトリックスへの付着性を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤、その皮膚外用剤を用いる皮膚有害微生物の付着予防方法、及び皮膚有害微生物の増殖防止方法に関する。
また、本発明は、特定のタンパク質、またはそのタンパク質をコードするDNAにより形質転換された微生物により生産されたタンパク質を含有することを特徴とする皮膚外用剤、その皮膚外用剤を用いる皮膚有害微生物の付着予防方法、及び皮膚有害微生物の増殖防止方法に関する。
しかしながら、このように単に皮膚付着性を有する微生物やその抽出物を適用すると、有害菌のみでなく正常皮膚上の有益な常在微生物にまで排除作用が及ぶことになり、健全な皮膚常在菌のバランスを損ない、様々な常在菌の相互作用をも含めて成立している皮膚のバリア機能をかえって低下させる可能性があった。
2.微生物が、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、エシェリヒア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、アエロモナス(Aeromonas)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ヘリコバクター(Helicobacter)属、カンピロバクター(Campylobacter)属、及びエルシニア(Yersinia)属に属する微生物から選択される前記1に記載の皮膚外用剤。
3.タンパク質が、配列番号1に示すアミノ酸配列、または配列番号1示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を用いることを特徴とする、前記1に記載の皮膚外用剤。
4.タンパク質が、配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA、または配列番号1示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするDNAにより形質転換された微生物により生産されたものであることを特徴とする前記1に記載の皮膚外用剤。
5.細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質が、ラクトバチルス・クリスパトゥス(Lactobacillus crispatus)より得られるものである前記1に記載の皮膚外用剤。
6.細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質が、ラクトバチルス・クリスパトゥス(Lactobacillus crispatus)JCM5810より得られるものである前記5に記載の皮膚外用剤。
7.前記1ないし4のいずれかに記載の皮膚外用剤を用いることを特徴とする皮膚有害微生物の付着予防方法。
8.前記1ないし4のいずれかに記載の皮膚外用剤を用いることを特徴とする皮膚有害微生物の増殖防止方法。
9.ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、エシェリヒア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、アエロモナス(Aeromonas)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ヘリコバクター(Helicobacter)属、カンピロバクター(Campylobacter)属、及びエルシニア(Yersinia)属に属する微生物の培養菌体より尿素及び/または塩酸グアニジンにより可溶化抽出する工程を含むことを特徴とする細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤の製造方法。
10.細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質を、配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA、または配列番号1に示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするDNAにより形質転換された微生物の培養菌体より、尿素及び/または塩酸グアニジンにより可溶化抽出する工程を含む前記9に記載の細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤の製造方法。
本発明において、「細胞外マトリックス」とは、一般的に知られる細胞外マトリックス、すなわち、コラーゲン、エラスチンなどの構造タンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着性タンパク質、ヒアルロン酸やコンドロイチンなどのグリコサミノグリカン、これらの複合体であるプロテオグリカン等、動物組織中の細胞の外側に存在する構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子、及びその複合体を指す。本発明において、皮膚外用剤に適用される細胞外マトリックス付着性タンパク質は、皮膚有害菌が付着対象とする細胞外マトリックスに対し付着性を有するものであれば特に限定されないが、目的上、皮膚やその直下の組織に存在する細胞外マトリックス成分であるコラーゲン、エラスチン、ラミニン、ヒアルロン酸、特に、皮膚や皮下組織に多く存在する細胞外マトリックス成分であるI型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲン、エラスチンに対し付着性を有するものであることが好ましい。
このような成分としては、例えば、オゾケライト、α−オレフィンオリゴマー、軽質イソパラフィン、軽質流動イソパラフィン、スクワレン、スクワラン、合成スクワラン、植物性スクワラン、セレシン、パラフィン、ポリエチレン末、ポリブテン、マイクロクリスタリンワックス、流動イソパラフィン、流動パラフィン、ミネラル油、ワセリン等の炭化水素類;
バチルアルコール、キミルアルコール、セラキルアルコール、イソステアリルグリセリルエーテル等のアルキルグリセリルエーテル類;
マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、グルコース、ショ糖、果糖、乳糖、マルトース、キシロース、トレハロース等の糖類;
ヤシ油脂肪酸カリウム、ヤシ油脂肪酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸トリエタノールアミン、ラウリン酸カリウム、ラウリン酸ナトリウム、ラウリン酸トリエタノールアミン、ミリスチン酸カリウム、ミリスチン酸ナトリウム、ミリスチン酸イソプロパノールアミン、パルミチン酸カリウム、パルミチン酸ナトリウム、パルミチン酸イソプロパノールアミン、ステアリン酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸トリエタノールアミン、オレイン酸カリウム、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油脂肪酸ナトリウム、ウンデシレン酸亜鉛、ラウリン酸亜鉛、ミリスチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、パルミチン酸亜鉛、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ミリスチン酸カルシウム、ミリスチン酸マグネシウム、ジミリスチン酸アルミニウム、イソステアリン酸アルミニウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、イソステアロイル乳酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシン、ヤシ油脂肪酸サルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸サルコシントリエタノールアミン、ラウロイルサルコシン、ラウロイルサルコシンカリウム、ラウロイルサルコシントリエタノールアミン、オレオイルサルコシン、ミリストイルサルコシンナトリウム、ステアロイルグルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸アシルグルタミン酸、ヤシ油脂肪酸アシルグルタミン酸カリウム、ヤシ油脂肪酸アシルグルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸アシルグルタミン酸トリエタノールアミン、ラウロイルアシルグルタミン酸、ラウロイルアシルグルタミン酸カリウム、ラウロイルアシルグルタミン酸ナトリウム、ラウロイルアシルグルタミン酸トリエタノールアミン、ミリストイルアシルグルタミン酸、ミリストイルアシルグルタミン酸カリウム、ミリストイルアシルグルタミン酸ナトリウム、ステアロイルアシルグルタミン酸、ステアロイルアシルグルタミン酸カリウム、ステアロイルアシルグルタミン酸二ナトリウム、硬化牛脂脂肪酸アシルグルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸・硬化牛脂脂肪酸アシルグルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルアラニンナトリウム、ラウロイルメチルアラニン、ラウロイルメチルアラニンナトリウム、ラウロイルメチルアラニントリエタノールアミン、ミリストイルメチルアラニンナトリウム、ラウロイルメチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンカリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンマグネシウム、ミリストイルメチルタウリンナトリウム、パルミトイルメチルタウリンナトリウム、ステアロイルメチルタウリンナトリウム、オレオイルメチルタウリンナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム、テトラデセンスルホン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、ヤシ油脂肪酸エチルエステルスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、セチル硫酸ナトリウム、アルキル(11,13,15)硫酸トリエタノールアミン、アルキル(12,13)硫酸ナトリウム、アルキル(12,13)硫酸トリエタノールアミン、アルキル(12,14,16)硫酸アンモニウム、アルキル(12〜13)硫酸ジエタノールアミン、アルキル(12〜14)硫酸トリエタノールアミン、アルキル(12〜15)硫酸トリエタノールアミン、ヤシ油アルキル硫酸マグネシウム・トリエタノールアミン、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸カリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸モノエタノールアミン、ラウリル硫酸ジエタノールアミン、ミリスチル硫酸ナトリウム、ステアリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン(1)アルキル(11,13,15)エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(1)アルキル(11,13,15)エーテル硫酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレン(3)アルキル(11〜15)エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(2)アルキル(12,13)エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(3)アルキル(12〜14)エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(3)アルキル(12〜15)エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(2)ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン(3)ミリスチルエーテル硫酸ナトリウム、高級脂肪酸アルカノールアミド硫酸エステルナトリウム、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、セチルリン酸カリウム、セチルリン酸ジエタノールアミン、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンセチルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンセチルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン(10)アルキル(12,13)エーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキル(12〜15)エーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキル(12〜16)エーテルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸ジエタノールアミン等の陰イオン界面活性剤;
エチルアミノエチルアミド、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウムサッカリン、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化アルキル(20〜22)トリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化アルキル(16,18)トリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウムサッカリン、塩化アルキル(28)トリメチルアンモニウム、塩化ジ(ポリオキシエチレン)オレイルメチルアンモニウム(2EO)、塩化ジポリオキシエチレンステアリルメチルアンモニウム、塩化ポリオキシエチレン(1)ポリオキシプロピレン(25) ジエチルメチルアンモニウム、塩化トリ(ポリオキシエチレン)ステアリルアンモニウム(5EO)、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジアルキル(12〜15)ジメチルアンモニウム、塩化ジアルキル(12〜18)ジメチルアンモニウム、塩化ジアルキル(14〜18)ジメチルアンモニウム、塩化ジココイルジメチルアンモニウム、塩化ジセチルジメチルアンモニウム、塩化イソステアリルラウリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルジメチル(エチルベンジル)アンモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ラウロイルコラミノホルミルメチルピリジニウム、塩化ステアロイルコラミノホルミルメチルピリジニウム、臭化アルキルイソキノリウム、塩化メチルベンゼトニウム、塩化ベンゼトニウム等の陽イオン界面活性剤;
ウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン(3,7,12)アルキル(12〜14)エーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル、ポリオキシエチレン−sec−アルキル(14)エーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(2,10,20)イソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルセチルエーテル、ポリオキシエチレン(20)アラキルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンジノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン(1)ポリオキシプロピレン(1,2,4,8)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(5)ポリオキシプロピレン(1,2,4,8)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(10)ポリオキシプロピレン(1,2,4,8)セチルエーテル、ポリオキシエチレン(20)ポリオキシプロピレン(1,2,4,8)セチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン(3)ポリオキシプロピレン(34)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(4)ポリオキシプロピレン(30)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン(34)ポリオキシプロピレン(23)ステアリルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、エチレングリコール脂肪酸エステル、自己乳化型モノステアリン酸エチレングリコール、ラウリン酸ジエチレングリコール、ミリスチン酸ポリエチレングリコール、パルミチン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ジエチレングリコール、自己乳化型モノステアリン酸ポリエチレングリコール(2)、イソステアリン酸ポリエチレングリコール、ジオクタン酸エチレングリコール、ジラウリン酸ジエチレングリコール、ジラウリン酸ポリエチレングリコール、ジパルミチン酸ポリエチレングリコール(150)、ジステアリン酸エチレングリコール、ジステアリン酸ジエチレングリコール、ジステアリン酸ポリエチレングリコール、ジオレイン酸エチレングリコール、ジオレイン酸ポリエチレングリコール、ジリシノレイン酸ポリエチレングリコール、モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン(6)ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレン(6)ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、ポリオキシエチレン(20)ヤシ油脂肪酸ソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレン(10〜80)ソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、イソステアリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレン(150)ソルビタン、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン(10)硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン(20)硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン(40)硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン(50)硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン(60)硬化ヒマシ油、親油型モノステアリン酸グリセリン、親油型モノオレイン酸グリセリン、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、ヤシ油脂肪酸グリセリル、ラウリン酸グリセリン、ミリスチン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、リシノレイン酸グリセリル、モノヒドロキシステアリン酸グリセリル、オレイン酸グリセリン、リノール酸グリセリル、エルカ酸グリセリル、ベヘン酸グリセリル、小麦胚芽油脂肪酸グリセリド、サフラワー油脂肪酸グリセリル、水素添加大豆脂肪酸グリセリル、飽和脂肪酸グリセリド、綿実油脂肪酸グリセリル、モノイソステアリン酸モノミリスチン酸グリセリル、モノ牛脂肪酸グリセリド、モノラノリン脂肪酸グリセリル、セスキオレイン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、ジイソステアリン酸グリセリル、ジアラキン酸グリセリル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノイソステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、ヤシ油脂肪酸ソルビタン、イソステアリン酸ソルビタン、セスキイソステアリン酸ソルビタン、ジステアリン酸ソルビタン、イソパルミチン酸ジグリセリル、モノラウリン酸ポリ(4〜10)グリセリル、モノミリスチン酸ポリ(10)グリセリル、モノステアリン酸ポリ(2〜10)グリセリル、モノイソステアリン酸ポリ(2〜10)グリセリル、モノオレイン酸ポリ(2〜10)グリセリル、セスキオレイン酸ジグリセリル、ジイソステアリン酸ポリ(2〜10)グリセリル、ジステアリン酸ポリ(6〜10)グリセリル、トリイソステアリン酸ジグリセリル、トリステアリン酸ポリ(10)グリセリル、トリオレイン酸ポリ(10)グリセリル、テトライソステアリン酸ポリ(2)グリセリル、ペンタステアリン酸デカグリセリル、ペンタオレイン酸ポリ(6〜10)グリセリル、ヘプタステアリン酸ポリ(10)グリセリル、デカステアリン酸デカグリセリル、デカオレイン酸ポリ(10)グリセリル、縮合リシノレイン酸ポリ(6)グリセリル、ショ糖脂肪酸エステル、ヤシ油脂肪酸ショ糖エステル、アルキルグルコシド、ヤシ油アルキルジメチルアミンオキシド、ラウリルジメチルアミンオキシド、ジヒドロキシエチルラウリルジメチルアミンオキシド、ステアリルジメチルアミンオキシド、オレイルジメチルアミンオキシド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルアミンオキシド等の非イオン界面活性剤;
エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、等の金属イオン封鎖剤;
ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、ベタイン、乳酸菌培養液、酵母エキス、セラミド等の保湿剤;
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のpH調整剤;
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム等の塩類;
クエン酸、グリコール酸、酒石酸、乳酸等のα−ヒドロキシ酸類;
アルブチン、α−アルブチン、プラセンタエキス等の美白剤;
リモネン、ピネン、テルピネン、テルピノーレン、ミルセン、ロンギフィーレン等のテルペン類;
香料、水等が挙げられる。
これらの好ましい含有量は化粧料全量に対して0.01〜90質量%であり、より好ましくは0.1〜25質量%であり、さらに好ましくは0.3〜10質量%である。
MRS brothにて37℃で48時間培養したLactobacillus crispatus JCM5810(理化学研究所 微生物系統保存施設より分譲)の培養液50mLを、同培地500mLに接種継代し、37℃で48時間培養した。培養液を8,000×g、10分の遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を、塩酸グアニジン溶液(2M,100mL)に懸濁し、37℃で2時間撹拌した。懸濁液を10,000×g、10分の遠心分離に供し、上清を分取した。これを50倍容の蒸留水に対し2回透析し、得られた透析内液を凍結乾燥した。得られた乾燥物の一部を蒸留水に溶解し、Protein Assay DCキット(Bio-Lad社製)によりタンパク量を定量した。500mLの培養液より得られた産物はタンパク質量として15.3mgであった。これを細胞外マトリックス付着性タンパク質Aとして、以下の実験に供した。
MRS brothにて37℃で48時間培養した培養液100mLを、8,000×g、10分の遠心により回収、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM)で洗浄したLactobacillus crispatus JCM5810の菌体を、塩酸グアニジン溶液(6M,3mL)に懸濁し、20℃で20分撹拌した。菌体を8,000×g、10分の遠心により回収し、Tris緩衝液(pH8.2,20mM)で洗浄したのち、同緩衝液2.5mLに再懸濁した。ポリエチレングリコール20000(5mL)、リゾチーム溶液(2.5mL,4mg/mLに調製,Boehringer Mannheim社製)を加え、溶液を37℃で60分緩やかに振とうした。EDTA溶液(0.2M,5mL)を加えたのち、菌体を4℃下、3,000×g、15分の遠心により回収した。得られた菌体を、mutanolysin溶液(50μL,15,000U/mL,シグマ社製)を含むTris緩衝液(pH8.2,10mL)に懸濁し、37℃で1時間緩やかに振とうしたのち、9%ザルコシル(1.5mL,シグマ社製)、塩化ナトリウム溶液(5M,3mL)を加えて菌体を可溶化した。さらに過塩素酸ナトリウム(5M,2.9mL)を加えたのち、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)で抽出した。抽出後の溶液をエタノール沈殿に供し、得られた沈殿をゲノムDNAとし、以下の実験に用いた。
得られたゲノムDNAをテンプレートとして、GenBankアクセッションNo.AF001313に開示されている塩基配列に基づき、mature部分全長を含み、かつfowardの5'側には制限酵素BamHIサイト、またreverseの3'側、stopコドンの下流には制限酵素SacIサイトを含むようにプライマーを設計・合成し、PCR増幅反応を行った。
この形質転換株を、200mLのLB培地で35℃で24時間振とう培養したのち、終濃度1mMのIPTGを添加し更に6時間振とう培養した。培養菌体を遠心回収、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM)で洗浄したのち、塩酸グアニジン水溶液(6M,50mL)に再懸濁し、常温にて12時間撹拌した。この溶液を10,000×g、10分の遠心に供して上清を回収し、全量をアフィニティカラム(HiTrap Chelating HP,ベッド容量5mL,Amersham Bioscience社製)に通じた。
カラムをNaCl(0.1M)を含むリン酸ナトリウム緩衝液(50mM,pH8.0,50mL)で洗浄後、NaCl(0.1M)を含むリン酸ナトリウム緩衝液(50mM,pH4.0,50mL)を通じて、溶出液を順次5mL容×10点のフラクションに分画し、280nmの吸光度によりタンパク質溶出画分を回収した。回収されたタンパク質画分の一部、タンパク質量にして約10μg分を、SDS−ポリアクリルアミド(12%)電気泳動に供し、エレクトロブロッター(Electro-Blot Unit for 10×10cm Gel、フナコシ社製)を用いて、ProBlott PVDFメンブレン(Applied Biosystems社製)にブロッティングした。メンブレンをCBB染色し、主成分が約43キロダルトン付近のタンパク質であることを確認したのち、メンブレンの当該バンド部分を切り出し、Procise 494Aタンパク質シーケンサー(Applied Biosystems社製)により、マニュアルに従いN末端アミノ酸配列を解析した。得られたアミノ酸配列は配列番号2で示され、設計上の塩基配列を反映するものであった。
N- Asp Ala Val Val Ser Ser Ala Asn Asn Ser Asn Leu Gly C(配列番号2)
テフロンプリントスライドガラス(ER-208L、フナコシ社製)に、それぞれコラーゲンI、III、IV、V型、ラミニン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン(BSA)、フェチュイン(シグマ社製)の水溶液を2.5pmol/wellとなるように滴下し、風乾した。このスライドガラスを、2%BSAを含むリン酸ナトリウム緩衝液(50mM,pH7.0)に室温で2時間浸漬し、残存するスライドガラス表面をマスキングし、再度引き上げて風乾した。これをテストスライドとした。
Malassezia furfur NBRC 0656
凍結乾燥菌体
↓生理食塩水に懸濁
↓Modified Dixon’s agarに画線
↓静置培養30℃5日間
白金耳で掻き取り、リン酸緩衝液に懸濁し試験に供与
マルツエキス 36g
ペプトン 6g
胆汁末 20g
ツイーン40 10ml
グリセリン 2ml
オレイン酸 2ml
寒天 12g
/蒸留水1L pH6.0
凍結乾燥菌体
↓生理食塩水に懸濁
↓YM agarに画線
↓静置培養 25℃3日間
↓白金耳にてYM brothに接種
↓振盪培養 25℃18時間
↓遠心8,000rpm、10分
リン酸緩衝液に懸濁し試験に供与
実施例3と同様に調製したテストスライドを、マトリックス付着性タンパク質を除いた緩衝液で処理したのち、付着した菌体を実施例3と同様に計数し、その平均値を求めた。Malassezia furfur NBRC 0656の結果を図1に、Candida albicans NBRC 1594の結果を図2に示す。
Claims (8)
- 細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質であって、配列番号1に示すアミノ酸配列、または配列番号1示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤。
- タンパク質が、配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA、または配列番号1示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするDNAにより形質転換された微生物により生産されたものであることを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤。
- 細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質が、ラクトバチルス・クリスパトゥス(Lactobacillus crispatus)より得られるものである請求項1に記載の皮膚外用剤。
- 細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質が、ラクトバチルス・クリスパトゥス(Lactobacillus crispatus)JCM5810より得られるものである請求項3に記載の皮膚外用剤。
- 皮膚有害微生物の付着予防のための、請求項1ないし3のいずれかに記載の皮膚外用剤。
- 皮膚有害微生物の増殖防止のための、請求項1ないし3のいずれかに記載の皮膚外用剤。
- ラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する微生物の培養菌体より尿素及び/または塩酸グアニジンにより可溶化抽出する工程を含むことを特徴とする細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤の製造方法。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA、または配列番号1に示すアミノ酸配列の1個または数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするDNAにより形質転換された微生物の培養菌体より、尿素及び/または塩酸グアニジンにより可溶化抽出する工程を含むことを特徴とする細胞外マトリックスに付着性を有するタンパク質を含有する皮膚外用剤の製造方法。
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