WO2007138993A1

WO2007138993A1 - 免疫調節活性の高い乳酸菌の培養法

Info

Publication number: WO2007138993A1
Application number: PCT/JP2007/060665
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Sashihara; Keisuke Furuichi
Original assignee: Meiji Dairies Corporation
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2007-12-06
Also published as: CN101454439B; CN101454439A; TWI422681B; JP5314421B2; JPWO2007138993A1; HK1130284A1; TW200808960A; KR101355770B1; KR20090024175A

Abstract

　乳酸菌の培養条件がマウス脾細胞からのIL-12産生促進効果に及ぼす影響を鋭意検討した。その結果、前記乳酸菌の免疫機能調整活性に関係する因子として、特に培養液のpHが大きく関与することを見出し、本発明を完成させた。

Description

明細書

免疫調節活性の高い乳酸菌の培養法

技術分野

[0001] 本発明は、乳酸菌の免疫調節活性を高めるための培養方法、および該培養方法を用いた免疫機能調整剤の製造方法に関する。

背景技術

[0002] 気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患はここ数十年で急激な増加が認められ、現在、少なくとも人口のおよそ 1/5程度が何らかのァレルギ一疾患に罹患していると考えられている。現在のアレルギー治療薬の多くは対症療法的なものであり、罹患患者数の増大や長期使用に伴う副作用の点からも、より効果的な治療法が望まれている（非特許文献 1)。近年、二重盲検プラセボ試験において?し酸の一 C、める Lactobacillus rhamnosus GG株 (Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103株）の投与がハイリスク児におけるアトピー疾患の発症を約半分に抑制することが示されており（非特許文献 2)、乳酸菌の使用は副作用を伴わずアレルギ一を予防および/または治療するための手軽で有効な方法であると言える。このような乳酸菌の効果は、その 1つの理由としてマクロファージゃ樹状細胞などの自然免疫を担当する細胞に取り込まれた際に、 IL-12 (p70) (以降、 IL-12ともいう）の産生を誘導することに起因して!/、る（非特許文献 3)。

[0003] IL-12(p70)は未分化 T細胞を I型のヘルパー T細胞（以降、 Thl細胞とも!/、う）に分化するのを促進し、 Thl/Th2バランスを Thl側にシフトさせる（非特許文献 3)。 II型のへルパー T細胞（以降、 Th2細胞ともいう）側に偏った Thl/Th2バランスはアレルギー発症の原因と一つとなる抗原特異的な IgEの産生を誘導するため、自然免疫担当細胞から IL-12の産生を誘導し Thl/Th2バランスを改善する活性は菌株のアレルギー改善効果を評価する上で重要な指標の 1つとなる。このような乳酸菌の免疫調節活性は同属同種の菌でも株により大きく異なっており、高い免疫調節活性を有するプロバイォテイクス菌株のスクリーニングやその応用研究が精力的に行われて!/、る（非特許文献 4)。このような研究の結果、これまでに各種の乳酸菌を用いたアレルギー予防および/または治療剤が提案されている。し力、しながら、例えば特許文献 1に開示された乳酸菌（Lactobacillus paracasei KW3110株）については、 18種 100株以上の乳酸菌の中から IL-12産生促進効果および Thl/Th2バランス改善効果が高い菌株をスクリーユングしているが、その菌体の培養条件が免疫調節活性に与える影響は全く検討されていない。

[0004] 乳酸菌の菌株により作用やその活性の程度が異なること、またその有効成分を検討した報告は多々あるが、菌の培養条件によって免疫調節活性が異なるという報告例はわず力、 2報である。 Hallerらは、ヒト末梢血単球からの TNF- αの産生誘導効果は、対数増殖期より定常期の菌体の方が高いことを報告している（非特許文献 5)。一方、 in vivoにおいても Lactobacillus属乳酸菌の培養期により Thl/Th2バランスの誘導する活性が異なることが報告されている。 Massenらは、乳酸菌の免疫調節活性を検討するために、対数増殖期と定常期にある菌体をマウスに経口投与し、 Thl/Th2バランスを血中の IgG2a/IgGl比を測定することで検討した。その結果、定常期の菌体は対数増殖期にある菌体よりも Th2反応を誘導したことを報告している (非特許文献 6)。しかし、これらの報告は菌体の培養期により免疫調整活性が異なるという現象を示したのみで、培養時間のみが重要なのか、その他の環境要因が影響しているのかは全く検討されていない。菌体の培養条件が免疫調節活性に及ぼす影響を検討する事は、より免疫調節活性の高い菌体を製造するための工業生産を行う際の製造プロセスの決定に重要であると言える力現在までにこのような検討はされていない。このように既存の乳酸菌を用いて、目的とするアレルギー予防および/または治療剤、またはアレルギー予防および/または治療用食品組成物を調製する方法には未だ改良の余地が多く残されて!/、るのが現状である。

[0005] 特許文献 1：特許第 3585487号公報

非特許文献 1 :赤星光輝，玉利真由美，白川太郎、「アレルギー疾患における最近の話題」、最新医学、 58(2), pp.7-14(2003)

非特許文献 2： Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P, Isolauri E, "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-contr oiled trial.", Lancet, 357(9262)， pp.1076- 1079 (2001) 非特許文献 3 : Cross ML, Gill HS, "Can immunoregulatory lactic acid bacteria be us ed as dietary supplements to limit allergies?", International Arcnives of Allergy and Immunology, 125， pp.112- 119 (2001)

非特許文献 4： Lee J, Ametani A, Enomoto A, Sato Y, Motoshima H, Ike F, Kaminog awa S, "Screening for the immunopotentiating activity of food microorganisms and e nhancement of the immune response by Bifidobacterium adolescentis M101-4. ， Bio science Biotechnology and Biochemistry, 57(12), pp.2127-2132 (1993)

非特許文献 5 : Haller D, Bode C, Hammes P, "Cytokine secretion by stimulated mon ocytes depends on the growth phase ana heat treatment of bacteria: a comparative s tudy between lactic acid bacteria and invasive pathogens. ， Microbiology and Immun ology, 43(10)， pp.925-935 (1999)

非特許文献 6 : Maassen CB, Boersma WJA, van Holten-Neelen C, Claassen E, Lama n JD, 'Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgGl/IgG2a ratio for soluble antigens: implications for vaccine development.", Vacc ine、 21(21-22)， pp.2751-2757 (2003)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] すなわち、本発明の課題は、乳酸菌の免疫調整機能を高める培養方法および該培養方法を用いた免疫調整機能剤の製造方法を見出す事である。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明は上記課題を解決するためになされたものである。本発明者らは、すでに国際出願 WO2006/093022にて、 Lactobacillus gasseri属乳酸菌である Lactobacillus gas seri OLL2809 (以降、し gasseri OLL2809ともいう）株がアレルギーの予防や治療を始めとする免疫機能調整活性を有する事を報告しているが、さらに、乳酸菌の培養条件がマウス脾細胞からの IL-12 (p70)産生誘導活性に及ぼす影響を鋭意検討した。その結果、前記乳酸菌の免疫機能調整活性に関係する因子として、特に培養液の pH力 S大きく関与することを見出した。また、 Lactobacillus gasseriのみならず、 Lactoba cillus amylovorus (以降、 L. amylovorusともいつ)および Lactobacillus crispatus (以降、し crispatusともいう）など他の乳酸菌についても培養液の pHが免疫機能調整効果に関係する事も見出し、本発明を完成させた。

[0008] すなわち、本発明は、

[1] 乳酸菌を pH 3.5〜pH 5.0の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法、

[2]前記乳酸菌が IL-12産生促進効果を有する乳酸菌である、請求項 1に記載の免疫機能調整剤の製造方法。

[3] 前記乳酸菌がラクトバチルス属である、前記 [1]〜[2]のいずれ力、 1つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、

[4] 前記乳酸菌がラクトバチルス'ガセリ OLL2809菌株（Lactobacillus gasseri OLL 2809、受託番号 MTE BP-72)、 Lactobacillus amylovorus JCM 1126'および Lactobac illus crispatus JCM 1185^Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも 1つである、前記 [1]〜

[3]のいずれ力、 1つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、

[5] 前記 [1]〜[4]のいずれ力、 1つに記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤、

[6] 前記 [5]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用飲食品、

[7] 前記 [5]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用医薬品、

[8] 前記 [5]に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および/又は治療用医薬品もしくはアレルギー予防および/又は治療用飲食品の製造のための使用、を提供するものである。

発明の効果

[0009] 後述する実施例において示されるとおり、本発明に含まれる乳酸菌の培養方法により、乳酸菌の免疫調節活性を高める事が可能となった。また、該方法で培養した乳酸菌を利用した、高い活性を有する免疫機能調整剤の製造を実現した。これによつて、アレルギー予防および/または治療などに有効な、免疫調節活性の高い飲食品や医薬品を提供することもできる。

図面の簡単な説明 [0010] [図 1]培養時間によるし gasseri OLL2809の生育および IL-12産生促進効果の経時変化を示すグラフである。黒丸（譬）は OD 、棒はマウス脾細胞の培養液上清の IL-1

660

2 (p70) (pg/mL)を示す。 IL-12のデータは平均値土標準偏差 (n=3)で示す。 NT : not tested。

[図 2]培地および培地成分がし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果に及ぼす影響を示すグラフである。 MRS, GAMまたは GAM培地にグルコースを添加した培地でのし gasseri OLL2809の生育（A)、培養 18時間後の菌体の IL-12産生促進効果 (B) および IL-12産生促進効果（IL-12 (p70) (pg/mL))の平均値と培養 18時間後の pHの相関図（C)を示す。（A)において、黒丸（譬）： MRS培地、黒三角： GAM培地、黒四角： GAM培地 +グルコース（終濃度（培養前の培地における最終調整濃度） 5g/L)、白丸（〇）： GAM培地 +グルコース (終濃度 10g/L)、白三角（△)： GAM培地 +ダルコ一ス (終濃度 20g/L)。（B)において、横軸の数字は培地中のグルコース濃度（終濃度、も I L)を示す。また (B)については、平均値土標準偏差 (n=3)を示す。 * : pく 0.05 (Stude ntの反復測定 t検定）、 # : pく 0.05 (Dunnet検定)。

[図 3]pHを制御したし gasseri OLL2809の培養（A :生菌数 (log cib/mL)、 B : pH)および IL-12産生促進効果 (C)の経時変化を示すグラフである。（A)および (B)にお!/、て、黒丸（き）：設定 pH 4、黒三角：設定 pH 5、黒四角：設定 pH 6を示す。

[図 4]MRS培地への CaCOの添加がし amylovorus JCM 1126^Tおよびし crispatus JC

3

M 1185^Tの IL-12産生促進効果に及ぼす影響を示すグラフである。平均値土標準偏差 (n=3)を示す。 * : pく 0.05 (Studentの反復測定 t検定)。

[図 5]異なる pHの緩衝液中でインキュベートしたし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果の変化を示すグラフである。「加熱」は加熱処理サンプル、「非加熱」は非加熱サンプルを示す。 Controlは MRS培地で 18時間、静置培養し、 75°Cで 60分間加熱処理したし gasseri OLL2809の凍結乾燥菌末を示す。平均値土標準偏差 (n=3)を示す

〇

発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。 [0012] 本発明は、乳酸菌を有効成分として含有する免疫機能調整剤の製造方法に関するものである。本発明の製造方法には、乳酸菌のもつ免疫機能調整活性を効率よく得るための乳酸菌の培養方法が含まれる。本発明者らは、各種乳酸菌（し gasseri, L . amylovorusおよびし crispatus)について、各種培養条件における免疫機能調整活性をマウス由来脾臓細胞からの IL-12産生促進効果を指標に検討した。その結果、前記乳酸菌の免疫機能調整活性に関係する因子として、特に培養液の pHが大きく関与することを見出した。したがって、本発明の製造方法を使用することで食物ァレルギーを含めた各種のアレルギーの予防および/または治療に有効な、新たなァレルギ一予防および/または治療剤、またはこれを含有するアレルギー予防および/ または治療用食品組成物を提供することが可能になった。

[0013] 乳酸菌とはブドウ糖を資化して対糖収率で 50%以上の乳酸を生産する菌の総称で、生理学的性質としてグラム陽性菌の球菌または桿菌で、運動性なし、胞子形成能なし、カタラーゼ陰性などの特徴を有している。乳酸菌は植物の表皮、哺乳動物の腸管、海洋、土壌、発酵食品など様々な環境から分離され、漬け物や醤油などの発酵食品においては味やテクスチャーの形成に寄与するのみならず、乳酸やバクテリオシン等の抗菌性物質産生能を有して!/、ることから、古来より発酵乳等を介して世界各地で食されてきた。また、哺乳動物の腸管では宿主に種々の生理的影響を与えていることも周知の事実であり、極めて安全性の高い微生物と言える。乳酸菌は現在までに、 Lactococcus禹、 Lactobacillus j¾、 Leuconostocj ¾、 Pediococcus属、 Streptococcu s 禹、 Wissella属、 Tetragenococcus属、 Oenococcus属、 EnterococcusJ禹、 Vagococcus 属、 Carnobacterium属の 11属に分類されている。本発明の免疫機能調整剤の製造方法には、これらの乳酸菌を用いる事ができる。好適な例として Lactobacillus gasseri OLL2809株（受託番号： MTE BP-72)、 Lactobacillus amylovorus JCM 1126^Tおよび L actobacillus crispatus JCM 1185^Tを挙げることができる力これらの例に限定されない

〇

[0014] 本発明の製造方法においては、前記乳酸菌を、培地に摂取し、一定範囲の pHにて培養を行う。培養方法としては、バッチ培養、回分培養、流加培養、連続培養、嫌気培養、通気培養、振とう培養、静置培養、攪拌培養、試験管培養、タンク培養、フラスコ培養、フアーメンター培養、ジャーフアーメンター培養などいずれの方法でも培養することあでさる。

[0015] 本発明の製造方法に用いる乳酸菌培養用の培地としては、乳酸菌の培地に通常用いられる培地が使用される。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能である。炭素源としてはラタトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉加水分解物、廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホェイタンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤として肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が用いられる。巿販の培地としては、例えば Lactobacilli MRS Broth (ベタトンディッキンソン）、 GAM培地（日水製薬）等、あるいはさらに上述の成分を添加したものを培地として用いる事もできる力これらの例に限定されない。

[0016] 乳酸菌の培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよ!/、。嫌気培養には炭素ガス又は不活性ガス（窒素など）の通気下で培養する方法などの公知の手法を単独あるいは複数を組み合わせて適用することができる力他の方法でもかまわない。培養温度は一般に 20〜40°C が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養時間は通常 10〜24時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。

[0017] 菌体増殖の最適 pHは菌株によっても異なる力多くの乳酸菌では大まかには 5.5〜

7.0の囲 (James JA, Lee BH， Cultural conditions ror production of glucoamylase f rom Lactobacillus amylovorus ATCC 33621. ， J Appl Bacteriol、 79(5)， pp. 499- 505( 1995)、 Pettersson, Η_Ε·， "Studies on batch production of bacterial concentrates fro m mixed species lactic starters." Applied Microbiology. 1975. 29(2): 133-140.)であり、通常、工業生産においては最大の菌体量を得るために最適 pHで中和培養する方法が行われている。し力、しながら、効率よく IL-12産生促進効果の高い菌体を工業的に培養するための培養条件は、菌体量を効率よく得るための培養条件と異なっている事が考えられ、検討する必要があった。 [0018] 本発明の製造方法において、乳酸菌培養中の培地の pHは 3.5〜5.5、好ましくは 3.5 〜5.0、さらに好ましくは 4.5以下、例えば、 3.5—4.5, 3.5—4.4, 3.8—4.4, 4.0—4.5, 3 .5〜4.0等に維持することが好ましいが、

乳酸菌の免疫機能調整活性を高められるのであれば他の pH条件でもよい。また、培養前あるいは培養中に通常用いられる酸、塩基、緩衝剤、炭酸ガスなどの添加剤を適宜培地に添加して、培地の pHを調整しても力、まわない。また本発明の製造方法における pH調整は、乳酸菌が自ら産生する酸を利用することもでき、乳酸菌の酸産生を調整するためにグルコースなどの栄養成分を培地に強化してもよい。

[0019] 本発明の製造方法における pH調整は、培養工程を通じて一定となるよう調整してもよぐまたは培養工程の途中で pHを変更してもよい。例えば、乳酸菌の菌体量の増加に適切な pHで培養し、菌体量が増加した後に、乳酸菌の免疫機能調整活性を高めるのに適切な pHに変更して培養してもよい。工業的培養として中和培養を行う場合、一般的には、例えば、 pH5.5〜7程度に調整することが多い。本発明の製造方法は、乳酸菌をこのような pHで培養した後、本発明の乳酸菌の免疫機能調整活性を高めるのに適切な pHとなるよう、 pHを変更して培養をすることができる。

[0020] さらに上記の培養方法で培養した乳酸菌をそのままもしくは洗浄、濃縮、破砕、乾燥、発酵または加熱等の処理を加えて、本発明の免疫機能調整剤を完成させる。

[0021] 本発明の免疫機能調整剤は、上記培養方法で得た乳酸菌を種々の状態で含むことができ、例えば乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物 (菌体、培養上清液 (培地成分を含む））、乳酸菌発酵物 (乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等）、乳酸菌処理物、等として使用すること力 Sでさる。

[0022] 本発明の免疫機能調整剤としては培養終了後の乳酸菌培養液をそのまま、あるいは濃縮して濃縮物とするほか、濃縮物をさらに乾燥して使用できる。この菌体濃度は特に限定されないが、濃縮液で 4 X 10^1Q個/ g以上、乾燥物で 5 X 10¹¹個/ g以上とするのが好ましい。

[0023] 本発明の免疫機能調整剤は、上記培養方法で得た上記乳酸菌をそのまま含んでもよく、または乳酸菌に何らかの処理を施した乳酸菌処理物として含んでもよい。本発明に用いられる乳酸菌処理物としては、例えば乳酸菌、乳酸菌含有物、発酵乳の濃縮物、ペースト化物、乾燥物 (噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物から選ばれる少なくともひとつ）、液状物、希釈物、破砕物等が挙げられる。また、乳酸菌としては生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体等が適宜使用可能である。殺菌すなわち加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、または破砕処理等を施した死菌体であってもよい。粉ミルクなど生物学的規格を有する医薬品および/または飲食品においても添加することも可能であり、医薬品および/または飲食品の形態などによらず様々な医薬品および/または飲食品に応用できる。

[0024] し gasseri OLL2809は健常人の粪便から単離された 273株の Lactobacillus属乳酸菌から、 in vitroにおいてマウス脾細胞から IL-12産生を強く誘導し、 Thl/Th2バランスを改善することを特徴としてスクリーニングされた株である。また、本菌株をアレルギーモデルマウスに経口投与すると、脾細胞の IL-12産生を誘導し、脾細胞および腸間膜リンパ節細胞の IL-4産生を抑制し、 Thl/Th2バランスを改善することで、血清中の抗原特異的 IgEを抑制する（Sashihara T， Sueki N, Ikegami S， "An analysis of the effe ctiveness of heat-killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases.", Journal of Dairy Science, 89， pp.2846-2855 (2006)、および国際出願 WO2006/093022)。このようなことから、 IL-12産生を強く誘導する菌株はアレルギー改善効果が高!/、菌株であると言える。

[0025] 本発明者らは、 Lactobacillus gasseri OLL2809株を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。

(1)寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター

(2)連絡先： τ 292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2_5_8

電話番号 0438-20-5580

(3)受託番号： MTE BP-72

(4)識別のための表示： Lactobacillus gasseri OLL2809

(5)寄託日：平成 17年 (2005年) 2月 1日

(6)ブタペスト条約に基づく寄託への移管日： 2006年 1月 18日

[0026] Lactobacillus gasseri OLL2809株（受託番号： MTE BP-72)は、グラム陽性桿菌であり、 Lactobacilli MRS Agar, Difco上でのコロニー形態は円形、淡黄色、扁平状である。生理学的特徴としては、ホモ乳酸発酵形式、 45°Cでの発育性、グルコース、マンノース、フノレクトース、ガラクトース、シュクロース、セロビ才ース、ラタトース、トレノヽロースに対する発酵性を有する。菌体増殖においては培養中の培地の pHは 6·0〜7·0に維持することが好ましい。

[0027] 本発明の製造方法は、後述の実施例で IL-12産生促進効果の上昇が認められた、 Lactobacillus gasseri OLL2809 (受： NITE BP— 72)、 Lactobacillus amylovorus JCM 11²6^Tおよび Lactobacillus crispatus JCM 1185^Tのみならず、前述の他の乳酸菌についても適用が可能であり、従来の製造方法に比べて高い免疫機能調整活性を有する乳酸菌を得る事が可能である。

[0028] IL-12は未分化 T細胞を Thl細胞に分化するのを促進し、 Thl/Th2バランスを Thl側にンフ卜させる (し ross ML, iil HS， 'し an immunoregulatory lactic acid bacteria be u sed as dietary supplements to limit allergies?，，， International Archives of Allergy an d Immunology, 125, pp.112-119 (2001))。 Th2側に偏った Thl/Th2バランスはアレルギ一発症の原因と一つとなる抗原特異的な IgEの産生を誘導するため、自然免疫担当細胞から IL-12の産生を誘導し Thl/Th2バランスを改善する活性は菌株のアレルギー改善効果を評価する上で重要な指標の 1つとなる。本発明において、免疫機能調整活性は IL-12産生促進効果を含む。

[0029] 本発明の免疫機能調整剤は、単独、または医薬品や食品に通常使用されうる他の成分と混合して投与し、あるいは他の抗アレルギー活性を有する化合物や微生物等と併用することにより、ヒトおよび動物におけるアレルギー予防、およびアレルギー症状の軽減（治療）に有効である。アレルギー予防および/または治療に使用できる。アトピー性皮膚炎やアレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患は、 Thl/Th2バランス力 STh2側に偏っていることが原因の 1つであることが明らかになつている（Hopkin JM, rhe rise of atopy and links to mrection. ， Allergy, o Suppl 72, ρρ·5_9(2002)、ねよび Prescott SL, Macaubas C, Smallacombe T， Holt BJ， Sly PD， Holt PG， "Developm ent of allergen-specific T-cell memory in atopic and normal children.", Lancet, 353( 9148)， pp.196- 200(1999)、および Shirakawa T， Enomoto T， Shimazu S， Hopkin JM, " The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder.", Science ， 275(5296), pp.77_79(1997))。本発明の製造方法に含まれる培養方法は乳酸菌の I L-12の産生能をさらに高める効果がある。 IL-12は、樹状細胞から産生され、 Thl細胞への分化をする働きを有するため、このようにして得られた乳酸菌は高い免疫機能調整効果を持つ事が期待でき、免疫機能調整剤として使用することが可能である。ァレルギ一の種類は特に限定されないが、例えば花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、ァナフイラキシー反応、薬物アレルギー、じんましん、血清病、溶血性貧血、接触性皮膚炎、重症筋無力症、グッドパスチェア症候群、糸球体腎炎等を挙げることができる。アレルゲンも特に限定されないが、例えば食品（小麦、大麦、オーツ麦、ライ麦、そば、卵、乳、チーズ、落花生、米、トウモロコシ、ァヮ、キビ、ヒェ、大豆、じやがいも、やまいも、にんにぐたまねぎ、ニンジン、パセリ、セロリ、トマト、オレンジ、もも、りんご、キウイフノレーッ、メロン、イチゴ、バナナ、くるみ、ゴマ、まつたけ、あわび、いか、いくら、えび、かに、さけ、さば、アジ、イワシ、タラ、イカ、タコ、ホタテ、牛肉、鶏肉、豚肉、ゼラチン等 )、動物 (ィヌ、ネコ、マウス、ラット、ハト等やその皮膚、体毛、粪、羽毛等）、昆虫（蛾、ュスリカ、スズメバチなど、およびこれら昆虫の分泌物、鱗粉）、ダニ、寄生虫（ァニサキス、回虫など）、草木（スギ、ヒノキ、ブタクサ、イネ科植物、ョモギ、ウルシ、ハンノキ等やその花粉、樹液等）、かび、ほこり、ハウスダスト、ゴム、金属、化学物質、医薬品、等を挙げること力 Sできる。

[0030] 本発明の免疫機能調整剤の医薬品または飲食品への配合量は形態、剤型、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、 0.00 l〜100%(w/w)の含量で配合することができ、好ましくは 0.01〜100%(w/w)、さらに好ましくは 0.1〜 100%(w/w)の含量で配合することができる。

[0031] 本発明の免疫機能調整剤の医薬品または飲食品の一日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、 0.1〜10000mg/kg体重を摂取することができ、好ましくは 0.1〜1000mg/kg体重、さらに好ましくは 0.1〜300mg/kg体重を摂取することができる。

[0032] 本発明の免疫機能調整剤は、医薬品または飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、または特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種のアレルギーの予防および/または治療をすることが期待される。また、液状、ペースト状、固形、粉末等の形態を問わず、各種食品（牛乳、加工乳、乳飲料、清涼飲料、発酵乳、ョーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、アイスクリーム、キャンディ、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品等）に添加し、これを摂取してもよい本発明の免疫機能調整剤を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を混合して使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼィン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、 α—カゼイン、 /3—カゼイン、 κ —カゼイン、 /3—ラクトグロブリン、 α—ラタトァノレブミン、ラタトフエリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物;バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホぺプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉 (デキストリンのほか、可溶性澱粉、プリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミン Α、カロチン類、ビタミン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン E 、ビタミン K群、ビタミン P、ビタミン Q、ナイァシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビォチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クェン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。本発明の免疫機能調整剤を含有する飲食品の製造において、これらは合成品であつても天然物由来品のいずれでもよぐまたはこれらを多く含む食品を原材料として用いてもよい。これらの成分は、 2種以上を組み合わせて使用することができる。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。

[0033] 本発明の免疫機能調整剤を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与すること力 Sできる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、液剤等による経口投与を挙げることができる力経管など他の形態であってもよい。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、適当量のカルシゥムを含んでいてもよい。さらに適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、ァミノ酸、ペプチド類など他の成分を添加してもよい。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0034] 以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。

[0035] [実施例 1] (培養時間が IL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）

し gasseri OLL2809の培養時間が IL-12産生促進効果に与える影響を以下の試験により検討した。

[0036] (乳酸菌の培養および凍結乾燥菌末の調製）

し gasseri OLL2809は Lactobacilli MRS Broth (以降 MRS培地ともいう、ベタトンディッキンソン）で 2回、賦活培養（37°C、 18時間）した。 MRS培地に賦活化した菌体を 1% 接種し、 37°Cで静置培養した。培養開始から一定時間毎 (0、 3、 6、 9、 12、 18、 24、 30 時間後）に培養液をサンプリングした。各時間の培養液の OD を測定して乳酸菌数

660

の指標とした。また、各時間 (0、 3、 9時間後を除く）の培養液を、遠心分離により集菌後、生理食塩水で 2回、滅菌蒸留水で 1回洗浄した。培養および集菌'洗菌後、各菌を 75°Cで 60分間加熱して滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌末（以降、乳酸菌凍結乾燥粉末ともいう）は以下の in vitroでの IL-12産生促進効果試験に用いた。 [0037] (IL-12産生促進効果試験）

6から 10週齢の雄性、 BALBんマウス（各実験で n = 3、日本エスエルシー）を屠殺し、脾臓を摘出した。赤血球を除去した脾細胞を、 10% (vol/vol)ゥシ胎児血清（インタージェン)、 100U/mLペニシリン G (インビトロジェン)、 lOO ^ g/mLストレプトマイシン（インビトロジェン）、 2mM L-グルタミン酸（インビトロジェン）、 ImMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン）、 0. ImM非必須アミノ酸混合液（インビトロジェン）、 0.05mM 2- メルカプトエタノール（ナカライテスタ)を添加した RPMI1640培地（インビトロジェン）に 2 .5 X 10⁶/mLとなるように懸濁し、 1 g/mLの乳酸菌凍結乾燥粉末の存在下で、 5%濃度の COインキュベーターで 2日間培養した。培養液上清の IL-12 (p70) (pg/mL)を E LISA法（BD OptEIA™ ELISA set,ベタトンディッキンソン）により測定し、 IL-12産生促進効果の評価に用いた。

[0038] (結果）

結果を図 1に示す。し gasseri OLL2809の生育は 6から 12時間後まで対数増殖し、 1 2時間後以降 30時間まで OD に変化が見られずに定常状態であった。 IL-12産生促

660

進効果は 18時間後まで培養時間に従って増加し、 18時間後に最高となったが 24時間、 30時間と培養時間を長くしても低下しなかった。この結果から、し gasseri OLL28 09を MRS培地で静置培養した場合、 IL-12産生促進効果は培養時間によって異なること、即ち生育に従って増加し定常期において活性が維持される事が明らかになつた。

[0039] [実施例 2] (培地の種類'成分が IL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）

IL-12産生促進効果が培養する培地によって異なる力、を調べるために、以下の試験のように種々の培地または培地に栄養成分を添加した培地で培養したし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果を比較した。

[0040] (乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製および IL-12産生促進効果試験）

MRS培地で 2回、賦活培養（37°C、 18時間）したし gasseri OLL2809を MRS培地または GAM培地（日水製薬）に 1%接種し、 37°Cで 18時間、静置培養した。培養開始から一定時間毎 (0、 3、 6、 9、 12、 18時間後）に培養液をサンプリングし、各時間の培養液の OD を測定して乳酸菌数の指標とした。また、培養 18時間後の培養液について、 pHを測定すると共に、実施例 1と同様の方法で乳酸菌凍結乾燥粉末を調製し、マウス脾細胞からの IL-12産生促進効果を測定した。

[0041] (結果）

結果を図 2に示す。 GAM培地で培養した菌体（図 2B中の GAM)は MRS培地で培養した菌体（図 2B中の MRS)と比較して有意に（pく 0.05)低い活性を示した。そこで、これらの培地成分の違いにつ!/、て種々の検討を行ったところ（データは示さず）、 GAM 培地のグルコース濃度が低いためであることが明らかになった（MRS培地は終濃度 20 g/L、 GAM培地は終濃度 3g/Lのグルコースを含む）。

[0042] そこで、 GAM培地にグルコースを各種濃度（終濃度 5、 10、 20g/L)で添加した培地でし gasseri OLL2809の培養を行い、得られた菌体について実施例 1と同様の方法で処理 (集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥)を行い、マウス脾細胞からの IL-12産生促進効果試験を行った。結果を図 2B中の GAM + glucoseに示す。 GAM培地にグルコースを添加すると、グルコースの終濃度依存的に生育および IL-12産生促進効果が増加し（図 2A)、グルコースの終濃度が 20g/Lの GAM培地で培養した菌体は、通常の GA M培地（図 2B中の GAM)で培養した菌体と比較して活性は有意に（pく 0.05)増加した。

グルコースの添加がし g_asseri OLL2809の活性にどのように影響するか検討したところ、培養液の pHが活性に影響を及ぼしていることが考えられた。即ち、 GAM培地ではグルコースの終濃度が低いために MRS培地と比較して生育が悪ぐまた、し gasser i OLL2809由来の乳酸の生成量が低いために 18時間後の培養液 pHは MRS培地で 4. 0であるのに対し、 GAM培地では 5.5であった。 GAM培地にグルコースを添加し、終濃度が 3(無添加)、 5、 10および 20g/Lのグルコース濃度の培地では、菌の生育および乳酸生成量の増加に伴い培養液の培養 18時間後の pHはそれぞれ 5.5、 4.8、 4.4 および 4.3と低下した。そこで、 GAM培地でし gasseri OLL2809を 18時間培養した時の培養液 pHと菌体の IL-12産生促進効果の相関を解析したところ、この pH範囲において両者の間に有意な（pく 0.05)負の相関が認められた（図 2C、 y = -987.01X + 569 6.7， n = 4)。一方、グルコースの終濃度と菌体の IL-12産生促進効果については、このような相関関係は認められな力、つた。以上から、培養液の pHが菌体の IL-12産生促進効果に影響を与える事が示唆された。

[0043] [実施例 3] (培養液の pHが IL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）

培養液の pHがし gasseri OLL2809の活性に及ぼす影響をより詳細に検討するために、中和培養により培養したし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果の経時変化を以下の試験により評価した。

[0044] (乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製および IL-12産生促進効果試験）

2 Lのジャーフアーメンターを用いて、張り込み培地量 1.5L、撹拌速度 200rpm/min 、窒素ガスによる上面通気、培養温度 37°Cの条件で、 MRS培地（初発 pHは約 6.4)でし gasseri OLL2809を培養した。 pHは pHコントローラーを用いて 4、 5または 6に設定し、設定値以下に低下しないように 10% (wt/wt)の炭酸カリウム溶液を用いて中和培養した。培養開始から 6、 12、 18時間後のし gasseri OLL2809培養液を実施例 1と同様に処理 (集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥）して凍結乾燥菌末を得、これについて実施例 1と同様の方法で IL-12産生促進効果を検討した。また、培養開始から 3、 6、 9、 12、 15、 18時間後の培養液につ!/、ては生菌数と pHを測定した。

[0045] (結果）

結果を図 3に示す。生菌数は培養液の設定 pHによらずほぼ同じ傾向で推移し、培養開始から 12時間後以降はいずれの設定 pHにおいても定常期に達した。最終的に設定 pH力のものは設定 pH力または 4のものに比べて約半分であった（図 3A)。一方、培養液の pHは培養開始から 6時間後では pH4と 5に設定した培養液で差はなかつたが、 12時間以降でどの培養液もほぼ設定 pHに近づ!/、た（図 3B)。

IL-12産生促進効果は培養開始から 6時間後では培養液の設定 pHにより差は認められず、いずれも低い値を示した力 12時間以降では酸性側の設定 pHのものほど高い値を示した（図 3C)。一方、設定 pH 6で培養した時では培養期に関わらず IL-12産生促進効果はどの時間でも低いままであった。以上のことから、培養液の pHによってし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果が異なることが明らかになった。このことから、 IL-12産生促進効果は培養液の pHが重要であることが明かになった。

[0046] [実施例 4] (培養液の pHが他の乳酸菌の IL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）培養液の pHがし gasseri OLL2809以外の他の乳酸菌の IL-12産生促進効果にも影響を及ぼす力、を以下の試験により検討した。

[0047] (乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製および IL-12産生促進効果試験）

賦活培養（37°C、 18時間）したし amylovorus JCM 1126^τおよびし crispatus JCM 11 85^τを、 MRS培地（CaCO 0%)または pH緩衝剤として 0.6%の CaCOを添加した MRS培地（CaCO 0.6%)に、 1%接種し、 37°Cで 18時間、培養した。培養液を実施例 1と同様の方法で処理 (集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥）した後に、マウス脾細胞からの IL-12産生促進効果を測定した。本培養では、 CaCOの沈殿を防ぐ為に、磁気回転子で 70rpm/ minの回転速度で撹拌しながら培養した。

なお、これらの菌株名に JCMと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した基準株である。

[0048] (結果）

結果を図 4に示す。 MRS培地のみの場合と比べて、 CaCOを 0.6%の濃度で添加した

MRS培地では、し amylovorus JCM 1126^Tおよびし crispatus JCM 1185^Tの培養 18時間後の培養液 pHはそれぞれ 3.8 (CaCO 0%)から 4.5 (CaCO 0.6%)へ、 3.9 (CaCO 0

%)から 4.5 (CaCO 0.6%)へと中性側に緩衝され、生菌数はそれぞれ 1.3 X 10⁹ cfti/mL

(CaCO 0%)から 2.3 X 10⁹ ciu/mL (CaCO 0.6%)、 7.3 X 10⁷ cfo/mL (CaCO 0%)から 1

• 6 X 10⁸cfo/mL (CaCO 0.6%)へと増加した。し力、し、し amylovorus JCM 1126^Tおよびし crispatus JCM 1185^Tともに IL-12産生促進効果はいずれも CaCO添加によって有意に (pく 0.05)低下した。この結果から、 IL-12産生促進効果に培養液の pHが影響を及ぼす現象は、し gasseri OLL2809のみでなく他の乳酸菌にも共通であることが明らかになった。

[0049] [実施例 5] (培養液 pHが IL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）

培養液の pHによりし gasseri OLL2809の IL-12産生促進効果が異なる原因を解明するために、 MRS培地で 18時間、静置培養する事で IL-12産生促進効果の高い菌体を調製し、さらにこれを加熱処理または非加熱後に pHの異なる緩衝液中に 37°Cで 6 時間放置し、その後の IL-12産生促進効果を比較した。

[0050] (乳酸菌の培養、サンプルの調製および IL-12産生促進効果試験） MRS培地で 37°C 18時間培養したし gasseri OLL2809を、実施例 1と同様の方法で集菌、洗浄し、次いで加熱せずに凍結乾燥した。非加熱の凍結乾燥菌末を 4mg/mL となるように蒸留水に懸濁し、この菌体懸濁液を 4mMの MgClを含む 20mMのクェン酸緩衝液 (pH 4、 5、 6)で 1 : 1に希釈して菌体懸濁液（2mg/mL)を調製した。各菌体懸濁液について、半量を 75°Cで 60分間で加熱処理し（加熱処理サンプル： heated)、残り半量は非加熱のまま（非加熱サンプル： unheated)とした。その後、各サンプルを 3 7°Cで 6時間、室温にて放置した。 Controlとしては、 MRS培地中に 37°Cで 18時間培養したし gasseri OLL2809を、実施例 1と同様の方法で集菌、洗浄、滅菌した後に凍結乾燥した凍結乾燥菌末を用いた。各サンプルにつ!/、て実施例 1と同様の方法でマウス脾細胞からの IL-12産生促進効果を測定した。

[0051] 結果を図 5に示す。加熱処理後に放置した場合では、どの pHにおいても Controlと比較して差は認められなかった。非加熱の場合、 Controlと比較して中性域の pHで放置した菌体ほど IL-12産生促進効果が低下した。この結果から、し gasseri OLL2809 の IL-12産生促進効果は中性域の pHにおいて減少する力 S、少なくとも pH 4で 6時間は安定であることが明ら力、となった。また、この結果はこれまでの諸条件におけるし g asseri OLL2809の培養で、培養液の pHが約 5以上であると IL-12産生促進効果が低力、つたことと一致し、中性域での pHにより有効成分が分解ほたは生合成が阻害）される為であることが考えられた。この IL-12産生促進効果の低下には酵素等に感受性の高!/、物質が関与して!/、る事が示唆された。

産業上の利用可能性

[0052] 免疫調節活性の高い乳酸菌を得ることができるため、これを用いて免疫調節活性を有する飲食品や医薬品を製造することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 乳酸菌を pH 3.5〜pH 5.0の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法。

[2] 前記乳酸菌が IL-12産生促進効果を有する乳酸菌である、請求項 1に記載の免疫機能調整剤の製造方法。

[3] 前記乳酸菌がラクトバチルス属である、請求項;!〜 2のいずれか 1項に記載の免疫機能調整剤の製造方法。

[4] 前記乳酸菌がラクトバチルス'ガセリ OLL2809菌株（Lactobacillus gasseri OLL280

9、受託番号 MTE BP-72)、 Lactobacillus amylovorus JCM 1126^Tおよび Lactobacillus crispatus JCM 1185^Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも 1つである、請求項；!〜 3のいずれ力、 1項に記載の免疫機能調整剤の製造方法。

[5] 請求項;!〜 4のいずれか 1項に記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤。

[6] 請求項 5に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用飲食品。

[7] 請求項 5に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用医薬品。

[8] 請求項 5に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および/又は治療用医薬品もしくはアレルギー予防および/又は治療用飲食品の製造のための使用。