TWI422681B - 高免疫調節活性之乳酸菌培養方法 - Google Patents

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Description

高免疫調節活性之乳酸菌培養方法
本發明關於用以提高免疫調節活性之乳酸菌的培養方法，以及使用該培養方法之免疫機能調整劑之製造方法。
支氣管氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎等過敏疾患，已確認於數十年來急速增加，現在，咸信至少約五分之一的人口患有過敏疾患。目前的過敏治療要多數為針對症狀療法，由患者數目大增及長期使用所伴隨副作用的觀點而言，期望更有效果的治療法(非專利文獻1)。近年來，於雙盲安慰劑檢測試驗中，對於具高風險的兒童投予一種乳酸菌Lactobacillus GG株(Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103株)，顯示約抑制一半的過敏疾患的發病(非專利文獻2)，由於乳酸菌的使用不伴隨有副作用，可謂預防及/或治療過敏之簡便且有效的方法。此方式之乳酸菌的效果，其理由之一為巨噬細胞或樹狀細胞等自然免疫擔任細胞於併取乳酸菌時，會造成誘發IL－12(p70)(以下亦稱為IL－12)的產生(非專利文獻3)。
IL－12(p70)促進未分化T細胞分化為I型助手(helpr)T細胞(以下亦稱為Th1細胞)，使Th1/Th2平衡偏向(shift)Th1側(非專利文獻3)。由於偏向於II型的助手T細胞(以下亦稱為Th2細胞)側之Th1/Th2平衡為過敏發病原因之一，而誘導抗原特異性之IgG的產生，改善誘導來自自然免疫擔任細胞之IL－12產生Th1/Th2平衡的活性，成為評估菌株之過敏改善效果上的重要指標之一。此方式之乳酸菌的免疫調節活性即使同屬同種的菌，亦有大的差異，對於具有高免疫調節活性之益生(probiotics)菌株的篩選及其應用研究正積極的進行(非專利文獻4)。該等研究結果，至目前為止已有提案使用各種乳酸菌之過敏預防及/或治療劑。然而，例如專利文獻1揭示乳酸菌(Lactobacillus paracasei KW3110菌株)，雖由18種100株以上的乳酸菌中篩選IL－12產生的促進效果高及Th1/Th2平衡改善效果高的菌株，但該菌體培養條件對於免疫調節活性的影響則全無檢討。
雖然已有許多報告檢討由於乳酸菌菌株而使作用及其活性程度有所差異，或其有效成分，但由於菌的培養條件而使免疫調節活性有所差異的報告則僅有2者。Haller等人報告由人類周邊血液單核球之THF－α之產生誘導效果為恆定期的菌體比對述增殖期的菌體更高(非專利文獻5)。另外，亦報告於活體中，因乳酸桿菌(Lactobacillus)屬乳酸菌的培養期而使Th1/Th2平衡的誘導活性有所差異。Massen等人，為了檢討乳酸菌的免疫調節活性，將對數增殖期與恆定期的菌體經口投予至小鼠，以測定血中IgG2a/IgG的比，檢討Th1/Th2平衡。其結果報告恆定期的菌體比對數增殖期的菌體更為誘導Th2反應(非專利文獻6)。然而，由於該等報告僅顯示因菌體的培養期而使免疫調節活性有所差異的現象，僅培養時間為重要的，其他環境要因的影響則全無檢討。雖謂檢討菌體培養條件對於免疫調節活性的影響，對於進行高免疫調節活性菌體製造的工業生產時的製造步驟的決定為重要者，但目前為止尚未有該等檢討。此方式之使用既存的乳酸菌，調製目的之過敏預防及/或治療劑，或過敏預防及/或治療用食品組成物的方法，現狀仍存在有許多改良餘地。
專利文獻1：日本專利第3585487號公報
非專利文獻1：赤星光輝、玉利真由美、白川太郎，「過敏疾患之最近的話題」(一疾患最近話題)，最新醫學，58(2)，pp.7－14(2003)非專利文獻2：Kalliomaki M,Salminen S,Arvilommi H,Kero P,Koskinen P,Isolauri E,“Probiotics in primary prevention of atopic disease：a randomized placebo－controlled trial.”,Lancet,357(9262),pp.1076－1079(2001)非專利文獻3：Cross ML,Gill HS,“Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies？”, International Archives of Allergy and Immunology,125,pp.112－119(2001)非專利文獻4：Lee J,Ametani A,Enomoto A,Sato Y,Motoshima H,Ike F,Kaminogawa S,“Screening for the immunopotentiating activity of food microorganisms and enhancement of the immune response by Bifidobacterium adolescentis M101－4.”,Bioscience Biotechnology and Biochemistry,57(12),pp.2127－2132(1993)非專利文獻5：Haller D,Bode C,Hammes P,“Cytokine secrstion by stimulated monocytes depends on the growth phase and heat treatment of bacteria：a comparative study between lactic acid bacteria and invasive pathogens.”,Microbiology and Immunology,43(10),pp.925－935(1999)非專利文獻6：Maassen CB,Boersma WJA,van Holten－Neelen C,Claassen E,Laman JD,“Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgG1/IgG2a ratio for soluble antigens：implications for vaccine development.”Vaccine,21(21－22),pp.2751－2757(2003)
亦即，本發明之課題為發現提高免疫調整機能的乳酸菌培養方法及使用該方法之免疫調整機能劑之製造方法。
本發明係為解決上述課題者。本發明者們於國際專利申請案WO2006/093022中，雖已報告加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)屬乳酸菌之Lactobacillus gasseri OLL2809(以下亦稱為L.gasseri OLL2809)菌株初次於過敏的預防及治療之具有免疫機能調整活性，進一步，致力檢討乳酸菌的培養條件對於小鼠脾臟細胞之IL－12(p70)產生誘導活性的影響。其結果發現，與上述乳酸菌有關的免疫機能調整活性的因子，特別是與培養液的pH有重大相關。再者，亦發現不僅是加氏乳酸桿菌，食澱粉乳酸桿菌(Lactobacillus amylovorus)(以下亦稱為L.amylovorus)及捲曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)(以下亦稱為L.crispatus)等其他乳酸菌中，培養液的pH關係於免疫機能調整效果，遂而完成本發明。
亦即，本發明為[1]一種含有乳酸菌之免疫機能調整劑之製造方法，係包含以pH 3.5至pH 5.0的培養基培養乳酸菌的步驟。
[2]如上述[1]之免疫機能調整劑之製造方法，其中，該乳酸菌為對IL－12的產生具有促進效果之乳酸菌。
[3]如上述[1]至[2]中任一項之免疫機能調整劑之製造方法，其中，該乳酸菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
[4]如上述[1]至[3]中任一項之免疫機能調整劑之製造方法，其中，該乳酸菌為由加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri OLL2809，寄存編號NITE BP－72)、食澱粉乳酸桿菌(Lactobacillus amylovorus JCM 1126T )及捲曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus JCM 1185T )中選出至少一種之乳酸菌。
[5]一種免疫機能調整劑，係以上述[1]至[4]中任一項之製造方法所製造者。
[6]一種過敏之預防及/或治療用的飲食品，係含有上述[5]之免疫機能調整劑。
[7]一種過敏之預防及/或治療用的醫藥品，係含有上述[5]之免疫機能調整劑。
[8]上述[5]之免疫機能調整劑之用途，係使用於過敏之預防及/或治療用醫藥品，或過敏之預防及/或治療用飲食品之製造。
如後述實施例中所示者，經由包含於本發明之乳酸菌培養方法，使乳酸菌具有提高的免疫調節活性成為可能。又，利用以該方法所培養之乳酸菌，實現具有高活性之免疫調整機能劑的製造。由此可提供於過敏預防及/或治療等有效之免疫調活性高的飲食品或醫藥品。
以下，詳細說明本發明。惟，本發明並不限定為以下的較佳實施態樣，於本發明的範圍可自由變更。
本發明係關於含有作為有效成分之乳酸菌之免疫機能調整劑之製造方法。本發明之製造方法係包含可有效率的製得具免疫機能調整活性之乳酸菌之乳酸培養方法。本發明者們對於各種乳酸菌(L.gasseri,L.amylovorus及L.crispatus)，於各種培養條件中，以小鼠脾臟細胞之IL－12的產生具促進效果為指標，研究免疫機能調整活性。其結果發現，上述乳酸菌與免疫機能調整活性的關係因子，特別是與培養液的pH大為相關。同時，使用本發明製造方法，可提供對於食物過敏所含各種過敏之預防及/或治療有效，新的過敏預防及/或治療劑，或者含有該等之過敏預防及或治療用食品組成物。
乳酸菌為以葡萄糖為營養成分(亦稱為資化葡萄糖)而產生對糖收率為50%以上的乳酸之菌的總稱，生理學上性質為革蘭氏陽性菌之球菌或桿菌，無運動性，不具孢子形成能力，為過氧化氫酶(catalase)陰性等特徵。乳酸菌可由植物表皮、哺乳動物的腸管、海洋、土壤、發酵食品等各種環境加以分離，於醃漬物或醬油等發酵食品中，不僅賦予味道及質地的形成，由於具有乳酸及細菌素(bacteriocin)等抗菌性物質產生能力，自古以來於世界各地經由發酵乳等食用。又，於哺乳動物腸管對宿主賦予各種生理影響為周知的事實，可謂安全性極高的微生物。目前乳酸菌分類為下列11屬：乳酸球菌(Lactococcus)屬、乳酸桿菌(Lactobacillus)屬、明串球菌(Leuconostoc)屬、乳酸足球菌(Pediococcus)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、魏斯菌(Weissella)屬、四體球菌(Tetragenococcus)屬、酒球菌(Oneococcus)屬、腸球菌(Enterococcus)屬、徘徊球菌(Vagococcus)屬、肉品桿菌(Carnobacterium)屬。本發明之免疫機能調整劑之製造方法中，可使用該等乳酸菌。較佳例可列舉加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri OLL2890菌株)(寄存編號：NITE BP－72)、食澱粉乳酸桿菌(Lactobacillus amylovorus JCM 1126T )及捲曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus JCM 1185T )，但不限定為該等示例。
本發明之製造方法中，上述乳酸菌攝取培養基而於規定範圍之pH進行培養。培養方法可為批次培養、分批培養、流加培養、連續培養、厭氣培養、通氣培養、震盪培養、靜置培養、攪拌培養、試管培養、槽式培養、燒瓶培養、發酵槽培養、發酵罐培養(jar fermenter)等任一種方法進行培養。
本發明之製造方法中所使用之乳酸菌培養用培養基，可使用乳酸菌培養基中通常所使用之培養基。亦即，可使用主碳源以外，亦含有氮源、無機物其他營養素等培養基之培養基。因應使用菌之資化性，碳源可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、澱粉水解物、廢糖蜜等。氮源可使用酪蛋白(casein)的水解物、乳清(whey)蛋白質水解物、大豆蛋白質水解物等有機氮含有物。其他增殖促進劑使用肉萃取物、魚肉萃取物、酵母萃取物等。亦可使用市售培養基，例如：Lactobacillus MRS Broth(Becton Dickinson)、GAM培養基(日水製藥)等，或者以再添加上述成分者作為培養基，但不以該等為限定。
乳酸菌的培養雖期望於厭氣條件下進行，亦可於通常所使用之液體靜置培養等微好氣條件下進行。厭氣培養雖可將於碳氣體或惰性氣體(氮等)的通氣下培養方法等習知的方法，以單獨或組合複數個而加以使用，亦可使用其他方法。一般而言，培養溫度較佳為20至40℃，但只要為菌可生長的溫度，亦可為其他溫度條件。培養時間較佳為10至24小時，但只要為菌可生長的時間，亦可為其他培養時間。
菌體增殖的最適pH雖根據菌株而有所差異，但多數的乳酸菌大致為5.5至7.0的範圍(James JA,Lee BH,“Cultural conditions for production of glucoamylase from Lactobacillus amylovorus ATCC 33621.”J Appl Bacteriol,79(5),pp.499－505(1995),Pettersson,H－E.,“Studies on batch production of bacterial concentrations from mixed species lactic acids.”Applied Microbiology.1975.29(2)：133－140.)，通常，以工業生產中可獲得最大菌體量的最適pH進行中和培養方法。然而，為了工業性培養有效率的IL－12產生的促進效果高的菌體的培養條件，咸信為有效率可獲得的菌體量係根據培養條件而有所差異，而有檢討的必要。
本發明的製造方法中，乳酸菌培養中的培養基pH為3.5至5.5，較佳為3.5至5.0，更較佳為4.5以下，例如較佳維持於3.5至4.5、3.5至4.4、3.8至4.4、4.0至4.5、3.5至4.0等，但只要可提高乳酸菌的免疫機能調整活性，亦可為其他條件。又，於培養條件前或培養條件中，亦可適宜地於培養基添加通常所使用之酸、鹼、緩衝劑、碳酸氣體等添加劑，以調整培養基的pH。再者，於本發明製造方法之pH調整，可利用由乳酸菌本身所產生的酸，而為了調整乳酸菌的酸產生，亦可強化培養基鐘之葡萄糖等營養成分。
本發明製造方法之pH調整，可於培養步驟全程中以一定的方式加以調整，亦可於培養步驟的中途變更pH。例如，可以乳酸菌的菌體量增加的適合pH培養，於菌體量增加後，變更為提高乳酸菌的免疫機能調整活性的適合pH進行培養。工業培養中進行中和培養時，一般而言，例如多數調整為pH5.5至7左右。本發明製造方法可將乳酸菌以該等pH培養後，以提高本發明乳酸菌的免疫機能調整活性之適合pH的方式，變更pH進行培養。
再者，以上述培養方法培養的乳酸菌可直接或進行洗淨、濃縮、破碎、乾燥、發酵或加熱等處理，而完成本發明之免疫機能調整劑。
本發明之免疫機能調整劑可包含以上述培養方法所製得乳酸菌之各種狀態，例如可以乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物(菌體、培養上清液(含培養基成分)、乳酸菌發酵物(乳酸菌飲料、酸乳、優酪(yogurt)等)、乳酸菌處理物等加以使用。
本發明之免疫機能調整劑除了可使用培養終了後的乳酸菌培養液本身，或者濃縮的濃縮物以外，亦可將濃縮物乾燥使用。該菌體濃度並無特別限定，較佳於濃縮液為4×1010 個/g以上，於乾燥物為5×1011 個/g以上。
本發明之免疫機能調整劑可含有上述培養方法所獲得之上述乳酸菌本身，或亦可含有以乳酸菌施行任何處理之乳酸菌處理物。本發明所使用之乳酸菌處理物，可列舉例如乳酸菌、乳酸菌含有物、發酵乳濃縮物、漿化物、乾燥物(由噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、鼓式乾燥物選出至少一者)、液狀物、稀釋物、破碎物等。又，乳酸菌可適宜使用生菌體、濕潤菌體、乾燥菌體等。亦可為經施行殺菌之死菌體，亦即經施行加熱殺菌處理、放射線殺菌處理、或破碎處理等。亦可添加於奶粉等具有生物學規格之醫藥品及/或飲食品中，可不限定為醫藥品及/或飲食品的形態等而可應用於各種醫藥品及/或飲食品。
L.gasseri OLL2809為由健康人的糞便所單離的273菌株之乳酸桿菌(lactobacillus)屬乳酸菌，於活體外強力誘導小鼠脾臟細胞之IL－12產生，為具改善Th1/Th2平衡的特徵的經選殖菌株。再者，經口投予本發明菌株至過敏模式小鼠，誘導脾臟細胞之IL－12產生，抑制脾臟細胞及腸間膜淋巴節細胞的IL－4產生，改善Th1/Th2平衡，抑制血清中抗原特異的IgE(Sashihara T,Sueki N,Ikegami S,“An analysis of the effectiveness of heat－killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases.”,Journal of Dairy Science,89,pp.2846－2855(2006),及國際專利申請WO2006/093022)。由於此方式，可謂強力誘導IL－12產生的菌株為過敏改善效果高的菌株。
本發明者們將Lactobacillus gasseri OLL2809菌株寄存於獨立行政法人製品評估技術基盤機構專利微生物寄存中心。以下記載寄存的特定內容。
(1)寄存機關：獨立行政法人製品評估技術基盤機構專利微生物寄存中心(2)聯絡地址：292－0818千葉縣木更津市鎌足2－5－8電話號碼0438－20－5580(3)寄存編號：NITE BP－72(4)識別用表示：Lactobacillus gasseri OLL2809(5)寄存日：平成17年(2005年)2月1日(6)進入布達佩斯條約寄存之移轉日：2006年1月18日Lactobacillus gasseri OLL2809菌株(寄存編號：NITE BP－72)為革蘭氏陽性菌，於Lactobacillus MRS Agar Difco上的菌落型態為圓形、淡黃色、扁平狀。生理學的特徵為均質乳酸發酵形式，於45℃的發育性，對葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、纖維雙糖(cellobiose)、乳糖、海藻糖(trehalose)具有發酵性。菌體增殖中，培養中的培養基pH較佳維持於6.0至7.0。
本發明之製造方法，以後述實施例確認IL－12產生的促進效果上升，不僅Lactobacillus gasseri OLL2809(寄存編號：NITE BP－72)、L.amylovorus JCM 1126T 及L.crispatus JCM 1185T ，亦可適用前文所述之其他乳酸菌，可獲得與以往的製造方法相比為具有高免疫機能調節活性之乳酸菌。
IL－12將未分化T細胞促進分化為Th1細胞，使Th1/Th2平衡偏向Th1側(Cross ML,Gill HS,“Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies？”,International Archives of Allergy and Immunology,125,pp.112－119(2001))。由於Th1/Th2平衡偏向Th2側而誘導過敏發病原因之一之抗原特異的IgE產生，由自然免疫擔任細胞誘導IL－12產生而改善Th1/Th2平衡的活性，成為過敏改善效果評估上的重要指標之一。本發明中，免疫機能調整活性包含IL－12產生的促進效果。
本發明之免疫機能調整劑藉由單獨或與醫藥品或食品中通常所使用之其他成分混合投予，或者與其他具有抗過敏活性之化合物或微生物等併用，於人類及動物中對過敏預防及過敏症狀的減輕(治療)有效。可使用於過敏預防及/或治療。已知異位性皮膚炎及過敏性鼻炎等過敏疾患，Th1/Th2平衡偏向Th2側為原因之一(Hopkin JM,“The rise of atopy and links to infection.”,Allergy,57 Suppl 72,pp.5－9(2002),及Prescott SL,Macaubas C,Smallacombe T,Holt BJ,Sly PD,Holt PG,“Development of allergen－specific T－cell memory in atopic and normal children.”,Lancet,353(9148),pp.196－200(1999),及Shirakawa T,Enomoto T,Shimazu S,Hopkin JM,“The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder.”,Science,275(5296),pp.77－79(1997))。本發明製造方法中所包含之培養方法具有乳酸菌IL－12產生能力再提高的效果。IL－12係由樹狀細胞產生，由於具有使成為Th1細胞的分化作用，可期待此方式所製得之乳酸菌具有高免疫機能調整效果，可使用作為免疫機能調整劑。過敏的種類並不特別限定，可列舉例如花粉症、異位性皮膚炎、支氣管氣喘、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏性胃腸炎、過敏(anaphylaxis)反應、藥物過敏、蕁麻疹、血清病、溶血性貧血、接觸性皮膚炎、重症肌無力、古德巴斯特(Goodpasture)症候群、腎絲球腎炎等。過敏原並無特別限定，可列舉例如食品(小麥、大麥、燕麥、黑麥、蕎麥、卵、乳、起司、花生、稻、玉米、粟、稷、稗、大豆、馬鈴薯、山薯、紅蘿蔔、洋蔥、人蔘、西洋香菜(parsley)、芹菜、蕃茄、橙、桃、蘋果、奇異果、甜瓜、草莓、香蕉、胡桃、芝麻、松茸、鮑魚、花枝、魚卵、蝦、蟹、鮭魚、鯖魚、鯵魚、鰯魚、鱈魚、烏賊、章魚、帆立貝、牛肉、雞肉、豬肉、明膠等)、動物(狗、貓、小鼠、大鼠、鴿等或其皮膚、體毛、糞便、羽毛等)、昆蟲(蛾、蚊、蜂等，及該等昆蟲之分泌物、鱗粉)、蝨、寄生蟲(線蟲、蛔蟲等)、草木(杉、檜、豬草、稻科植物、蓬草、漆樹、榛木等或其花粉等)、黴、灰塵、家庭灰塵、垃圾、金屬、化學物質、醫藥品等。
本發明之免疫機能調整劑對於醫藥品或飲食品之調配量，根據形態、劑型、症狀、體重、用途等而有所差異，並無特別限定，例如列舉可以0.001至100%(w/w)的含量調配，較佳可以0.01至100%(w/w)、再較佳以0.1至100%(w/w)的含量調配。
本發明之免疫機能調整劑之醫藥品或飲食品之毎日攝取量，根據年齡、症狀、體重、用途等而有所差異，並無特別限定，例如列舉可攝取0.1至10000mg/kg體重，較佳可攝取0.1至1000mg/kg體重、再較佳可攝取0.1至300mg/kg體重。
本發明之免疫機能調整劑可以醫藥品或飲食品之任何型態加以利用。例如，經由作為醫藥品直接投予，或經由作為特定保健用食品等特別用途食品或營養機能食品而直接攝取，可期待各種過敏之預防及/或治療。再者，不論為液狀、漿狀、固形、粉末等形態，亦可添加於各種食品(牛乳、加工乳、乳飲料、清涼飲料、發酵乳、優酪、起司、麵包、餅乾(biscuit)、鹹餅乾(cracker)、披薩麵皮、冰淇淋、糖果、調製乳粉、流體食物、患者用食品、幼兒用奶粉等食品、哺乳婦女用奶粉等食品、營養食品、冷凍食品、加工食品之其他市售食品等)，而將其攝取。
含有本發明免疫機能調整劑之食品，可混合水、蛋白質、糖質、脂質、維生素類、礦物質類、有機酸、有機鹼、果汁、調味劑類等而使用。蛋白質可列舉例如全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白質、乳清蛋白質濃縮物、乳清蛋白質分離物、α－酪蛋白、β－酪蛋白、－酪蛋白、β－乳球蛋白、α－乳球蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白質、雞蛋蛋白質、肉蛋白質等動物性蛋白質、該等之分解物；黃油(butter)、乳清礦物質、奶油(cream)、乳清、非蛋白質態氮、唾液酸、磷脂質、乳糖等源自各種乳的成分等。亦可含有酪蛋白磷肽、精胺酸、離胺酸等肽或胺基酸。糖質可列舉例如糖類、加工澱粉(除糊精外，可溶性澱粉、大英膠(British starch)、氧化澱粉、澱粉酯、澱粉醚等)、食物纖維等。脂質可列舉例如豬油(lard)、魚油等、該等之分別油、氫化油、酯交換油等動物性油酯；棕櫚油、紅花油、玉米油、菜籽油、椰子油、該等之分別油、氫化油、酯交換油等植物性油脂等。維生素類可列舉例如維生素A、葫蘿蔔素類、維生素B群、維生素C、維生素D群、維生素E、維生素K、維生素P、維生素Q、菸鹼素(niacin)、菸鹼酸、汎酸、生物素、肌醇、膽鹼、葉酸等，礦物質類可列舉例如鈣、鉀、鎂、鈉、銅、鐵、錳、鋅、鍶等。有機酸可列舉例如蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、酒石酸等。含有本發明免疫機能調整劑之飲食品的製造中，該等可為合成品或天然品來源品之任一者，或者多數可將含有該等之食品使用作為原材料。該等成分可2種以上組合使用。食品的形態可為固體或液體。又亦可為膠狀等。
本發明之免疫機能調整劑作為醫藥品使用時，可以各種形態投予。該等形態可列舉例如錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、液劑等經口投予，但亦可為經管等其他形態。該等各種製劑可根據常法，於主劑中使用醫藥製劑技術領域中通常使用之賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、矯臭劑、溶解輔助劑、懸濁劑、被覆劑等已知輔助劑而加以製劑化。又，亦可含有適當量的鈣。再者，亦可添加適當量之維生素、礦物質、有機酸、糖類、胺基酸、肽類等其他成分。
再者，本說明書中所引用之全部先前技術，合併於本說明書作為參考文獻。
實施例
以下雖列舉實施例說明本發明，但本發明不以該等為限。
[實施例1](培養時間對於IL－12產生的促進效果的影響的研究試驗)
L.gasseri OLL2809的培養時間對於IL－12產生的促進效果的影響，根據以下的試驗進行研究。
(乳酸菌的陪樣及凍結乾燥菌粉末的調製)L.gasseri OLL2809以Lactobacillus MRS Broth(以下亦稱為MRS培養基，Becton Dickinson)，賦活培養2次(37℃，18小時)。於MRS培養基接種1%經賦活之菌體，於37℃靜置培養。由培養開始，每固定時間(0、3、6、9、12、18、24、30小時後)取樣培養液。測定各時間培養液之OD600 ，作為乳酸菌數之指標。再者，各時間(除了0、3、9小時外)之培養液，藉由離心分離收集菌後，以生理食鹽水清洗2次，以滅菌蒸餾水清洗1次。培養及收集、清洗菌後，各菌於75℃加熱60分鐘滅菌後，凍結乾燥。凍結乾燥菌末(以下亦稱為乳酸菌凍結乾燥粉末)使用於以下之活體外IL－12產生的促進效果試驗。
(IL－12產生的促進效果試驗)殺死6至10週齡之雄性BALB/c小鼠(各試驗中n＝3，日SLC)，取出脾臟。將去除紅血球的脾臟細胞以成為2.5×106 /mL的方式，懸濁於添加有10%(vol/vol)胎牛血清(Invitrogen)、100U/mL盤尼西林G(Invitrogen)、100μg/mL鏈黴素(Invitrogen)、2mM L－麩胺酸(Invitrogen)、1mM丙酮酸鈉(Invitrogen)、0.1mM非必需胺基酸混合液(Invitrogen)、0.05mM 2－巰乙醇()之RPM1640培養基(Invitrogen)，於1μg/mL乳酸菌凍結乾燥粉末的存在下，於5%濃度之CO2 培養箱中培養2日。培養液上清液之IL－12(p70)(pg/mL)藉由ELISA法(BD OptEIATM ELISA組，Becton Dickinson)測定，用於IL－12產生的促進效果的評估。
(結果)結果示於第1圖。L.gasseri OLL2809之生長由6至12小時為止為對數增值，12小時以後至30小時為止為未觀察到有OD600 變化的恆定狀態。IL－12產生的促進效果於18小時後隨著培養時間而增加，18小時後最高為24小時，而30小時之加長培養時間則成為降低。由該結果可知，L.gasseri OLL2809於MRS培養基靜置培養時，IL－12產生的促進效果係根據培養時間而有所差異，亦即根據生長而增加之恆定期可維持活性。
[實施例2](培養基種類、成分對IL－12產生的促進效果影響的研究試驗)
為了調查IL－12產生的促進效果根據所培養之培養基而造成的差異，如以下試驗的方式，以各種的培養基或培養基中添加有營養成分之培養基，比較經培養之L.gasseri OLL2809之IL－12產生的促進效果。
(乳酸菌的培養、凍結乾燥菌末之調製及IL－12產生的促進效果試驗)於MRS培養基或GAM培養基(日水製藥)，接種1%之經以MRS培養基賦活培養(37℃，18小時)2次之L.gasseri OLL2809，於37℃靜置培養18小時。由培養開始，每固定時間(0、3、6、9、12、18小時後)取樣培養液。測定各時間培養液之OD600 ，作為乳酸菌數之指標。再者，培養18小時後的培養液，同時測定pH，以與實施例1同樣的方法調製乳酸菌凍結乾燥粉末，測定小鼠脾臟細胞之IL－12產生的促進效果。
(結果)結果示於第2圖。以GAM培養基所培養之菌體(第2B圖中之GAM)與以MRS培養基所培養之菌體(第2B圖中之MRS)相比較，顯示顯著(p<0.05)的低活性。再者，進行該等培養基成份差異的各種研究(數據未顯示)時可知，此乃由於GAM培養基之葡萄糖濃度低(MRS培養基含有最終濃度為20g/L的葡萄糖，GAM培養基含有最終濃度為3g/L的葡萄糖)。
再者，以於GAM培養基添加各種濃度之葡萄糖(最終濃度為5、10、20g/L)之培養基進行L.gasseri OLL2809之培養，所獲得之菌體以與實施例1同樣的方法進行處理(收集、清洗、滅菌、凍結乾燥)，進行小鼠脾臟細胞之IL－12產生的促進效果試驗。結果示於第2B圖中之GAM＋glucose。於GAM培養基中添加葡萄糖，葡萄糖最終濃度依賴性之生長及IL－12產生的促進效果為增加(第2A圖)，葡萄糖最終濃度為20g/L之GAM培養基所培養之菌體，與一般GAM培養基(第2B圖中之GAM)所培養之菌體相比較，活性為顯著增加(p<0.05)。
進行葡萄糖的添加對L.gasseri OLL2809的活性等影響的研究時，亦考慮培養液的pH對活性所造成的影響。亦即，以GAM培養基中葡萄糖的最終濃度低，與MRS培養基相比較時，生長不佳，再者，由於來自L.gasseri OLL2809的乳酸生成量低，18小時後之培養液pH，相對於MRS培養基的4.0，GAM培養基為5.5。於GAM培養基中添加葡萄糖，於最終濃度為3(未添加)、5、10及20g/L之葡萄糖濃度之培養基，伴隨菌的生長及乳酸生成量的增加，培養液培養18小時後的pH分別降低為5.5、4.8、4.4及4.3。再者，分析以GAM培養基培養L.gasseri OLL280918小時之培養液pH與菌體之IL－12的產生具促進效果的相關時，確認該pH範圍中，兩者之間有顯著負相關(p<0.05)(第2C圖，y＝－987.01x＋5696.7，n＝4)。另外，葡萄糖最終濃度與菌體之IL－12產生的促進效果，未確認有該等之相關關係。由上述可推知，培養液pH對於菌體之IL－12的產生具促進效果有影響。
[實施例3](培養液的pH對於IL－12的產生具促進效果賦予影響的研究試驗)
為了詳細研究培養液pH對於L.gasseri OLL2809的活性所造成的影響，藉由以下試驗評估以中和培養所培養之L.gasseri OLL2809之IL－12產生的促進效果的經時變化。
(乳酸菌的培養、凍結乾燥菌末的調製及IL－12的產生具促進效果試驗)使用2L之發酵罐，以饋入培養基量1.5L、攪拌速度200rpm/min、藉由氮氣於上面通氣、培養溫度37℃的條件，於MRS培養基(起始pH約6.4)培養L.gasseri OLL2809。使用pH調控器將pH設定為4、5或6，使不降低於設定值以下的方式，使用10%(wt/wt)的碳酸鉀溶液中和培養。培養開始6、12、18小時後之L.gasseri OLL2809培養液以與實施例1同樣的處理(收集、清洗、滅菌、凍結乾燥)製得凍結乾燥菌末，將該等菌末以與實施例1同樣的方法研究IL－12產生的促進效果。再者，測定培養開始之3、6、9、12、15、18小時後之培養液之生菌數及pH。
(結果)結果示於第3圖。生菌數為不論培養液之設定pH，幾乎以相同傾向偏移，培養開始12小時以後，任一設定之pH皆達到恆定期。最終所設定pH為6者，與設定pH為5或4者相比，約為一半(第3A圖)。另外，培養液的pH由培養開始6小時後，設定為pH及5之培養液並無差異，12小時以後之該等培養液則幾乎接近所設定之pH(第3B圖)。
IL－12產生的促進效果由培養開始至6小時後，根據培養液的設定確認並無差異，任一者皆顯示低的值，12小時以後則顯示比酸性側的設定pH者更高的值(第3C圖)。另外，以設定pH 6培養時，與培養時期無關，IL－12產生的促進效果於任何時間皆為低。由上述可知，根據培養液之pH，L.gasseri OLL2809的IL－12產生的促進效果有所差異。由此可知，培養液的pH對於IL－12產生的促進效果為重要者。
[實施例4](培養液的pH對其他乳酸菌之IL－12產生的促進效果的影響的研究試驗)
培養液的pH對L.gasseri OLL2809以外之其他乳酸菌之IL－12產生的促進效果的影響，根據以下試驗進行研究。
(乳酸菌的培養、凍結乾燥末的調製及IL－12產生的促進效果試驗)將經賦活培養(37℃，18小時)之L.amylovorus JCM 1126T 及L.crispatus JCM 1185T ，於MRS培養基(CaCO3 ，0%)或添加有作為pH緩衝劑之0.6%CaCO3 之MRS培養基，接種1%，於37℃培養18小時。培養液以與實施例1同樣的方法處理(收集、清洗、滅菌、凍結乾燥)後，測定脾臟細胞之IL－12產生的促進效果。本培養中，為防止CaCO3 的沉澱，於磁性攪拌子以70rpm/min的回轉速度攪拌下進行培養。
又，該等菌株名中之JCM與所記載之菌株，係由獨立行政法人理化學研究所生物資源中心(Bioresource Center)之微生物材料開發室所取得之基礎菌株。
(結果)結果示於第4圖。與MRS培養基單獨時相比較，添加有0.6%濃度CaCO3 之MRS培養基中，L.amylovorus JCM 1126T 及L.crispatus JCM 1185T 於培養18小時後之培養液pH分別由3.8(CaCO3 ，0%)成為4.5(CaCO3 ，0.6%)、由3.9(CaCO3 ，0%)成為4.5(CaCO3 ，0.6%)之緩衝成為中性側，生菌數分別由1.3×109 cfu/ml(CaCO3 ，0%)增加為2.3×109 cfu/ml(CaCO3 ，0.6%)、由7.3×107 cfu/ml(CaCO3 ，0%)增加為2.3×109 cfu/ml(CaCO3 ，0.6%)。然而，L.amylovorus JCM 1126T 及L.crispatus JCM 1185T 任一者之IL－12產生的促進效果皆由於CaCO3 的添加而顯著降低(p<0.05)。由該結果可知，IL－12產生的促進效果受培養液pH所影響的現象，不僅為L.gasseri OLL2809，係其他乳酸菌所共通之現象。
[實施例5](培養液pH對IL－12產生的促進效果賦予影響的研究試驗)
為了解析由於培養液的pH使L.gasseri OLL2808之IL－12產生的促進效果差異的原因，於MRS培養基靜置培養18小時，調製IL－12產生的促進效果高的菌體，再將該菌體以加熱處理或不加熱處理後，於pH不同的緩衝液中，於37℃放置6小時，之後比較IL－12產生的促進效果。
(乳酸菌之培養、樣品之調製及IL－12產生的促進效果試驗)於MRS培養基、37℃培養18小時之L.gasseri OLL2809，以與實施例1同樣的方法收集、清洗後，接著不加熱而進行凍結乾燥。不加熱之凍結乾燥菌末以成為4mg/mL的方式懸濁於蒸餾水，該菌體懸濁液以含有4mM之MgCl2 的20mM抗壞血酸緩衝液(pH為4、5、6)，以1：1稀釋，調製菌體懸濁液(2mg/mL)。各菌體懸濁液的一半量於75℃加熱處理60分鐘(加熱處理樣品：heated)，剩下的一半量直接不加熱(不加熱樣品：unheated)。之後，各樣品於37℃放置6小時後，放置於室溫。對照組係使用於MRS培養基中於37℃培養18小時之L.gasseri OLL2809以與實施例1同樣的方法收集、清洗、滅菌後凍結乾燥之凍結乾燥菌末。各樣品以與實施例1同樣的方法，測定小鼠脾臟細胞之IL－12產生的促進效果。
結果示於第5圖。加熱處理後放置時，與對照組相比較，任何pH皆無法確認較差。不加熱時，與對照組相比較，放置於中性域pH之菌體，IL-12產生的促進效果降低。由該結果可知，L.gasseri OLL2809之IL-12產生的促進效果雖於中性域pH減少，但於pH為4時，至少安定6小時。再者，該結果與至目前的各條件中，L.gasseri OLL2809的培養，以培養液的pH為約5以上使IL-12產生的促進效果變低為一致，而咸認為此乃肇因於中性域pH使有效成分分解(或抑制生合成)之故。該IL-12產生的促進效果的降低可推定與酵素等感受性高的物質相關。
產業上可利用性
由於可製得免疫調節活性高的乳酸菌，使用該等乳酸菌可製造具有免疫調節活性之飲食品及醫藥品。
第1圖顯示根據培養時間，L.gasseri OLL2809之生長及I1-12產生的促進效果的經時變化圖。圓點(●)表示OD660 ，棒表示小鼠脾臟細胞培養上清液的IL-12(p70)(pg/mL)。IL的數據以平均值±標準偏差(n=3)表示。NT：未測試。
第2圖顯示培養基及培養基成分對於L.gasseri OLL2809之IL-12產生的促進效果的影響圖。MRS、GAM或GAM培養基中添加葡萄糖之培養基之L.gasseri OLL2809的生長(第2A圖)，培養18小時後的菌體之IL-12產生的促進效果(第2B圖)及IL-12產生的促進效果(IL-12(p70)(pg/mL))的平均值與培養18小時後pH的相關圖(第2C圖)。第2A圖中，圓點(●)：MRS培養基，黑三角(▲)： GAM培養基，黑四方(■)：GAM培養基+葡萄糖(最終濃度(培養前的培養基之最終濃度)5g/L)，空心圓圈(○)：GAM培養基+葡萄糖(最終濃度10g/L)，白三角(△)：GAM培養基+葡萄糖(最終濃度20g/L)。第2B圖中，橫軸的數字表示培養基中葡萄糖濃度(最終濃度，g/L)。又，第2B圖表示平均值±標準偏差(n=3)。*：p<0.05(Student反複t-test)，#：p<0.05(Dunnet test)。
第3圖顯示pH經控制之L.gasseri OLL2809的培養(第3A圖：生菌數(log cfu/mL)，第3B圖：pH)及IL-12產生的促進效果(第3C圖)的經時變化圖。第3A圖及第3B圖中，圓點(●)：設定pH 4，黑三角(▲)：設定pH 5，黑四方(■)：設定pH 6。
第4圖顯示MRS培養基之CaCO3 的添加對於L.amylovorus JCM 1126T 及L.crispatus JCM 1185T 之IL-12產生的促進效果的影響圖。表示為平均值±標準偏差(n=3)。*：p<0.05(Student反複t-test)。
第5圖顯示於不同pH緩衝液中培養的L.gasseri OLL2809之IL-12產生的促進效果的變化圖。「加熱」表示加熱處理樣品，「非加熱」表示不加熱樣品。對照組為於MRS培養基靜置培養18小時，於75℃加熱處理60分鐘之L.gasseri OLL2809之凍結乾燥菌末。表示為平均值±標準偏差(n=3)。

Claims (4)

  1. 一種含有乳酸菌之免疫機能調整劑之製造方法，係包含以pH 3.5至pH 4.5的培養基培養加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri OLL2809，寄存編號NITE BP-72(BCRC910317))的步驟。
  2. 一種免疫機能調整劑，係以申請專利範圍第1項之製造方法所製造者。
  3. 一種過敏之預防及/或治療用的醫藥品，係含有申請專利範圍第2項之免疫機能調整劑。
  4. 一種如申請專利範圍第2項之免疫機能調整劑之用途，其係用於過敏之預防及/或治療用的醫藥品之製造。
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