JP5314421B2 - 免疫調節活性の高い乳酸菌の培養法 - Google Patents
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Description
[1] 乳酸菌をpH 3.5〜pH 5.0の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法、
[2]前記乳酸菌がIL-12産生促進効果を有する乳酸菌である、[1]に記載の免疫機能調整剤の製造方法。 [3] 前記乳酸菌がラクトバチルス属である、前記[1]〜[2]のいずれか1つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、
[4] 前記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)、Lactobacillus amylovorus JCM 1126Tおよ{びLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも1つである、前記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、
[5] 前記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤、
[6] 前記[5]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用飲食品、
[7] 前記[5]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用医薬品、
[8] 前記[5]に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および/又は治療用医薬品もしくはアレルギー予防および/又は治療用飲食品の製造のための使用、
を提供するものである。
乳酸菌の免疫機能調整活性を高められるのであれば他のpH条件でもよい。また、培養前あるいは培養中に通常用いられる酸、塩基、緩衝剤、炭酸ガスなどの添加剤を適宜培地に添加して、培地のpHを調整してもかまわない。また本発明の製造方法におけるpH調整は、乳酸菌が自ら産生する酸を利用することもでき、乳酸菌の酸産生を調整するためにグルコースなどの栄養成分を培地に強化してもよい。
(1)寄託機関名:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(2)連絡先:〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
電話番号0438-20-5580
(3)受託番号:NITE BP-72
(4)識別のための表示:Lactobacillus gasseri OLL2809
(5)寄託日:平成17年(2005年)2月1日
(6)ブタペスト条約に基づく寄託への移管日:2006年1月18日
本発明の免疫機能調整剤を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を混合して使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物;バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉(デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等)、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂;パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。本発明の免疫機能調整剤を含有する飲食品の製造において、これらは合成品であっても天然物由来品のいずれでもよく、またはこれらを多く含む食品を原材料として用いてもよい。これらの成分は、2種以上を組み合わせて使用することができる。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
L. gasseri OLL2809の培養時間がIL-12産生促進効果に与える影響を以下の試験により検討した。
L. gasseri OLL2809はLactobacilli MRS Broth(以降MRS培地ともいう、ベクトンディッキンソン)で2回、賦活培養(37℃、18時間)した。MRS培地に賦活化した菌体を1%接種し、37℃で静置培養した。培養開始から一定時間毎(0、3、6、9、12、18、24、30時間後)に培養液をサンプリングした。各時間の培養液のOD660を測定して乳酸菌数の指標とした。また、各時間(0、3、9時間後を除く)の培養液を、遠心分離により集菌後、生理食塩水で2回、滅菌蒸留水で1回洗浄した。培養および集菌・洗菌後、各菌を75℃で60分間加熱して滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌末(以降、乳酸菌凍結乾燥粉末ともいう)は以下のin vitroでのIL-12産生促進効果試験に用いた。
6から10週齢の雄性、BALB/cマウス(各実験でn = 3、 日本エスエルシー)を屠殺し、脾臓を摘出した。赤血球を除去した脾細胞を、10% (vol/vol)ウシ胎児血清 (インタージェン)、100U/mL ペニシリンG (インビトロジェン)、100μg/mL ストレプトマイシン(インビトロジェン)、 2mM L-グルタミン酸(インビトロジェン)、 1mM ピルビン酸ナトリウム(インビトロジェン)、 0.1mM 非必須アミノ酸混合液(インビトロジェン)、 0.05mM 2-メルカプトエタノール (ナカライテスク)を添加したRPMI1640培地(インビトロジェン)に2.5×106/mLとなるように懸濁し、1μg/mLの乳酸菌凍結乾燥粉末の存在下で、5%濃度のCO2インキュベーターで2日間培養した。培養液上清のIL-12 (p70)(pg/mL)をELISA法(BD OptEIATM ELISA set、ベクトンディッキンソン)により測定し、IL-12産生促進効果の評価に用いた。
結果を図1に示す。L. gasseri OLL2809の生育は6から12時間後まで対数増殖し、12時間後以降30時間までOD660に変化が見られずに定常状態であった。IL-12産生促進効果は18時間後まで培養時間に従って増加し、18時間後に最高となったが24時間、30時間と培養時間を長くしても低下しなかった。この結果から、L. gasseri OLL2809をMRS培地で静置培養した場合、IL-12産生促進効果は培養時間によって異なること、即ち生育に従って増加し定常期において活性が維持される事が明らかになった。
IL-12産生促進効果が培養する培地によって異なるかを調べるために、以下の試験のように種々の培地または培地に栄養成分を添加した培地で培養したL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果を比較した。
MRS培地で2回、賦活培養(37℃、18時間)したL. gasseri OLL2809をMRS培地またはGAM培地(日水製薬)に1%接種し、37℃で18時間、静置培養した。培養開始から一定時間毎(0、3、6、9、12、18時間後)に培養液をサンプリングし、各時間の培養液のOD660を測定して乳酸菌数の指標とした。また、培養18時間後の培養液について、pHを測定すると共に、実施例1と同様の方法で乳酸菌凍結乾燥粉末を調製し、マウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。
結果を図2に示す。GAM培地で培養した菌体(図2B中のGAM)はMRS培地で培養した菌体(図2B中のMRS)と比較して有意に(p < 0.05)低い活性を示した。そこで、これらの培地成分の違いについて種々の検討を行ったところ(データは示さず)、GAM培地のグルコース濃度が低いためであることが明らかになった(MRS培地は終濃度20g/L、GAM培地は終濃度3g/Lのグルコースを含む)。
グルコースの添加がL. gasseri OLL2809の活性にどのように影響するか検討したところ、培養液のpHが活性に影響を及ぼしていることが考えられた。即ち、GAM培地ではグルコースの終濃度が低いためにMRS培地と比較して生育が悪く、また、L. gasseri OLL2809由来の乳酸の生成量が低いために18時間後の培養液pHはMRS培地で4.0であるのに対し、GAM培地では5.5であった。GAM培地にグルコースを添加し、終濃度が3(無添加)、 5、10および20g/Lのグルコース濃度の培地では、菌の生育および乳酸生成量の増加に伴い培養液の培養18時間後のpHはそれぞれ5.5、4.8、4.4および4.3と低下した。そこで、GAM培地でL. gasseri OLL2809を18時間培養した時の培養液pHと菌体のIL-12 産生促進効果の相関を解析したところ、このpH範囲において両者の間に有意な(p < 0.05)負の相関が認められた(図2C、y = -987.01x + 5696.7, n = 4)。一方、グルコースの終濃度と菌体のIL-12 産生促進効果については、このような相関関係は認められなかった。以上から、培養液のpHが菌体のIL-12 産生促進効果に影響を与える事が示唆された。
培養液のpHがL. gasseri OLL2809の活性に及ぼす影響をより詳細に検討するために、中和培養により培養したL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果の経時変化を以下の試験により評価した。
2 Lのジャーファーメンターを用いて、張り込み培地量 1.5L、撹拌速度 200rpm/min、窒素ガスによる上面通気、培養温度 37℃の条件で、MRS培地(初発pHは約6.4)でL. gasseri OLL2809を培養した。pHはpHコントローラーを用いて4、5または6に設定し、設定値以下に低下しないように10% (wt/wt)の炭酸カリウム溶液を用いて中和培養した。培養開始から6、12、18時間後のL. gasseri OLL2809培養液を実施例1と同様に処理(集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥)して凍結乾燥菌末を得、これについて実施例1と同様の方法でIL-12産生促進効果を検討した。また、培養開始から3、6、9、12、15、18時間後の培養液については生菌数とpHを測定した。
結果を図3に示す。生菌数は培養液の設定pHによらずほぼ同じ傾向で推移し、培養開始から12時間後以降はいずれの設定pHにおいても定常期に達した。最終的に設定pHが6のものは設定pHが5または4のものに比べて約半分であった(図3A)。一方、培養液のpHは培養開始から6時間後ではpH4と5に設定した培養液で差はなかったが、12時間以降でどの培養液もほぼ設定pHに近づいた(図3B)。
IL-12産生促進効果は培養開始から6時間後では培養液の設定pHにより差は認められず、いずれも低い値を示したが、12時間以降では酸性側の設定pHのものほど高い値を示した(図3C)。一方、設定pH 6で培養した時では培養期に関わらずIL-12産生促進効果はどの時間でも低いままであった。以上のことから、培養液のpHによってL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果が異なることが明らかになった。このことから、IL-12産生促進効果は培養液のpHが重要であることが明かになった。
培養液のpHがL. gasseri OLL2809以外の他の乳酸菌のIL-12産生促進効果にも影響を及ぼすかを以下の試験により検討した。
賦活培養(37℃、18時間)したL. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185Tを、MRS培地(CaCO3 0%)またはpH緩衝剤として0.6%のCaCO3を添加したMRS培地(CaCO3 0.6%)に、1%接種し、37℃で18時間、培養した。培養液を実施例1と同様の方法で処理(集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥)した後に、マウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。本培養では、CaCO3の沈殿を防ぐ為に、磁気回転子で70rpm/minの回転速度で撹拌しながら培養した。
なお、これらの菌株名にJCMと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した基準株である。
結果を図4に示す。MRS培地のみの場合と比べて、CaCO3を0.6%の濃度で添加したMRS培地では、L. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185Tの培養18時間後の培養液pHはそれぞれ3.8(CaCO3 0%)から4.5 (CaCO3 0.6%)へ、3.9(CaCO3 0%)から4.5(CaCO3 0.6%)へと中性側に緩衝され、生菌数はそれぞれ1.3×109 cfu/mL(CaCO3 0%)から2.3 ×109 cfu/mL(CaCO3 0.6%)、7.3×107 cfu/mL(CaCO3 0%)から1.6×108cfu/mL (CaCO3 0.6%)へと増加した。しかし、L. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185TともにIL-12産生促進効果はいずれもCaCO3添加によって有意に(p < 0.05)低下した。この結果から、IL-12産生促進効果に培養液のpHが影響を及ぼす現象は、L. gasseri OLL2809のみでなく他の乳酸菌にも共通であることが明らかになった。
培養液のpHによりL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果が異なる原因を解明するために、MRS培地で18時間、静置培養する事でIL-12産生促進効果の高い菌体を調製し、さらにこれを加熱処理または非加熱後にpHの異なる緩衝液中に37℃で6時間放置し、その後のIL-12産生促進効果を比較した。
MRS培地で37℃18時間培養したL. gasseri OLL2809を、実施例1と同様の方法で集菌、洗浄し、次いで加熱せずに凍結乾燥した。非加熱の凍結乾燥菌末を4mg/mLとなるように蒸留水に懸濁し、この菌体懸濁液を4mMのMgCl2を含む20mMのクエン酸緩衝液(pH 4、5、6)で1:1に希釈して菌体懸濁液(2mg/mL)を調製した。各菌体懸濁液について、半量を75℃で60分間で加熱処理し(加熱処理サンプル:heated)、残り半量は非加熱のまま(非加熱サンプル:unheated)とした。その後、各サンプルを37℃で6時間、室温にて放置した。Controlとしては、MRS培地中に37℃で18時間培養したL. gasseri OLL2809を、実施例1と同様の方法で集菌、洗浄、滅菌した後に凍結乾燥した凍結乾燥菌末を用いた。各サンプルについて実施例1と同様の方法でマウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。
Claims (12)
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法。
- 請求項1に記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤。
- 請求項2に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用組成物。
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)、Lactobacillus amylovorus JCM 1126 T およびLactobacillus crispatus JCM 1185 T から選ばれる乳酸菌のうち少なくとも1つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造される免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用医薬品。
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)、Lactobacillus amylovorus JCM 1126 T およびLactobacillus crispatus JCM 1185 T から選ばれる乳酸菌のうち少なくとも1つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造される免疫機能調整剤の、アレルギー予防および/又は治療用医薬品の製造のための使用。
- 請求項2に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および/又は治療用組成物の製造のための使用。
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含むIL-12産生促進剤の製造方法。
- 請求項7に記載の方法で製造したIL-12産生促進剤。
- 請求項8に記載のIL-12産生促進剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用組成物。
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)、Lactobacillus amylovorus JCM 1126 T およびLactobacillus crispatus JCM 1185 T から選ばれる乳酸菌のうち少なくとも1つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造されるIL-12産生促進剤を含有するアレルギー予防および/又は治療用医薬品。
- ラクトバチルス・ガセリOLL2809菌株(Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72)、Lactobacillus amylovorus JCM 1126 T およびLactobacillus crispatus JCM 1185 T から選ばれる乳酸菌のうち少なくとも1つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造されるIL-12産生促進剤の、アレルギー予防および/又は治療用医薬品の製造のための使用。
- 請求項8に記載のIL-12産生促進剤の、アレルギー予防および/又は治療用組成物の製造のための使用。
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