JP2022525932A

JP2022525932A - Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの菌株

Info

Publication number: JP2022525932A
Application number: JP2021556510A
Authority: JP
Inventors: リンデンフー，; ルイスコルナチオネ，
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2022-05-20
Also published as: US20240226193A9; AU2020241983A1; EP3941578A1; WO2020191111A1; US20220193153A1; CN114126632A; US11786565B2; EP3941578A4; CA3134046A1; KR20210153057A; US20240131087A1

Abstract

本明細書に開示されるのは、歯周病を治療するための組成物及び方法である。この方法は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を発現する細菌株を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。いくつかの実施形態では、細菌株は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株などの操作された細菌株である。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年３月１８日に出願の米国仮出願第６２／８２０，２１０号及び２０１９年４月２３日に出願の米国仮出願第６２／８３７，６９０号の利益を主張している。上記の出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。

政府支援
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＤＥ０２４３０８及びＤＥ０２５５２３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

口腔の健康に対する態度が改善されているにもかかわらず、歯周病は依然として蔓延している問題であり、差し迫った健康リスクを超えて、重大な付随的経済コストが発生する。２０１５年には、サーバーの歯周炎とそれに伴う歯の喪失による、治療費と生産性の損失との合計は、世界全体で１，６４０億ドル、北米のみで４４０億ドルと推定されている。米国におけるある程度の歯周病の発生率は、６０歳超の人口の６０％超まで上昇している。疾患の現在の治療法はスケーリング及びルートプレーニングと呼ばれ、歯肉縁下の歯垢を取り除き、歯根の表面を滑らかにして歯茎の再付着を促進することを目的としている。この治療は痛みを伴い、多くの場合、広範な在宅ケアのコンプライアンス及びフォローアップ訪問を必要とする。さらに、スケーリング及びルートプレーニングは予防的治療の選択肢ではないため、費用効果は低くなる。抗生物質が治療のために処方されることもあるが、これは抗生物質耐性の時代では望ましくない治療選択肢であり、ヒトの微生物叢に対する広域抗生物質の効果についての理解が深まっている。新規予防療法に焦点を当てた研究は、口腔の健康及び歯周病の治療の経済性に大きい影響を与える可能性を有する。

疾患を予防するためにプロバイオティクス微生物を使用することに関心が高まっているにもかかわらず、プロバイオティクスがその作用を発揮するメカニズムについてはほとんど理解されていない。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｇ）は、歯周炎の発症に関与する重要な病原体である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのいくつかの菌株が乳製品から単離され、ｉｎｖｉｔｒｏでＰｇの成長を阻害する能力について、本明細書に記載のとおり調査されている。Ｐｇ成長の菌株特異的阻害がｉｎｖｉｔｒｏで観察された。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの阻害株及び非阻害株の全ゲノム配列決定により、相互作用の菌株特異性を裏付ける有意な遺伝的差異が明らかになった。ＳＴＹＭ１Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ阻害株の抽出物は、熱、プロテイナーゼＫ、カタラーゼ、及び亜硫酸ナトリウムでの処理によって無効になる阻害活性を呈する。硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ抽出物から天然の阻害タンパク質（複数可）を部分的に精製し、存在する最も富化されたオキシダーゼとしてピルビン酸オキシダーゼを同定した。ＳＴＹＭ１抽出物にピルビン酸オキシダーゼ基質及び補因子を添加することにより、過酸化水素の生成が促進される。最後に、本明細書では、精製された触媒的に活性な組換えピルビン酸オキシダーゼが、補因子を添加することなく、ｉｎｖｉｔｒｏでのＰｇの成長の阻害に十分であることを示している。結果は、微生物の相互作用を理解する上で、単に種の選択のみでなく、菌株を選択することの重要性を強調している。特定のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株またはその生成物は、Ｐｇ関連歯周病の治療及び予防に効果的であり得る。

本明細書に開示されるのは、対象の歯周病を治療する方法である。この方法は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を発現する細菌株を対象に投与することを含み得る。

いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。いくつかの実施形態では、細菌株は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株などの操作された細菌株である。いくかの実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｕｒｕｍからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７である。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害する。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して一定量の過酸化水素阻害剤を産生し、それによって対象の歯周病を治療する。いくつかの実施形態では、細菌株を対象に投与することにより、口腔微生物叢の腸内毒素症が矯正される。

いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物は、リン脂質によって活性化される。いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物は、ホスホチジルエタノールアミン（phosphotidylethanolamine）によって活性化される。

ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子を含む操作された細菌株も本明細書に開示されている。

いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である。いくつかの実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。いくつかの実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細菌株は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作される。いくかの実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｕｒｕｍからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７である。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害する。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して一定量の過酸化水素阻害剤を産生する。

本明細書に記載の操作された細菌株を含む医薬組成物も本明細書に開示される。

本明細書に開示されるのは、対象の歯周病を治療する方法である。この方法は、ＳＴＹＭ１ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子産物を発現する操作された細菌株を対象に投与することを含み得、ここで、細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である。

また、本明細書に開示されているのは、操作された細菌株である。操作された細菌株は、ＳＴＹＭ１ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子を含み得、ここで、細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である。

特許または出願ファイルは、カラーで実施された少なくとも１つの図面を含む。この特許または特許出願の刊行物のカラー図面付きのコピーは、リクエスト及び必要な料金の支払いにより、特許庁から提供される。

図１Ａ～１Ｂは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ阻害が、菌株特異的であることを示す。図１Ａは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの異なる菌株を用いた寒天オーバーレイアッセイを示す。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株をスポットし、嫌気的に２日間成長させた。プレートを好気性環境に移し、ここでは、クロロホルム蒸気への曝露によって菌株を死滅させ、次にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種したソフト寒天を重層し、インキュベートし、撮像した。図１Ｂは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの異なる菌株を用いたスポットアッセイを示している。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株をスポットし、嫌気的に２日間成長させた。プレートを好気性環境に移し、そこでＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓをＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉスポットに隣接してスポットし、乾燥させ、嫌気的に２日間インキュベートした。プレートは、成長の最後の２日後に撮像した。図２Ａ～２Ｅは、ＳＴＹＭ１細胞抽出物が阻害活性を有することを示す。抽出物をプレートにスポットし、好気性条件下で乾燥させ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種したソフトトップアガーを重層した。プレートは嫌気性成長の２日後に撮像した。図２Ａは、ＳＴＹＭ１、ＳＹＢ１３、ＳＹＢ７、及び１１８４２からのタンパク質量が等しい可溶性細胞抽出物を使用した寒天オーバーレイアッセイを示している。図２Ｂ～２Ｅには、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔＫ）または加熱殺菌プロテイナーゼＫ（加熱殺菌ＰｒｏｔＫ）（図２Ｂ）、１０ｋＤａＭＷＣＯフィルタ（流出及び濃縮）を通過させること（図２Ｃ）、熱処理（９５℃で２０分間）（図２Ｄ）、または１０μｇのカタラーゼ（図２Ｅ）のいずれかで処理したＳＴＹＭ１細胞抽出物を用いた寒天オーバーレイアッセイを示す。図３Ａ～３Ｃは、ＳＴＹＭ１細胞抽出物の分画を示す。図３Ａは、陰イオン交換クロマトグラフィーからのプールされた阻害画分のゲルろ過の溶出液の２８０ｎｍでの吸光度のトレースを示している。画分は、５００μＬの容量で１０ｍＬから開始して収集した。図３Ｂは、パネルＡからのゲルろ過画分７から１２の寒天オーバーレイを示す。画分をプレート上にスポットし、好気性条件下で乾燥させ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種したソフトトップアガーを重層した。プレートは、好気性成長の２日後に撮像した。図３Ｃには、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離後のゲルろ過画分の７～１３のクーマシー染色を示す。質量分析のために、画分９の７０ｋＤａバンドを切り出した。図４Ａ～４Ｂは、トランスポゾンをＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓｆｅｏＢ２オペロンへ挿入することにより、ＳＴＹＭ１抽出物による殺滅に対する耐性が付与されることを示す。図４Ａは、ＳＴＹＭ１細胞抽出物への曝露後に単離されたトランスポゾン変異体の固有のトランスポゾン挿入位置を青い矢印で示している。単離された変異体のいくつかは同じ挿入部位を有するため、固有の挿入部位のみをマークしている。図４Ｂは、ｆｅｏＢ２トランスポゾン変異体耐性表現型の確認を提供する。ＳＴＹＭ１抽出物への３時間の曝露後のＣＦＵ数は、野生型Ｗ８３親株、トランスポゾン変異体を含むｆｅｏＢ２（Ｔｎ－ＦｅｏＢ２）、野生型ｆｅｏＢ２遺伝子と相補であるＴｎ－ＦｅｏＢ２株（Ｔｎ－ＦｅｏＢ２Ｃｏｍｐ）、及び空のｐＴ－Ｃｏｗベクターと相補であるＴｎ－ＦｅｏＢ２株（Ｔｎ－ＦｅｏＢ２Ｅｍｐｔｙ）について示されている。データは、３つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。統計的有意性は、一元配置分散分析によって決定した（^＊＊＊、ｐ＜０．００１）。図５Ａは、ＳＴＹＭ１抽出物にピルビン酸オキシダーゼ基質及び補因子を補充することによりＨ_２Ｏ_２の生成が促進されることを示す。図５Ａは、室温でのインキュベーション後の直径６ｍｍのウェル中の５０μＬの既知濃度のＨ_２Ｏ_２を含むプルシアンブルー寒天プレートを示している。図５Ｂは、ＳＴＹＭ１抽出物にピルビン酸オキシダーゼ基質及び補因子を補充することによりＨ_２Ｏ_２の生成が促進されることを示す。図５Ｂは、ＳＴＹＭ１細胞抽出物のみ、またはＰｏｘ基質、Ｐｏｘ基質＋補因子、もしくはＬｏｘ基質＋補因子を補充したＳＴＹＭ１細胞抽出物を含むプルシアンブルー寒天プレートを示す。陰性対照として１１８４２株の細胞抽出物および、示された基質または補因子を含む抽出物なしの対照も含む。画像は、３つの独立した実験の代表である。図５Ｃは、ＳＴＹＭ１抽出物にピルビン酸オキシダーゼ基質及び補因子を補充することによりＨ_２Ｏ_２の生成が促進されることを示す。図５Ｃは、プルシアンブルーハロの直径を要約した表を提供する。各条件についてのプルシアンブルー染料の平均直径プラスマイナス平均に関する標準誤差。データは、３回の独立した実験の平均を表している。図５Ｄは、３つの独立した実験でのパネルＢのＳＴＹＭ１抽出物サンプルについて、プルシアンブルーの直径から内側ウェル（直径６ｍｍ）を引いた測定値を示している。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。多重比較のために修正された一元配置分散分析によって決定された統計的有意性（^＊，Ｐ＜０．０５；^＊＊，Ｐ＜０．０１；^＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。図６Ａ～６Ｄは、ＳＴＹＭ１抽出物のオキシダーゼ阻害剤による処理を示す。抽出物をプレートにスポットし、好気性条件下で乾燥させ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種したソフトトップアガーを重層した。プレートは嫌気性成長の２日後に撮像した。ＳＴＹＭ１抽出物を、示された濃度のアジ化ナトリウム（図６Ａ）、シュウ酸ナトリウム（図６Ｂ）、亜硫酸ナトリウム（図６Ｃ）、またはＥＤＴＡ（図６Ｄ）のいずれかで処理し、寒天オーバーレイアッセイで試験した。注：Ｄには、ＭｎＣｌ_２を補充したものも含む。黒い点は、抽出物がプレートの表面に追加された場所を示す。図７Ａ～７Ｃは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘが、ＬＤＢＮＤ＿２０５１Ｐｏｘよりも高度に発現していることを示す。図７Ａは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ及びＬＤＢＮＤ＿２０５１ＰｏｘのＣ末端領域のアラインメントを示している。上記のＮ末端領域は同一である。図７Ｂは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７及びＬＤＢＮＤ＿２０５１のプロモーター領域と、予測される－３５及び－１０部位ならびにリボソーム結合部位、ならびに示された開始コドンとのアラインメントを示す。図７Ｃは、細胞抽出物採取時のＳＴＹＭ１における２つのピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のレベルの発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定したことを示す図である。グラフは、各サンプル内のＬＤＢＮＤ＿２０５１対ＬＤＢＮＤ＿１４８７の平均発現レベルを表している。ＬＤＢＮＤ＿１４８７の発現は、各サンプル中で１つに設定した。データは、３つの独立した実験を表し、エラーバーは平均に関する標準誤差を表す。統計的有意性は、両側ｔ検定によって決定した（^＊＊，ｐ＜０．０１）。図８Ａは、精製されたＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘは触媒的に活性であり、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害するのに十分であることを示す。図８Ａは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７ＰｏｘのＮｉ－ＮＴＡ精製からの画分のクーマシー染色を提供する：フロースルー（ＦＴ）、洗浄１（Ｗ１）、洗浄２（Ｗ２）、溶出１（Ｅ１）、及び溶出２（Ｅ２）（左ブロット）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の精製Ｐｏｘのクーマシー染色（中央ブロット）、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の精製１４８７－Ｐｏｘ及び２０５１－Ｐｏｘのクーマシー染色（右ブロット）。図８Ｂは、精製されたＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘは触媒的に活性であり、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害するのに十分であることを示す。図８Ｂは、ピルビン酸オキシダーゼ活性アッセイにおけるＨ_２Ｏ_２濃度の標準曲線を提供する。図８Ｃは、精製されたＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘは触媒的に活性であり、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害するのに十分であることを示す。図８Ｃは、図８Ａの精製されたＰｏｘの１：１０希釈物を用いたピルビン酸オキシダーゼ活性アッセイを示す。ピルビン酸オキシダーゼ活性は、毎分Ａ_５５０の変化を計算し、図８Ｂの標準曲線に外挿することによって決定する。Ｐｏｘ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＨ_２Ｏ_２の生成として定義される。図８Ｄは、精製されたＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘは触媒的に活性であり、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害するのに十分であることを示す。図８Ｄは、精製された１４８７－Ｐｏｘまたは２０５１－Ｐｏｘ単独、あるいは基質及び／または基質及び補因子が補充された精製された１４８７－Ｐｏｘまたは２０５１－Ｐｏｘの寒天オーバーレイアッセイを示す。バッファ対照も含む。酵素混合物をプレートにスポットし、好気性条件下で乾燥させ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを接種したソフトトップアガーを重層した。プレートは嫌気性成長の２日後に撮像した。図８Ｅは、ピルビン酸オキシダーゼ活性を、５５０ｎｍでの吸光度を有するキノンイミン色素の西洋ワサビペルオキシダーゼ触媒形成を利用する酸化カップリング反応によって測定したことを示している。このアッセイでは、Ｐｏｘ酵素によるＨ_２Ｏ_２の生成を測定する。ピルビン酸オキシダーゼ活性は、１分あたりのＡ_５５０の変化を測定し、材料及び方法の式に従ってその活性を計算することによって決定した。Ｐｏｘ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＨ_２Ｏ_２の生成として定義される。少なくとも３つの異なる精製における１４８７－Ｐｏｘ及び２０５１－Ｐｏｘの平均比活性（Ｕ／ｍｇ）が示されている。エラーバーは平均の標準誤差を表し、有意性は両側ｔ検定によって決定した（ｎｓ、有意ではない）。図９Ａ～９Ｂは、ＳＴＹＭ１の自己溶解による４８時間上清への細胞内成分の放出がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害することを示す。図９Ａは、ＢＨＩ中で成長したＳＴＹＭ１株からの一晩または４８時間の上清の添加ありまたはなしでの、２日後のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのエンドポイントの成長を示している。データは３つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは平均に関する１標準誤差を表す。統計的有意性は、一元配置分散分析によって決定した（^＊＊＊ｐ＜０．００１）。図９Ｂは、嫌気性条件下でＢＨＩまたは２％グルコースを補充したＢＨＩのいずれか中で成長したＳＴＹＭ１株の成長曲線を示している。成長曲線は、３回の独立した実験の平均を表している。エラーバーは、標準誤差を表している。図１０Ａは、ｐｏｘ領域、ｌｏｘ領域、及びｍｃｏ領域のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉゲノムの不均一性を示す。図１０Ａは、ＳＴＹＭ１、ＳＹＢ７、及び１１８４２のｐｏｘ領域の遺伝子マップを提供する。示されているのは、仮想の膜タンパク質（オレンジ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＬＤＢＮＤ＿１４８７）（ｐｏｘ、青）、及びＤ－Ａｌａ－Ｄ－Ａｌａカルボキシペプチダーゼ（ｄａｃＡ、黄色）である。図１０Ｂは、ｐｏｘ領域、ｌｏｘ領域、及びｍｃｏ領域のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉゲノムの不均一性を示す。図１０Ｂは、ＳＴＹＭ１、ＳＹＢ７、及び１１８４２のｌｏｘ領域の遺伝子マップを提供する。示されているのは、オリゴペプチダーゼＦ（ｐｅｐＦ、赤）、乳酸オキシダーゼ（ｌｏｘ、青）、乳酸パーミアーゼ（ｌｃｔＰ、緑）、亜鉛リボンタンパク質（濃紫）、及びＭｎ／Ｚｎパーミアーゼ（薄紫）である。図１０Ｃは、ｐｏｘ領域、ｌｏｘ領域、及びｍｃｏ領域のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉゲノムの不均一性を示す。図１０Ｃは、ＳＴＹＭ１、ＳＹＢ７、及び１１８４２のｍｃｏ領域の遺伝子マップを提供する。示されているのは、ペプチド放出因子Ｃ（ｐｒｆＣ、アクア）、仮想タンパク質（オレンジ）、マルチ銅オキシダーゼ（ｍｃｏ、緑）、及びＣｌｐＥプロテアーゼ（ｃｌｐＥ、赤）である。図１１は、ＳＴＹＭ１抽出物がシリンガラジン（ｓｙｒｉｎｇａｌａｚｉｎｅ）基質に対してラッカーゼ活性を有さないことを示す。ＳＴＹＭ１抽出物を西洋ワサビペルオキシダーゼ及びシリンガラジンの混合物に添加して、ラッカーゼ活性についてアッセイした。ＳＴＹＭ１抽出物を含まないバッファ対照を含み、過酸化水素、ペルオキシダーゼ、及びシリンガラジンを含む陽性対照を使用して、シリンガラジンの酸化を可視化した。図１２は、歯周炎における多微生物の相乗効果及び腸内毒素症を示す。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉの阻害株がその効果を発揮するメカニズムは、ピルビン酸オキシダーゼの酵素活性によるものであった。プロバイオティクス細菌が病原菌の成長を阻害できるメカニズムを理解することは、歯周炎の予防戦略の開発（evelopment）において重要であり得る。図１２は、歯周炎における多微生物の相乗効果及び腸内毒素症を示す。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉの阻害株がその効果を発揮するメカニズムは、ピルビン酸オキシダーゼの酵素活性によるものであった。プロバイオティクス細菌が病原菌の成長を阻害できるメカニズムを理解することは、歯周炎の予防戦略の開発において重要であり得る。図１３Ａ～１３Ｃは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの速度論的パラメータを示す。図１３Ａは、反応混合物中のピルビン酸塩の様々な濃度でのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの酵素速度を示している。図１３Ｂは、反応混合物中の様々な濃度のリン酸塩でのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの酵素速度を示している。両方のパネルで、酵素濃度は１．７６ｕＭであった。データは２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１３Ｃは、様々なｐＨでの酵素比活性を示している。データは２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１４Ａは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのオリゴマー状態を示す。図１４Ａは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのサイズ排除クロマトグラフィーを提供する。８４０ｕｇのＰｏｘを５０ｍＭピルビン酸塩、３００ｕＭＴＰＰ、及び１５ｕＭＦＡＤと組み合わせて、カラムにアプライした。２８０ｎｍでの吸光度は、矢印で示す既知のタンパク質標準の溶出位置と共に示す。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの計算された重量は、標準曲線に基づいて示されている。１ｍＬの画分を、１０ｍＬの溶出容量から始めて溶出の最後まで収集した。図１４Ｂは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのオリゴマー状態を示す。図１４Ｂは、既知のタンパク質標準に対するゲルろ過溶出容量の標準曲線を提供する。図１４Ｃは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのオリゴマー状態を示す。図１４Ｃは、非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲルろ過からの示された画分のクーマシー染色を提供する。図１４Ｄは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのオリゴマー状態を示す。図１４Ｄは、還元（５％ベータ－メルカプトエタノール）及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の精製Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのクーマシー染色を提供する。図１５Ａ～１５Ｂは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘが、ホスホチジルエタノールアミンによって特異的に活性化されることを示す。図１５Ａは、リン脂質を添加しない酵素活性と比較して、様々な濃度のホスホチジルエタノールアミン（１６：０～１８：１）（ＰＥ）、ホスホチジルコリン（phosphotidylcholine）（１６：０～１８：１）（ＰＣ）、及びホスホチジルグリセロール（phosphotidylglycerol）（１６：０～１８：１）（ＰＧ）を含むＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの倍数活性（fold activity）を示す。データは、２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１５Ｂは、ＰＥを含まない酵素活性と比較して、様々な濃度のＰＥを含むＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの倍数活性を示している。データは、少なくとも２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１６Ａ～１６Ｂは、ＰＥの存在下でのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの速度論的パラメータを示す。図１６Ａは、７．２ｍＭのＰＥを含む反応混合物中のピルビン酸塩の様々な濃度でのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの酵素速度を示している。図１６Ｂは、７．２ｍＭのＰＥを含む反応混合物中のリン酸塩の様々な濃度でのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの酵素速度を示している。両方のパネルで、酵素濃度は１７０ｎＭであった。データは２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１７は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉがＰＥと共沈しないことを示す。５０ｍＭピルビン酸塩、３００ｕＭＴＰＰ、及び１５ｕＭＦＡＤを含むＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを、１ｍＭＰＥまたは脂質なしでインキュベートした。３０分後に遠心分離により脂質画分をペレット化した。示されているのは、脂質ペレット画分（Ｐ）または可溶性画分（Ｓ）のいずれかのクーマシー染色である。図１８Ａ～１８Ｃは、Ｃ末端の３２アミノ酸が脂質の活性化に重要であることを示す。図１８Ａは、精製されたΔ３２Ｐｏｘ酵素のクーマシー染色を提供する。図１８Ｂは、精製されたΔ３２Ｐｏｘ酵素の比活性を示している。データは２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１８Ｃは、ＰＥを含まない酵素活性と比較して、様々な濃度のＰＥを有するΔ３２Ｐｏｘ酵素の倍数活性を示す。データは、２つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。図１９Ａ～１９Ｂは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのＳＴＹＭ１株に３つのオキシダーゼが固有に存在することを示す。図１９Ａは、ＳＴＹＭ１におけるオキシダーゼを特定する表を提供する。ＳＴＹＭ１のオキシダーゼの遺伝子番号及び名前を列挙している。また、オキシダーゼが非阻害剤株中に存在するかどうかも示している。図１９Ｂは、固有のＳＴＹＭ１オキシダーゼの特性を特定する表を提供する。図２０は、本明細書で使用される細菌株及びプラスミドを要約した表を提供する。図２１は、本明細書に記載の実施例１で使用されるプライマーを要約した表を提供する。図２２は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの速度論的パラメータを要約した表を提供する。各パラメータの値は、標準誤差と共に列挙している。図２３は、ＰＥを用いたＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの速度論的パラメータを要約した表を提供する。各パラメータの値は、標準誤差と共に列挙している。図２４は、本明細書に記載の実施例２で使用されるプライマーを要約した表を提供する。

発明の詳細な説明
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、歯周病の発症及び進行に関与しており、いくつかの全身性疾患に関連している。プロバイオティクス細菌は、歯周病の魅力的な予防療法である。しかし、プロバイオティクス細菌の有効性は研究ごとに変化し得る。本明細書に提示されたデータは、単に単一の種ではなく、プロバイオティクス使用のために細菌の特定の菌株を選択することの既知の重要性を裏付けている。具体的には、歯周炎のプロバイオティクス介入のコンテキストでは、データは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ中での過酸化水素生成を伴うピルビン酸オキシダーゼの高レベルの発現が、プロバイオティクスサプリメントまたは微生物治療薬の設計にとって重要な特徴となり得ることを示唆している。

本明細書に開示されるのは、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘ）遺伝子産物を発現する細菌株を対象に投与することによって、対象の歯周病を治療する方法である。いくつかの態様では、細菌株は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細菌株である。例えば、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細菌株は、ＳＴＹＭ１またはＧＶＫＭ１であってもよく、いずれもヨーグルト製品から単離されている。いくつかの態様では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細菌株は、生乳から単離されている。特定の実施形態では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細菌株は、ＳＴＹＭ１である。

いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１またはＧＶＫＭ１の抽出物は、過酸化水素を生成する。過酸化水素は、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘ）、乳酸オキシダーゼ（ｌｏｘ）、またはマルチ銅オキシダーゼ（ｍｃｏ）（これらは、ＳＴＹＭ１中に存在するすべての遺伝子である）によって生成され得る。いくつかの態様では、過酸化水素は抗菌効果を発揮するため、過酸化水素を生成することは、ＳＴＹＭ１抽出物中の阻害タンパク質の機能である可能性が高い。特定の実施形態では、ｐｏｘは、ＳＴＹＭ１抽出物中の主要な過酸化水素生成酵素である。いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１は、２つの予測されるｐｏｘ遺伝子をコードする。ある態様では、ＳＴＹＭ１は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７及びＬＤＢＮＤ＿２０５１をコードする。特定の実施形態では、ＳＴＹＭ１は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７をコードする。

いくつかの実施形態では、ｐｏｘ酵素は、脂質、例えば、リン脂質によって活性化される（例えば、触媒的に活性化される）。特定の実施形態では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株ＳＴＹＭＩからの過酸化水素生成Ｐｏｘは、リン脂質（例えば、ホスホチジルエタノールアミン）によって活性化される。

本明細書に記載されているのは、主にピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘ）酵素を介して阻害濃度の過酸化水素を生成することにより、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害することなどによって歯周病を治療するＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの特定の菌株である。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの特定の菌株は、ヨーグルト（例えば、Ｓｔｏｎｙｆｉｅｌｄギリシャヨーグルト）から単離され、この菌株は元の単離状態から改変していない。しかし、この菌株から精製された組換えピルビン酸オキシダーゼは、それ自体でＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害することができる。いくつかの実施形態では、特定の細菌株は、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７である。

口腔は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの自然なニッチではない。したがって、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ酵素を発現するために、歯の表面及び口腔に良好なコロニー形成を行う菌株を設計することが望ましい場合がある。したがって、本明細書には、Ｐｏｘ酵素を発現するように操作された細菌株（例えば、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ）も開示されている。酵素を天然に産生しない細菌株は、酵素を産生するように遺伝子操作され得るか、または酵素を天然／内因的に発現する細菌株は、対応する天然株と比較して、任意により、他の酵素と共に、増加した量の酵素を産生するように遺伝子操作され得、それにより、口腔にコロニーを形成するように、菌株の能力を高める。例えば、単離された細胞（例えば、細菌細胞）は、酵素またはその機能的部分をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドでトランスフェクトされ得る。好ましくは、細胞は、酵素を自然に産生しない細胞であろう。しかし、特定の実施形態では、細胞は酵素を自然に発現し、遺伝子改変により、酵素の過剰産生がもたらされる。単離された細胞のゲノムへのそのような核酸の組み込み及び発現後に、そのような細胞は、Ｐｏｘ酵素（例えば、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ酵素）を産生するかまたは発現するであろう。

歯の表面及び／または口腔にコロニーを形成するのに好適である任意の細菌株を使用することができる。例えば、口腔の正常なコロニー形成菌であるｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉを操作することが可能である。これらには、これらに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓが挙げられる。

いくつかの態様では、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ遺伝子は、ｐＤＬ２７６などのｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌシャトルプラスミドを使用することによって細菌株（例えば、上記のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）に導入させるか、または相同組換えもしくは別の遺伝子改変手段を介してゲノムに挿入させる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌシャトルプラスミドで使用するために、ＬＤＢＮＤ＿１４８７遺伝子をｐＤＬ２７６または別のシャトルベクターにライゲーションすることができる。いくつかの態様では、ベクター上のＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘの発現は、天然のＬＤＢＮＤ＿１４８７プロモーター配列、構成的に活性なｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロモーター配列（Ｐ_ａｍｉ、Ｐ_ｓｐａｃ、Ｐ_２３、Ｐ_ｖｅｇなど）、または確実にＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘが口腔内の最適な時間及び空間で発現するいくつかの環境シグナルに応答する誘導性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロモーター配列のいずれかによって制御され得る。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種のゲノムに挿入するために、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ遺伝子を増幅し、その後、オーバーラップ伸長ＰＣＲを介してＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ遺伝子の両側のゲノムから約５００～１０００ｂｐのＤＮＡ片に融合させ得る。この断片には、シャトルベクターアプローチで使用するための上記のプロモーターエレメントのうちの１つを含む。断片の挿入は、周囲の遺伝子の発現に影響を与えない遺伝子間空間に向けられる。

口腔内のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａがＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種と密接に関連しているというエビデンスもある。したがって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍについては、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘを発現し、過酸化水素を生成することが有利であり、これによりＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓに近接して生成される。使用され得る口腔内の主要な種は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｕｒｕｍである。いくつかの態様では、ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘ遺伝子は、ｐＣＧＬ０２４３のようなＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍシャトルベクターを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に導入されるか、または相同組換えもしくは遺伝子改変の別の手段を介してゲノムに挿入される。いくつかの態様では、発現は、天然のＬＤＢＮＤ＿１４８７プロモーター配列、構成的に活性なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター配列（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのＣＰ＿２４５４プロモーターなど）、またはＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘが、口腔内の最適な時間及び空間で確実に発現するいくつかの環境シグナルに応答する誘導性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーター配列のいずれかによって制御される。

ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのゲノムへのＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子の挿入は、ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子を自殺ベクターｐＪＳＣ２３２に組み込むことによって行うことができる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム内の任意の領域と相同性のある領域をベクターに含めて、遺伝子間領域でのゲノムへの組み込みが可能になり得る。この系におけるＬＤＢＮＤ＿１４８７の発現は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍについて上記のプロモーターエレメントのうちの１つによって制御され得る。

歯周炎は、依然として、口腔微生物叢の腸内毒素症のために歯肉組織が慢性的に炎症を起こす一般的な疾患である。この炎症は、組織の破壊、骨の喪失、及び最終的には歯の喪失を引き起こし得る。歯周炎は、様々な全身性疾患にも関連する。近年、歯周炎の発症において重要な病原体であるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓがアルツハイマー病の発症に関連しており、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害することへの関心が高まっている。

知る限り、これはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害することが知られているＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの最初の菌株である。知る限り、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのピルビン酸オキシダーゼは精製されておらず、阻害濃度の過酸化水素を生成することは示されていない。細菌株または組換えタンパク質の使用は、予防的に使用でき、広域抗生物質ではないため、現在の治療法よりも優れている。

ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｏｘ）は、ＡＴＰ生成を増加させ、過酸化水素生成を介して適応度の利点をもたらすための細菌代謝における重要な酵素である。また、ピルビン酸及びリン酸測定用のバイオセンサーの開発での用途も有する。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株ＳＴＹＭ１からの過酸化水素生成Ｐｏｘの特徴が明らかにされ、ホスホチジルエタノールアミン（１６：０～１８：１）によって特異的に活性化されることが示された。この活性化は、ｋ_ｍ及び酵素の代謝回転の両方が変化するため、Ｋ型及びＶ型の両方の活性化が混合したものである。さらに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、溶液中で十量体または五量体の二量体のいずれかを形成することが実証され、これは、他の特徴的なＰｏｘ酵素とは異なる。最後に、ホスホチジルエタノールアミンによって弱く活性化されたのみのＣ末端短縮変異体が生成され、これは、Ｃ末端が脂質活性化に重要であることを示唆するものである。これは、リン脂質によって活性化される知られる限り最初の過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素であると考えられる。結果は、異なる細菌種からのＰｏｘ酵素間に実質的な差があることを示唆しており、これは、生物学的系及びＰｏｘベースのバイオセンサーの開発におけるそれらの役割にとって重要であり得る。

実施例１：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの種間阻害には、活性ピルビン酸オキシダーゼを必要とする。
歯を支える組織の炎症性疾患である歯周炎は、腸内毒素症または有益な口腔細菌と病原性の口腔細菌との間の不均衡によって引き起こされる（１）。これが炎症の一因となり、治療しないままであれば、最終的には歯槽骨及び歯の喪失を引き起こす。歯周炎に関連する主要な細菌の１つは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｇ）であり、これは、歯周病の主要な病原体であると考えられている（１）。歯周炎の現在の治療としては、スケーリング及びルートプランニングなどの集中的で高価な治療法、ならびに抗生物質治療が挙げられるが、これらは、予防的治療法ではない。

プロバイオティクスは、投与された場合に、個人の健康に有益な効果をもたらす微生物である（２）。ほとんどのプロバイオティクス研究及び現在の用途では、腸にコロニーを形成し、この場所からその効果を発揮する細菌に焦点を当てている。最もよく研究されているプロバイオティクスのいくつかとしては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げられ、これらは、腸にコロニーを形成し、セリアック病、肥満、過敏性腸症候群、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ感染、及び乳児敗血症に有益な効果を有する（３－１０）。ヨーグルト及び他の発酵食品中で一般的に見られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、免疫力のある個体への投与に安全であると広く見なされている（１１）。プロバイオティクスのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種の使用は、口腔内で調査が開始されたところである（１２－１５）。最近のいくつかの研究では、う蝕の治療におけるプロバイオティクスの有効性が調べられている。これらの研究の多くは、様々な期間にわたって、様々な媒体（すなわち、ミルク、チーズ、ヨーグルト、錠剤など）による様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の投与を用いていた。これらの研究は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ（う蝕に関与する主要な細菌）の保菌の有意な減少、う蝕リスクの減少、及びプロバイオティクスによる治療後の歯周病の症状の減少を示し、それによって口腔内でのプロバイオティクス使用の実現可能性を強調している（１３，１６）。さらに、韓国コホートでの最近の研究では、ヨーグルトの摂取量が増加したが、ミルクまたはカルシウムは増加しなかった個体では、歯周炎の発生率が低下したことが明らかになり、これにより、ヨーグルト中に存在する細菌が重要であり得ることが示唆された（１７）。

この研究では、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの菌株を単離した。その後、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのこの菌株がその効果を発揮するメカニズムは、ピルビン酸オキシダーゼの酵素活性によるものであることが決定された。

結果
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの阻害は、菌株特異的である。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（Ｌｄ）の２つの菌株は、市販の乳製品から単離し、２つの菌株は生乳から単離した（単離の基礎を参照のこと）。市販の単離株は、ＳＴＹＭ１及びＧＶＫＭ１であり、生乳単離株は、ＳＹＢ７及びＳＹＢ１３と名付けた。それらの同定は、１６ＳｒＲＮＡシーケンシングによって確認した（データは示さず）。これらの菌株のそれぞれ、及びＡＴＣＣ１１８４２型の菌株について、寒天オーバーレイアッセイ及びスポットアッセイでＰｇの成長を阻害する能力について調査した。ＳＴＹＭ１及びＧＶＫＭ１の両方が、両方のアッセイにおいてＰｇの成長を阻害するが、ＳＹＢ７及びＳＹＢ１３の単離株ならびに１１８４２株は、Ｐｇの成長にほとんど影響を有さない（図１）。

ＳＴＹＭ１株の特性評価では、Ｐｇの阻害が最も多いことを示したため、注目された。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉは抗菌分子を分泌することが知られているため、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスで成長させたＳＴＹＭ１の上清を、Ｐｇに対する阻害活性を有するか否かの試験を行った。無細胞上清を一晩または４８時間いずれかのＳＴＹＭ１培養物から回収し、エンドポイントのＰｇ成長をモニターするブロスベースのアッセイで活性の試験を行った。４８時間の上清は、一晩培養物よりもはるかに大きい程度でＰｇの成長を阻害した（図９Ａ）。しかし、ＢＨＩブロス培養物中のＳＴＹＭ１の成長動態を調査した場合、２４～４８時間のインキュベーション期間中にＳＴＹＭ１培養物の有意な自己溶解が観察された（図９Ｂ）。以前の研究では、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、特に炭素飢餓に応答して、定常期後期に自己溶解を受け得ることが示されている（２１，２２）。ＢＨＩ培地は、０．２％（ｗ／ｖ）のグルコースのみを含むため、これらの条件下でグルコース制限により自己溶解が誘発されるか否かの試験を行った。実際、ＢＨＩにおけるＳＴＹＭ１の自己溶解は、炭素制限によるものであることが見出された（図９Ｂ）。４８時間の培養上清のみが阻害活性を有していたことを考慮すると、阻害分子は自己溶解を介して上清に放出された細胞内成分であり得ると推論された。

ＳＴＹＭ１の細胞抽出物は、阻害タンパク質を含む。
阻害分子が細胞内に位置することを確認するために、寒天オーバーレイアッセイにおいて、阻害活性について可溶性細胞抽出物の試験を行った。ＳＴＹＭ１細胞抽出物のみが阻害活性を有し、非阻害株からの抽出物は、Ｐｇ成長にいかなる影響も有さなかった（図２Ａ）。ＳＴＹＭ１抽出物中の阻害活性の性質を決定するために、抽出物を熱、プロテイナーゼＫ、または１０ｋＤａ分子量カットオフフィルタを通過させることのいずれかによって処理した。熱及びプロテイナーゼＫによる処理は、ＳＴＹＭ１抽出物中の阻害活性を完全に無効にし、１０ｋＤａＭＷＣＯフィルタは、阻害活性の大部分を保持した。これは、１つまたは複数のタンパク質が、Ｐｇの阻害に関与していることを示唆している（図２Ｂ～２Ｄ）。

ＳＴＹＭ１抽出物の分画
ＳＴＹＭ１抽出物中の阻害タンパク質を特定するために、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過を使用して抽出物を分画した。阻害活性を有する画分をプールし、次の分画ステップのインプットとして使用した。ゲルろ過後、阻害活性は画分９でピークに達した（図３Ａ～３Ｂ）。この画分中のタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のクーマシー染色によって可視化し、約７０ｋＤａに１つの優勢バンドを有する３つのバンドのみが明らかになった（図３Ｃ）。画分９の７０ｋＤａの優勢バンドをゲルから切り出し、質量分析によって分析した。このサンプル中で最も豊富なタンパク質の上位５つは、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸－タンパク質ホスホトランスフェラーゼ、及び分子シャペロンＤｎａＫであった。興味深いことに、５つの酵素のうち３つはピルビン酸代謝に関与しており、これらが複合体を形成していることを示し得る。

阻害剤株対非阻害剤株のゲノム分析
ゲノミクスアプローチを採用して、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの阻害剤株と非阻害剤株との差を特定し、質量分析により、任意のタンパク質が阻害剤株に固有であるかを特定した。２つの阻害剤株（ＳＴＹＭ１及びＧＶＫＭ１）及び２つの非阻害剤株（ＳＹＢ７及びＡＴＣＣ１１８４２）の全ゲノム配列決定により、多くの差及びゲノム再配列が明らかになった。２つの阻害剤株は、非常に類似しており、変異株は１３のみであった。しかし、ＳＴＹＭ１ゲノムは、１１８４２ゲノム及びＳＹＢ７ゲノムよりも約４００ｋｂ大きく、当然のことながら、代謝機能であるかまたは仮定のトランスポザーゼである多くの固有の４２６の追加遺伝子を有する。

ゲノム分析を使用して、質量分析によって同定されたタンパク質のいずれかが、非阻害剤株と比較して阻害剤株に固有であるか否かを決定した。この分析により、質量分析によって同定された３つのオキシダーゼ遺伝子である、ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｏｘ）遺伝子、乳酸オキシダーゼ（Ｌｏｘ）遺伝子、及びマルチ銅オキシダーゼ（Ｍｃｏ）遺伝子が、非阻害株において短縮され、非機能性ペプチドを産生する可能性が高いことが明らかになった（図１０）。ｐｏｘ遺伝子座では、ゲノム配列は、阻害剤株と非阻害剤株とで類似しているが、非阻害剤株中のｐｏｘ遺伝子内に２８３ｂｐの欠失があり、その結果、未成熟な終止コドンが導入されることになる。ｌｏｘ領域では、ｌｏｘの５’領域及び上流の乳酸パーミアーゼ遺伝子全体が非阻害剤株内で欠失している。マルチ銅オキシダーゼ領域では、１つの阻害剤株は、無傷のｍｃｏ遺伝子を有するが、１１８４２株は７ｂｐの挿入を有するため、未成熟な終止コドンが導入されることになる（図１０）。Ｐｏｘ、Ｌｏｘ、及び一部のマルチ銅オキシダーゼは、過酸化水素を生成するため、ＳＴＹＭ１細胞抽出物にカタラーゼを添加することにより、阻害活性を消失させ得るかについて試験を行った。実際、ＳＴＹＭ１抽出物のカタラーゼ処理は、阻害活性を完全に無効にし、おそらく質量分析によって同定された１つ以上のオキシダーゼによる過酸化水素生成が、作用メカニズムであることを示している（図２Ｅ）。

ＳＴＹＭ１抽出物への曝露によるＰｇトランスポゾンライブラリーのスクリーニング
次に、過酸化水素がＳＴＹＭ１阻害活性の主成分であるか、及びＰｇ耐性変異体を単離できるかを判定した。これを行うために、ＰｇのＷ８３株中で構築されたトランスポゾンライブラリーを使用した。ＰｇトランスポゾンライブラリーをＳＴＹＭ１抽出物に曝露し、生存したものをプレーティングした。３６の生存したコロニーが選択され、それらのトランスポゾン：ゲノム接合部の配列決定を行い、トランスポゾン挿入の位置を決定した。注目すべきことに、３６クローンのうち３４クローンはＷ８３のｆｅｏＢ２遺伝子（ＰＧ１２９４）にトランスポゾン挿入を有すると同時に、他の２クローンは、予測されるｆｅｏＣホモログであるＦｅｏＢ関連システインリッチ膜タンパク質にトランスポゾン挿入を有していた（図４Ａ）。ＦｅｏＢ２は、以前はＰｇ中の鉄輸送体として特徴付けられていた（２３，２４）。ｆｅｏＢ２の欠失変異体は、細胞内鉄レベルを低下させ、マウス膿瘍モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで成長させることができず、過酸化水素及び大気中の酸素に対する耐性を高めている（２３，２５）。単離で試験した場合、ｆｅｏＢ２トランスポゾン変異体は、ＳＴＹＭ１抽出物による死滅に対して有意に高い耐性を示し、天然のｆｅｏＢ２遺伝子との相補性により感度が回復する（図４Ｂ）。これらのデータから、耐性は、ｆｅｏＢ２遺伝子の破壊によるものであり、ゲノム中の他の場所での二次部位変異の存在または下流の極性効果によるものではないことが確認される。

過酸化水素が抗菌効果を発揮する主なメカニズムのうちの１つは、細胞内鉄とのフェントン反応を介した活性酸素種の形成によるものである（２６）。ＳＴＹＭ１抽出物による死滅に耐性のあるｆｅｏＢ２中のトランスポゾン変異体のみが回収されたため、過酸化水素の生成がＳＴＹＭ１抽出物中の阻害タンパク質の主要な機能であるものと判断した。

ＳＴＹＭ１抽出物にＰｏｘ基質及び補因子を補充することにより、Ｈ２Ｏ２の生成が促進される。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種では、Ｐｏｘはピルビン酸、リン酸、及び酸素のアセチルリン酸、二酸化炭素、及び過酸化水素への変換を触媒する。Ｐｏｘは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、及びＭｎ^＋２を使用して、この反応を実行する（２７，２８）。Ｐｏｘは、ゲルろ過後の阻害画分中で最も富化されたタンパク質のうちの１つであるため、Ｐｏｘの基質を添加するのみで、ＳＴＹＭ１抽出物中の過酸化水素生成を増加させ得るかを判断した。プルシアンブルー寒天は、細菌抽出物中のオキシダーゼ活性を検出するために開発された（２０）。この系は、ＳＴＹＭ１抽出物中において過酸化水素の生成を検出できるように、トリプティックソイ寒天プレートで使用するように適合させた。過酸化水素で満たされた寒天プレートのウェルの周りにプルシアンブルーのハロが形成される。反応は特異的であり、ハロの直径は過酸化水素の濃度に依存する（図５Ａ）。

ＳＴＹＭ１抽出物のみでは、プルシアンブループレート上に５００μＭ～１ｍＭの範囲で中程度の量の過酸化水素が生成されるが、１１８４２株抽出物が検出可能な過酸化水素を生成することはない（図５Ｂ）。しかし、５０ｍＭのピルビン酸塩及びリン酸塩を補充した場合、プルシアンブルーのハロ直径で測定したときに、過酸化水素の生成が有意に増加した。過酸化水素の生成は、Ｐｏｘ酵素の補因子である１０ｍＭＭｎ^＋２、１５μＭＦＡＤ、及び３００μＭＴＰＰの添加によってさらに促進された。ＳＴＹＭ１ライセートにＬｏｘ基質及び補因子１５０ｍＭＤＬ－乳酸塩、３００μＭＴＰＰ、及び１５μＭＦＡＤを補充することにより、過酸化水素の生成が適度に促進されたが、Ｐｏｘ基質及び補因子を補充した場合に観察されるレベルまでには達しなかった（図５Ｂ及び図２１）。これらのデータは、ＰｏｘがＳＴＹＭ１抽出物中の過酸化水素の主な産生因子である可能性が高いことを示唆している。

マルチ銅オキシダーゼの基質は不明である。マルチ銅オキシダーゼは、とりわけチロシナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、及びラッカーゼからなるタンパク質の大きいファミリーである（２９）。これらの酵素のほとんどは、過酸化水素を生成することはない。しかし、ラッカーゼはいくつかの真菌で特徴付けられており、いくつかは細菌種中で同定されており、細菌ラッカーゼは、場合によっては過酸化水素を生成することができる（３０～３２）。一般的に、ラッカーゼの基質は、ポリフェノール及び芳香族アミンである。ラッカーゼ活性がＳＴＹＭ１抽出物中に存在するかについて試験するために、一般的なラッカーゼ基質であるシリンガラジンを酸化する抽出物の能力を調査した（３３）。ＳＴＹＭ１抽出物は、シリンガラジン基質を酸化することができず、マルチ銅オキシダーゼがラッカーゼではないか、少なくともシリンガラジンを基質として使用できないことを示唆している（図１１）。

ＳＴＹＭ１抽出物のオキシダーゼ阻害剤による処理
ＳＴＹＭ１抽出物中の過酸化水素生成におけるＰｏｘの関与をさらに確認するために、Ｐｏｘ、Ｌｏｘ、及びマルチ銅オキシダーゼについて記載されているいくつかの阻害剤を使用した。亜硫酸ナトリウムが、分子への共有結合付加物を形成することによってフラビン部分を不活性化するため、亜硫酸ナトリウムは、フラビン依存性オキシダーゼの阻害剤である（３４，３５）。Ｐｏｘ及びＬｏｘは双方ともフラビン依存性オキシダーゼであるため、両方とも亜硫酸ナトリウムによって阻害される必要がある。Ｐｏｘは、金属イオンを配位するため、ＥＤＴＡで処理することによって阻害され得る。シュウ酸塩は、おそらく活性部位をブロックすることにより、Ｌｏｘの特異的阻害剤として作用する（３６）。最後に、いくつかのマルチ銅オキシダーゼは、タンパク質中の銅配位を破壊するアジ化ナトリウムで処理することによって阻害されることが知られている（３７）。

これらの阻害剤のそれぞれを、ＳＴＹＭ１抽出物中に見られる阻害活性を無効にする能力について試験した。アジ化ナトリウム処理は、広範囲の濃度で試験した場合でも阻害活性に対して影響を有さず、マルチ銅オキシダーゼが阻害タンパク質ではないことを示唆している（図６Ａ）。シュウ酸ナトリウム処理も、ＳＴＹＭ１抽出物に対する影響を有さず、これは、乳酸オキシダーゼが主要な過酸化水素生成タンパク質ではない可能性があることを示している（図６Ｂ）。しかし、亜硫酸ナトリウムによる処理は、ＳＴＹＭ１抽出物の阻害活性を完全に無効にし、このことは、Ｐｏｘ及び／またはＬｏｘが過酸化水素生成に関与していることを示唆している（図６Ｃ）。さらに、ＥＤＴＡ処理は、ＳＴＹＭ１抽出物がＰｇを阻害する能力を完全に遮断し、ＥＤＴＡ濃度を超えるＭｎ^＋２を補充することにより、抽出物中の阻害活性が回復した（図６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰｏｘがＳＴＹＭ１抽出物中の主要な過酸化水素生成酵素であることを示唆している。

ＬＤＢＮＤ＿１４８７Ｐｏｘは、ＬＤＢＮＤ＿２０５１Ｐｏｘよりも高度に発現している。
ＳＴＹＭ１は、２つの予測されるｐｏｘ遺伝子（ＬＤＢＮＤ＿１４８７及びＬＤＢＮＤ＿２０５１）をコードするが、１つ（ＬＤＢＮＤ＿１４８７）のみがＳＴＹＭ１株に固有である。アミノ酸配列アラインメントでは、２つの遺伝子間のタンパク質配列が非常に類似しており、４つのアミノ酸置換及び６つのアミノ酸の１つの挿入のみであることが明らかになった（図７Ａ）。プロモーター分析では、ＬＤＢＮＤ＿１４８７の上流の標準的な－３５及び－１０配列の存在が明らかになったが、ＬＤＢＮＤ＿２０５１の上流の標準的な配列とのいくつかのミスマッチを特定した（図７Ｂ）。したがって、２つの遺伝子の発現が異なるか否かを判定することを決定した。実際に、ＬＤＢＮＤ＿１４８７は、試験条件下でＬＤＢＮＤ＿２０５１よりも有意に高いレベルで発現したことが見出された（図７Ｃ）。発現は、転写レベルではおよそ４倍高いが、タンパク質レベルではいかなる差も見ることができなかった。

精製されたＰｏｘは触媒的に活性であり、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰｇの成長を阻害するのに十分である。
まとめると、上記のデータは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７ＰｏｘがＳＴＹＭ１抽出物中の過酸化水素の唯一ではないが主要な産生因子であることを強く示唆している。したがって、ｈｉｓタグ付けした種類のＰｏｘが生成され、酵素がＮｉ－ＮＴＡカラムで精製された（図８Ａ）。溶出されたＰｏｘ画分は、フラビン含有酵素の特徴である黄色がかった色合いを有していた。酸化的カップリング反応を使用して、ピルビン酸オキシダーゼ活性をアッセイした。反応は、ピルビン酸塩、リン酸塩、精製されたｐｏｘ酵素、ＦＡＤ、ＴＰＰ、４－アミノアンチピリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン、及び西洋ワサビペルオキシダーゼからなり、５５０ｎｍでの吸光度の増加によって測定可能なＰｏｘを介した過酸化水素生成時に、キノンイミン染料が形成される。Ｐｏｘ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＨ_２Ｏ_２の生成によって定義される。標準曲線から外挿すると、精製されたＰｏｘサンプル中に約２．４Ｕ／ｍＬのＰｏｘ活性が存在することを決定した（図８Ｂ～８Ｃ）。

寒天オーバーレイアッセイにおいて、Ｐｇ成長を阻害する精製組換えＰｏｘの能力を試験した。Ｐｏｘのみ、または基質もしくは基質とＦＡＤ及びＴＰＰのいずれかを補充したＰｏｘのアリコートを寒天プレートにスポットし、Ｐｇを接種したソフト寒天を重層した。精製されたＰｏｘのみでは、重層でのＰｇの成長を阻害することはできなかった。しかし、ピルビン酸塩及びリン酸塩のみを補充したＰｏｘは、寒天重層内に明確な阻害ゾーンを生成し、これは、Ｐｏｘが天然のＦＡＤ及びＴＰＰを強固に結合して精製されたことを示している。さらに、基質及びＦＡＤ及びＴＰＰを補充したＰｏｘは、さらに大きい阻害ゾーンを生成した。基質及び補因子のみは、Ｐｇの成長に対する影響を有さず、これは、阻害することがＰｏｘの触媒作用に特異的であることを示している（図８Ｄ）。まとめて、これらのデータは、ＰｏｘがｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰｇの成長を阻害するのに十分であることを示している。

考察
この報告では、口腔病原体Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのプロバイオティクス株の拮抗作用のメカニズムについて記載した。Ｌｄの阻害能力は菌株特異的であり、プロバイオティクス治療薬の開発における種の選択のみでなく、菌株の選択の重要性も強調している。ＬｄのＳＴＹＭ１株は、自己溶解を介して細胞内タンパク質を放出し、阻害量の過酸化水素を生成できることが実証された。オキシダーゼ阻害剤、酵素基質／補因子の補充、及び組換えタンパク質の精製を使用した研究によって、過酸化水素の唯一ではないが主要な産生因子が、ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｏｘ、ＬＤＢＮＤ＿１４８７）であるという強力なエビデンスが提示された。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、バクテリオシンと総称される多種多様な抗菌タンパク質を産生することがよく知られている。これらのタンパク質は、小さいペプチドから３０ｋＤａを超える大きいタンパク質までの範囲であり、多様な作用メカニズムを有する（３８）。食品業界では、これらのバクテリオシンを新しい抗生物質及び防腐剤に発展させることに大きな関心が寄せられている（３９）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種が他の細菌の成長に拮抗できる別の１つのメカニズムは、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）の生成によるものである。過酸化水素を介した死滅は、細胞内鉄とのフェントン化学を介したスーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルの生成を通じて発生し、これにより最終的にＤＮＡに損傷を与え、細胞死を引き起こす。これと一致して、ＳＴＹＭ１及び組換えＰｏｘによる死滅に対してより耐性のある鉄輸送体ｆｅｏＢ２のトランスポゾン変異体を回収した。過酸化水素はまた、タンパク質中のスルフヒドリル基を酸化し、不飽和細胞膜脂質の過酸化を促進し得る（２６）。

過酸化水素は、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、及びＮＡＤＨフラビン依存性レダクターゼなど、いくつかの異なる酵素によってｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種中で生成され得る（２７，４０，４１）。いくつかのｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｅｒｅｕｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などの病原体の成長を阻害するのに十分な過酸化水素を生成する（４２～４４）。

ＳＴＹＭ１株は、２つのピルビン酸オキシダーゼ遺伝子：ＬＤＢＮＤ＿１４８７及びＬＤＢＮＤ＿２０５１をコードしている。非阻害株と比較したＳＴＹＭ１のゲノム分析により、ＬＤＢＮＤ＿１４８７は非阻害株中では短縮されているが、ＬＤＢＮＤ＿２０５１は無傷であることが明らかになった。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種がそれらのゲノム中に複数のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子をコードすることは珍しいことではない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍは５つのピルビン酸オキシダーゼ遺伝子をコードしており、他のｐｏｘ遺伝子が、触媒作用ならびに基質及び補因子の結合に重要なアミノ酸残基を保持しているにもかかわらず、２つのみが、過酸化水素の生成及びＰｏｘ活性に関与している（４５）。この観察は、異なるｐｏｘ遺伝子の発現レベルによるものであり得る。ＳＴＹＭ１株では、ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘはＬＤＢＮＤ＿２０５１ｐｏｘよりも高度に発現しており、これは、ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘがいかに本発明者らのサンプル中のＰｏｘ活性の主成分であるかについて説明している可能性がある。ＳＴＹＭ１株におけるＬＤＢＮＤ＿１４８７及びＬＤＢＮＤ＿２０５１の発現データは、２つの遺伝子のプロモーター分析によっても確認されている。ＬＤＢＮＤ＿１４８７は、Ｅ．Ｃｏｌｉ及びｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種中のコンセンサス配列と同一である－３５部位及び－１０部位を有する（４６～４８）。あるいは、ＬＤＢＮＤ＿２０５１ｐｏｘプロモーターは、シグマ因子によるプロモーター結合に重要であることが示されている塩基の－３５部位及び－１０部位にいくつかのミスマッチを有する。

興味深いことに、ＳＴＹＭ１株中のＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘの調節は、他のいくつかの生物とは異なると考えられる。他の生物では、ｐｏｘは定常期及びグルコース制限下で高度に発現するが、嫌気性条件では抑制される（２７）。ｐｏｘのこの調節パターンは、ＢＨＩで成長した定常期ＳＴＹＭ１Ｌｄからの抽出物中で、質量分析によってＰｏｘが検出されたという結果と一致しており、これは、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の低グルコース条件（０．２％）と見なされる。しかし、これらの細胞は嫌気性条件下で成長し、これは、ｐｏｘが抑制されることが予想される条件である。成長期及びグルコース制限によるｐｏｘの正の調節が、嫌気性条件下での抑制を無効にする可能性がある。

Ｌ．ｐｌａｎａｔｒｕｍ中で高度に発現している２つのｐｏｘ遺伝子のうち、一方は定常期に強く抑制され、他方の発現は維持されていることも示されている（４５）。さらに、嫌気性条件下でのＰｏｘの抑制は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現レベルの約５０％の減少をもたらすが、それでも検出可能なレベルでは、嫌気性条件下でのＰｏｘの抑制はあるものの、依然としてある程度のＰｏｘが生成されている可能性が高い（４９）。ＬＤＢＮＤ＿１４８７は、ｑＲＴ－ＰＣＲ及び質量分析データをベースとしたアッセイの条件下で発現し、翻訳されることが確認されており、これは嫌気性条件下でのｐｏｘの新規調節パターンであり得る。２つのｐｏｘ遺伝子が存在するが、１つが主に活性であることに関する別の説明は、１つのＰｏｘ酵素が異なる基質特異性を有し得るというものである。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰｏｘは、この可能性を裏付ける代替基質であるメチルグリオキサール及びアセトアルデヒドを使用できることが実証されている（２８）。

Ｐｏｘ酵素は、他の生物中で特徴が明らかになっている。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍでは、Ｐｏｘは定常期中の酢酸生成に関与し、ここでは、ピルビン酸をアセチルリン酸に変換し、アセチルリン酸は、ＡＴＰの生成と共に酢酸キナーゼによって酢酸に変換される（２７，４５）。このＡＴＰの生成は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの好気性成長中にバイオマスが増加する主な理由であると考えられている（２７）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、Ｐｏｘが過酸化水素生成の大部分を占め、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと同様に、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、及び酢酸キナーゼと協調して酢酸及びＡＴＰの生成に関与する（５０）。一部のＬｄ株では、過酸化水素がＮＡＤＨオキシダーゼによって生成され得ることが公知であるが、ＳＴＹＭ１は予測されるＮＡＤＨオキシダーゼをコードしない（４０）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉでは、ＮＡＤＨフラビンレダクターゼが、過酸化水素の主要な産生因子であることがわかった（４１）。興味深いことに、ＳＴＹＭ１は、ＮＡＤＨフラビンレダクターゼのホモログ（ＬＤＢＮＤ＿１９０５及び１９０６）をコードしているが、これらの遺伝子は、非阻害株中にも存在する。まとめると、これらの観察は、異なる種が過酸化水素の主な産生因子である異なる酵素を有し得ることを示唆している。

乳酸菌における過酸化水素生成酵素の役割については、カタラーゼをコードしておらず、ＳＴＹＭ１株などの多くがＮＡＤＨペルオキシダーゼまたはアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼをコードしていないことを考えると、興味深い疑問が残る。Ｌｄなどいくつかの種は、曝気時に自己阻害レベルの過酸化水素を生成し、これはおそらく適応度の不利になるであろう。しかし、過酸化水素を生成するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉは、健康な腸及び膣の微生物群集ならびに免疫機能の維持に関連付けられている。過酸化水素を生成するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉのレベルが高い女性は、細菌性膣炎を発症するリスクが低いという強力なエビデンスがある（５１，５２）。過酸化水素生成酵素を保持することは、これらの細菌が特定のニッチを維持し、群集内の他の生物または侵入する病原体を打ち負かす補助となり得る。ある研究では、抗炎症応答及び免疫恒常性に関与するＰＰＡＲ－γが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓによって生成された過酸化水素によって活性化されることがわかった（５３）。過酸化水素産生細菌のこの態様は、病態生理学の多くが過剰な免疫応答によって駆動されるため、歯周炎の状況において特に魅力的である。

これらの特徴、及びＬｄが一般に安全と見なされている（ＧＲＡＳ）指定を有するため、ＬｄのＳＴＹＭ１株は、歯周炎の治療及び／または予防におけるプロバイオティクス株として使用するための強力な候補となる。しかし、口腔内のＬｄの接着及びコロニー形成の特性は、問題になり得る。永久的なコロニー形成因子である他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種があるが、口腔はＬｄの自然なニッチではない。Ｌｄ株は口腔の一時的なコロニー形成因子である可能性があるが、Ｌｄを含むヨーグルトを毎日摂取することにより、安定したコロニー形成が可能になり得る。この問題を克服するために、歯の表面にコロニーを形成して付着することが十分にできるＬｄ株を設計するか、またはＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子を異種株もしくは種に導入することが有用である場合がある。さらに、ＳＴＹＭ１抽出物に対するＰｇ耐性変異体は、Ｐｇ株Ｗ５０中でｉｎｖｉｖｏにおいて必須遺伝子であることが示されているｆｅｏＢ２鉄輸送体が不足していることも示された（２３）。これにより、ｉｎｖｉｖｏでのＳＴＹＭ１を介した死滅に対する耐性の発達が、プロバイオティクスでの使用に関して、ＳＴＹＭ１の魅力を促進する可能性はほとんどない。

口腔内での過酸化水素の生成は、主に常在性連鎖球菌種によって発生することがよく知られている。この過酸化水素の生成は、口腔微生物群集を形作るのに重要な役割を果たすと考えられており、実際に、過酸化水素の生成と口腔微生物叢におけるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の存在との間には強い相関関係がある（５４，５５）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓは、口腔内の過酸化水素の主要な産生菌の１つであると考えられている（５６）。その過酸化水素の生成は、ほぼ独占的にピルビン酸オキシダーゼの活性によるものであり、ゲノム内に存在する乳酸オキシダーゼのような他のオキシダーゼによるものではないことが示されている（５７）。興味深いことに、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのｓａｎｇｕｉｓ群の存在量は、口腔微生物群集中に存在する歯周病原菌の数と負の相関があり、これは、ピルビン酸オキシダーゼ由来の過酸化水素が、群集構成要素、特に嫌気性歯周病原菌に実質的な影響を有し得ることを示している（５８）。

プロバイオティクス作用におけるオキシダーゼ、特にＰｏｘによる過酸化水素生成の有用性を超えて、Ｐｏｘ酵素は、工業的及び実用的な用途を有する。Ｐｏｘ酵素は現在、一部の臨床及び非臨床サンプル中のピルビン酸及びリン酸濃度を測定するために使用されており、Ｐｏｘ酵素を使用したバイオセンサーの開発に関心がある（５９～６１）。他のＰｏｘ酵素の有効性に対する１つの制限は、補因子ＴＰＰ及びＦＡＤを補充する必要があることであり、これによりコストが増加し、酵素の寿命が短くなる。組換えＳＴＹＭ１Ｐｏｘ酵素は、外因性補因子を添加せずに酵素が活性であったため、関連する補因子が強固に結合した状態で精製した。これは他のいくつかのＰｏｘ酵素とは対照的であり、実用的及び工業的用途にとって魅力的な酵素の品質を表している（６１）。

プロバイオティクス機能のメカニズムの多くは、依然として十分に理解されておらず、このことが、細菌のプロバイオティクス株の合理的な設計を妨げている。この報告では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの潜在的なプロバイオティクス株であるＳＴＹＭ１が歯周病原菌Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを阻害する分子メカニズムが示されている。主要な過酸化水素生成酵素であるピルビン酸オキシダーゼが精製され、他のＰｏｘ酵素と比較して固有の特徴を有することが示された。ＳＴＹＭ１株は、歯周病の治療及び／または予防に有用なプロバイオティクス株に発展し、他のプロバイオティクス株の設計に情報を提供することができる。

材料及び方法
細菌株、培地、及び成長条件
本研究で使用した細菌株、プラスミド、及びプライマーは、図２０及び図２１に列挙する。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＷ８３株は、ヒツジ脱線維血液（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）、酵母エキス（２ｍｇ／ｍＬ）、ヘミン（５μｇ／ｍＬ）、及びメナジオン（０．５μｇ／ｍＬ）を補充したトリプティックソイ寒天を含む血液寒天プレートで成長させた。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのブロス培養液は、酵母エキス（１ｍｇ／ｍｌ）、ヘミン（５μｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５μｇ／ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（１μｇ／ｍｌ）、チオグリコール酸ナトリウム（０．２５μｇ／ｍｌ）、及びシステイン（０．５μｇ／ｍｌ）を補充したブレインハートインフュージョンブロスで成長させた。寒天オーバーレイアッセイでは、酵母エキス（２ｍｇ／ｍＬ）、ヘミン（５μｇ／ｍｌ）、及びメナジオン（０．５μｇ／ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（１μｇ／ｍｌ）、チオグリコール酸ナトリウム（０．２５μｇ／ｍｌ）、及びシステイン（０．５μｇ／ｍｌ）を補充したトリプティックソイ寒天プレートを使用した。ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、エリスロマイシン（５μｇ／ｍＬ）、及びテトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長及び変異体の選択に適切である場合に使用した。すべてのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌株は、ＧａｓＰａｋ（商標）ＥＺＡｎａｅｒｏｂｅＰｏｕｃｈＳｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、３７℃で、ブロス培養液では４８時間、プレートベースのアッセイでは４～６日間成長させた。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ菌株は、ＭＲＳ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ブロス、または寒天、または上記のＢＨＩブロスで成長させた。すべてのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉは、３７℃のＧａｓＰａｋ（商標）ＥＺＡｎａｅｒｏｂｅＰｏｕｃｈＳｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で成長させた。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α、Ｓ１７－１λｐｉｒ、及びＬＯＢＳＴＲ（ＬＯＢＳＴＲＢＩＯＢＡＳＩＣＩｎｃ；ＫａｔｙａＨｅｌｄｗｅｉｎから贈呈）を、それぞれクローニング、コンジュゲーション、及びタンパク質精製に使用した。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）は、ＬＢ寒天またはブロスで適切な場合に使用した。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの抽出物及び上清
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉコロニーをＢＨＩ（１０ｍＬ）に接種し、３７℃で一晩嫌気的に成長させた。上清については、一晩培養物を、室温で３，２００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。上清を吸引し、０．２２μｍフィルタを通過させて無細胞上清を得た。細胞抽出物については、４つの１０ｍＬ培養物を組み合わせて、室温で３，２００×ｇで１０分間遠心分離して回収した。細胞ペレットを１ｍＬの２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０で１回洗浄した後、９，３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、１ｘｃＯｍｐｌｅｔｅＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルミックス（Ｒｏｃｈｅ）を含む１ｍＬ２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０に再懸濁させた。細胞懸濁液を、氷上において１５ｘ１秒のバーストで３ラウンド超音波処理した。細胞破片を除去するために、懸濁液を１６，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を吸引し、０．２２μｍフィルタでろ過して、可溶性細胞抽出物を得、これを後続の寒天オーバーレイアッセイ及びプルシアンブルーアッセイで使用した。総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。

分画実験で使用するための大規模抽出では、ＢＨＩで成長させたＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの一晩培養物を６００ｍＬのＢＨＩへと１：５０に希釈し、３７℃一晩インキュベートした。バッファ量が４０ｍＬであることを除いて、上記と同じステップを実施した。

寒天オーバーレイアッセイ及びスポットアッセイ
生きたＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ培養物を含む寒天重層の場合、２～５μＬの培養物をＢＨＩ寒天ガラスプレートにスポットし、乾燥させた。プレートを嫌気的に４８時間インキュベートし、その時点でＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ細胞をクロロホルム蒸気に３時間曝露して死滅させ、３０分間脱気させた後、ＯＤ６００が約０．１になるまでＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＷ８３株を接種した４ｍＬのソフトＢＨＩ寒天（０．７％）を重層した。プレートを３７℃で２～３日間嫌気的にインキュベートし、阻害ゾーンを分析し、プレートを撮像した。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ抽出物を含む寒天重層の場合、１０～３０μＬの抽出物をＴＳＡ１２０またはＢＨＩプレートにスポットし、乾燥させた。これらのプレートは、上記のように重層し、インキュベートし、撮像した。

スポットアッセイでは、５μＬのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ培養物をＢＨＩプレートにスポットし、乾燥させ、３７℃で嫌気的に４８時間インキュベートした。次に、５μＬのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ培養物を、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ成長のスポットに直接隣接してスポットし、乾燥させ、３７℃で４８時間嫌気的にインキュベートした。阻害ゾーンについてプレートを分析し、撮像した。

成長曲線
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを１ｍＬのＢＨＩ（０．２％グルコースを含む）または２％グルコースを補充したＢＨＩに、ＯＤ６０００．０２で接種した。ＢｉｏｔｅｋＨＴ分光光度計を使用して成長をモニターした。ＯＤ６００は、４８時間にわたって１時間ごとに測定した。

ＳＴＹＭ１抽出物の生化学的特徴付け
寒天オーバーレイアッセイで試験を行う前に、ＳＴＹＭ１抽出物を熱で、プロテイナーゼＫで、または１０ｋＤａＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して処理した。さらに、ＳＴＹＭ１抽出物を９５℃で２０分間食用不活化した（eat-inactivated）。プロテイナーゼＫ処理では、２μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）（Ｑｉａｇｅｎ）を１８μＬの抽出物に添加し、同様に３７℃で１時間インキュベートした。抽出物の別のサンプルにもバッファを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。熱不活化プロテイナーゼＫの場合、ＳＴＹＭ１抽出物に添加する前に、プロテイナーゼＫを９５℃で２０分間加熱した。１０ｋＤａＭＷＣＯ処理の場合、製造業者の指示に従って、ＳＴＹＭ１抽出物を１０ｋＤａＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に流した。濃縮物及びフロースルーは、寒天オーバーレイアッセイで試験を行った。

ＳＴＹＭ１抽出物は、寒天オーバーレイアッセイで試験を行う前に、カタラーゼ及び既知のオキシダーゼ阻害剤でも処理した。カタラーゼ処理では、寒天オーバーレイアッセイの前に、１０μｇのウシ肝臓カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）をＳＴＹＭ１抽出物に添加した。ＳＴＹＭ１抽出物のアリコートを分離するために、シュウ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加して最終濃度６．６ｍＭ及び６６ｍＭにし、亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加して最終濃度２０ｍＭにし、アジ化ナトリウム（Ｆｉｓｃｈｅｒ）を添加して最終濃度１ｍＭ、１００μＭ、及び１０μＭにした。ＥＤＴＡ処理では、ＥＤＴＡを添加して最終濃度５ｍＭとし、寒天重層またはマンガン補充の前に室温で１時間インキュベートした。一部のＥＤＴＡ処理サンプルでは、ＥＤＴＡとの１時間のインキュベーション後にＭｎＣｌ_２を添加して最終濃度５ｍＭ及び１０ｍＭとし、サンプルを室温でさらに１時間インキュベートした後、寒天オーバーレイアッセイにプレーティングした。

ＳＴＹＭ１抽出物の分画
ＳＴＹＭ１培養物の４０ｍＬ細胞抽出物からのタンパク質は、段階的な硫酸アンモニウム沈殿によって沈殿させた。簡単に説明すると、硫酸アンモニウムを添加して、各ステップ中３０％、４０％、５０％、及び６０％飽和の状態にした。各ステップを追加した後、抽出物を４℃で１時間回転させ、１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上清を次の飽和ステップアップに使用し、タンパク質ペレットを同じ飽和硫酸アンモニウムバッファ４０ｍＬで１回洗浄した後、ｃＯｍｐｌｅｔｅＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０１～２ｍＬに溶解させた。次に、各ステップからの可溶化ペレットを、寒天オーバーレイアッセイで、Ｐｇに対する阻害活性について試験した。

阻害活性を有する硫酸アンモニウム沈殿画分を、６～８ｋＤａのＭＷＣＯ透析チューブ内で５００容量の２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０に対して一晩透析した。これらのサンプルの陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｈｉ－ＴｒａｐＣａｐｔｏＱ１ｍＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたｄｕｏ－ｆｌｏｗｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）で実施した。カラムを５ｍＬの２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０で平衡化した後、サンプルをカラムにアプライし、結合したタンパク質を０～１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０の直線勾配で、１ｍＬ／分の流量で２５ｍＬ超溶出した。各１ｍＬ画分は、寒天オーバーレイアッセイで阻害活性について試験を行った。阻害活性を有する画分をプールし、１０ｋＤａＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５００μＬに濃縮した後、２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分画させた。各１ｍＬ画分は、寒天オーバーレイアッセイで阻害活性について試験を行った。各画分のタンパク質含有量は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びクーマシー染色によって評価した。目的のタンパク質バンドをゲルから切り出し、タンデム液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により分析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、標準プロトコルに従って、ＴａｐｌｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＦａｃｉｌｉｔｙ、ＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌによって実施した。

トランスポゾンライブラリースクリーニング及びＳＴＹＭ１抽出物曝露アッセイ
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＷ８３トランスポゾンライブラリーのアリコートを、２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０でＯＤ_６００が１．４になるように調整した。Ｗ８３または個々のトランスポゾン変異体を用いた曝露実験では、菌株をＢＨＩで４８時間成長させ、その時点で９，３００×ｇで５分間遠心分離することによって回収し、２０ｍＭＢｉｓ－ＴｒｉｓｐＨ７．０にＯＤ６００１．４で再懸濁した。これらの懸濁液５００μＬに、ＳＴＹＭ１粗抽出物を添加して、総タンパク質の最終濃度１ｍｇ／ｍＬとした。懸濁液を３７℃で３時間インキュベートした。連続希釈液を血液寒天プレートにプレーティングし、３７℃で６日間インキュベートして、コロニー形成単位を数えた。トランスポゾン変異体の生き残ったコロニーを血液寒天プレート上で再単離し、それらのゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で調製した。

セミランダムＰＣＲ
トランスポゾン：単離されたトランスポゾン変異体のゲノム接合部は、２ラウンドのＰＣＲからなるセミランダムＰＣＲによって決定した。最初のラウンドでは、プライマーｐＷＨ２＿ｓｅｑ１及びａｒｂ１を使用し、９６℃で３分間の初期変性、次いで９６℃で１分間、３０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を５サイクル、その後、さらに、５５℃でのアニーリングステップ、及び７２℃で５分間の伸長を含む３５サイクルで構成した。２ラウンド目では、２μＬの最初の反応物をテンプレートとして使用し、プライマーｐＷＨ２＿ｓｅｑ２及びａｒｂ２を使用した。反応は、９６℃で３分間の初期変性、その後９６℃で１分間、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３５サイクル、次いで７２℃で５分間の最終伸長で構成した。サンプルは、ＰｒｏｍｅｇａＷｉｚａｒｄｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して精製した。サンプルをｐＷＨ２＿ｓｅｑ３プライマーで配列決定し、配列をＷ８３ゲノムにアラインメントして、トランスポゾン挿入の位置を決定した。

ｆｅｏＢ２トランスポゾン変異体相補体の構築
野生型ｆｅｏＢ２遺伝子（ＰＧ１２９４）及びその陰性プロモーター（２００ｂｐ上流）をＰＣＲ増幅し、ｐＴ－ＣＯＷ（１８）にライゲーションし、ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）に形質転換した。クローンは、制限消化、ＰＣＲ、及びシーケンシングによって確認した。新規プラスミドｐＴ－ＣＯＷ＿ＦｅｏＢ２は、Ｓ１７－１λｐｉｒＥ．Ｃｏｌｉに形質転換した（１９）。ｐＴ－ＣＯＷ＿ＦｅｏＢ２プラスミドを保持するＳ１７－１ λｐｉｒＥ．ｃｏｌｉは、各株の７５０μＬの対数期中期培養物（ＯＤ_６０００．４～０．８）を組み合わせて、９，６００×ｇで２分間遠心分離することにより、Ｔｎ－ｆｅｏＢ２株とコンジュゲートした。細胞ペレットを３７５μＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、抗生物質を含まない血液寒天プレートに移し、３７℃で５時間好気的にインキュベートした。プレート上の成長物を３００μＬのＰＢＳにこすり落とし、ゲンタマイシン及びテトラサイクリンを含む血液寒天プレートにプレーティングし、３７℃で７日間嫌気的にインキュベートした。相補性は、ＰＣＲ及びシーケンシングによって確認した。

プルシアンブルー過酸化水素検出
プルシアンブルーＴＳＡプレートは、以前に記載されたとおり作製した（２０）。過酸化水素の生成をアッセイするために、６ｍｍのウェルを寒天に切り込み、５０μＬの異なる濃度の過酸化水素またはテストサンプルのいずれかを添加し、室温で３０分から２時間インキュベートした後、撮像し、プルシアンブルーハロの直径を測定した。ＳＴＹＭ１抽出物には、次のようにオキシダーゼ基質及び補因子を添加した。ピルビン酸オキシダーゼの場合、基質であるピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）及びリン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ最終濃度が５０ｍＭになるように添加し、補因子であるチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）（Ｓｉｇｍａ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）（Ｓｉｇｍａ）、及びＭｎＣｌ_２を添加して、それぞれ最終濃度３００μＭ、１５μＭ、及び１０ｍＭとした。乳酸オキシダーゼの場合、ＤＬ－乳酸ナトリウムを最終濃度１５０ｍＭになるまで添加して、利用可能なＬ－乳酸５０ｍＭを確保し、補因子ＴＰＰ及びＦＡＤを添加して、それぞれ最終濃度３００μＭ及び１５μＭにした。

ラッカーゼアッセイ
ＳＴＹＭ１抽出物を、１０μＭのＣｕＳＯ_４及び１００μＭのシリンガラジンラッカーゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を含むバッファに添加した。バッファ対照と、５ｍＭ過酸化水素、１ｍｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び１００μＭシリンガラジンを含む陽性対照もアッセイに含めた。

ＲＮＡ単離及びｑＲＴ－ＰＣＲ
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＳＴＹＭ１由来のトータルＲＮＡは、ＢＨＩ培地で一晩成長させた後に単離させた。１ｍＬの培養物を９，３００×ｇで１０分間遠心分離し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。製造業者の指示に従ってＲＮＡを単離した。トータルＲＮＡの完全性をゲル電気泳動で調査した。製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）の指示に従って、ｔｕｒｂｏＤＮＡ－ｆｒｅｅｋｉｔを使用してＲＮＡをＤＮａｓｅで処理した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ逆転写システムを使用してｃＤＮＡを生成した。

ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＣＦＸＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でｉＴａｑＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して実行した。ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ及びＬＤＢＮＤ＿２０５１ｐｏｘのｃＤＮＡ由来の１５０ｂｐ産物を増幅するプライマーペアを添加して、最終濃度４００ｎＭとした。プライマーペアは、一方のプライマーが他方のｐｏｘ遺伝子内の同じ位置に対して少なくとも６つのミスマッチを有する場合に、互いの間で実質的な配列変異を示した２つの遺伝子の領域で設計した。熱サイクルは、９５℃で３分間の初期変性、次いで９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間の３９サイクルで構成した。生成物の融解曲線を調査して、単一のアンプリコンが生成されたことを確認した。ゲノムＤＮＡが存在しないことを確認するために、サンプルを３回実行し、逆転写酵素対照を含めた。各プライマーペアの標準曲線は、ＳＴＹＭ１ゲノムＤＮＡを使用して作成した。発現は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対して正規化した。

ピルビン酸オキシダーゼの精製
ＬＤＢＮＤ＿１４８７ピルビン酸オキシダーゼは、図２１に記載のプライマーを使用してＳＴＹＭ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。Ｃ末端プライマーは、グリシン－セリンリンカー、それに続く、６－ヒスチジンタグ及び終止コドンをコードした。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、ＰＣＲ産物をｐＦＬＡＧ－ＣＴＣベクター（Ｓｉｇｍａ）にライゲーションし、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換してプラスミドｐＦＬＡＧ－ＣＴＣ＿Ｐｏｘを得た。コンストラクトは、ＰＣＲ及び配列決定によって確認した。ｐＦＬＡＧ－ＣＴＣ＿Ｐｏｘは、ＰｏｘがＣ末端のＨｉｓ_６－Ｐｏｘとして発現しているＬＯＢＳＴＲＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。６ｍＬの種培養物（starter culture）を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢ中で３７℃で一晩インキュベートした。種培養物を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した４０ｍＬのＬＢで１：１００に希釈し、ＯＤ_６００が０．４～０．８に達するまで３７℃で成長させた。次に、温度を２６℃にシフトし、細胞を１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と共に２０時間インキュベートした。細胞を３，２００×ｇで１０分間遠心分離して回収し、１ｍＬＰＢＳＥＤＴＡフリーのｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁し、上記のとおり氷上で超音波処理して溶解させた。可溶性細胞溶解物を１６，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離することによって回収し、０．２２μｍフィルタでろ過して、無細胞の可溶性細胞溶解物を得た。可溶性細胞溶解物を１ｍＬのベッド体積のＨｉｓＰｕｒｅＮｉ－ＮＴＡレジン（Ｔｈｅｒｍｏ）にアプライし、溶出液を再びカラムにアプライしてタンパク質結合を最大化した。カラムを２５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳで２回洗浄し、次いで結合したタンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳでカラムから溶出させた。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって評価した。

ピルビン酸オキシダーゼ活性アッセイ
組換えＰｏｘのピルビン酸オキシダーゼ活性は、酸化的カップリング反応によって評価した。反応は、５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５μＭＦＡＤ、３００μＭＴＰＰ、０．０３％Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン（ＥＨＳＴＰ）（Ｓｉｇｍａ）、０．０１５％４－アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ）、及び３３μｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で構成した。典型的には、次に、精製されたＰｏｘ酵素の１：１０希釈液を、総反応量１ｍＬで添加した。精製されたＰｏｘを添加した直後に、キノンイミン色素の形成を、５５０ｎｍでの吸光度（室温で３０秒ごとに記録）の増加によって測定した。Ｐｏｘ活性は、過酸化水素を生成し、次にペルオキシダーゼによって使用され、ＥＨＳＴＰ及び４－アミノアンチピリンを酸化してキノンイミン色素を形成する。Ｐｏｘ活性は、５５０ｎｍ／分での吸光度の変化を測定することによって評価する。１単位のＰｏｘ活性は、１分あたり１μｍｏｌの過酸化水素の生成として定義される。既知の濃度の過酸化水素を用いた標準曲線を使用して、各条件下で形成されたキノンイミン色素の量を決定した。活性は次式に従って決定した：
比活性＝［（ΔＡ_５５０／分）（希釈係数）（総反応量）］／［（３６．８８）（０．５）（経路長）（サンプル体積）（Ｃ）］、
式中、総反応量は１ｍｌ、キノンイミン色素のミリモル吸光係数は３６．８８であり、１ｍｏｌの過酸化水素が０．５ｍｏｌのキノンイミン色素を生成するという事実に基づいて係数０．５を決定し、光路長は１ｃｍ、サンプル量は０．１ｍｌであり、Ｃは、未希釈酵素の濃度（ｍｇ／ｍｌ）である。

参考文献
１．ＨａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓＧ，ＬａｍｏｎｔＲＪ．２０１２．Ｂｅｙｏｎｄｔｈｅｒｅｄｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｉｎｔｏｍｏｒｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：ｔｈｅｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｙｎｅｒｇｙａｎｄｄｙｓｂｉｏｓｉｓ（ＰＳＤ）ｍｏｄｅｌｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅｅｔｉｏｌｏｇｙ．ＭｏｌＯｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２７：４０９－４１９．
２．ＳｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｒＪ，ｄｅＶｒｅｓｅＭ．２００１．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ，ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｄｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ－－ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇａｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ＡｍＪＣｌｉｎＮｕｔｒ７３：３６１Ｓ－３６４Ｓ．
３．ＭｏａｙｙｅｄｉＰ，ＦｏｒｄＡＣ，ＴａｌｌｅｙＮＪ，ＣｒｅｍｏｎｉｎｉＦ，Ｆｏｘｘ－ＯｒｅｎｓｔｅｉｎＡＥ，ＢｒａｎｄｔＬＪ，ＱｕｉｇｌｅｙＥＭＭ．２０１０．Ｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｒｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗ．Ｇｕｔ５９：３２５－３３２．
４．ＤｅｌｚｅｎｎｅＮＭ，ＮｅｙｒｉｎｃｋＡＭ，ＢａｃｋｈｅｄＦ，ＣａｎｉＰＤ．２０１１．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｉｎｏｂｅｓｉｔｙ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．ＮａｔＲｅｖＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ７：６３９－６４６．
５．ＹｏｏＳ－Ｒ，ＫｉｍＹ－Ｊ，ＰａｒｋＤ－Ｙ，ＪｕｎｇＵ－Ｊ，ＪｅｏｎＳ－Ｍ，ＡｈｎＹ－Ｔ，ＨｕｈＣ－Ｓ，ＭｃＧｒｅｇｏｒＲ，ＣｈｏｉＭＳ．２０１３．ＰｒｏｂｉｏｔｉｃｓＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍａｎｄＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌｔｅｒｈｅｐａｔｉｃｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄｏｂｅｓｉｔｙ．ＯｂｅｓＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇＭｄ２１：２５７１－２５７８．
６．ｄｅＳｏｕｓａＭｏｒａｅｓＬＦ，ＧｒｚｅｓｋｏｗｉａｋＬＭ，ｄｅＳａｌｅｓＴｅｉｘｅｉｒａＴＦ，ＧｏｕｖｅｉａＰｅｌｕｚｉｏＭｄｏＣ．２０１４．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａａｎｄｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎｃｅｌｉａｃｄｉｓｅａｓｅ．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ２７：４８２－４８９．
７．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ－ＨｕｍａｒａｎＬＧ，ＡｕｂｒｙＣ，ＭｏｔｔａＪ－Ｐ，ＤｅｒａｉｓｏｎＣ，Ｓ７１４ｔｅｉｄｌｅｒＬ，ＶｅｒｇｎｏｌｌｅＮ，ＣｈａｔｅｌＪ－Ｍ，ＬａｎｇｅｌｌａＰ．２０１３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｌａｃｔｏｃｏｃｃｉａｎｄｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１６：２７８－２８３．
８．ＮｉｓｈｉｙａｍａＫ，ＳｅｔｏＹ，ＹｏｓｈｉｏｋａＫ，ＫａｋｕｄａＴ，ＴａｋａｉＳ，ＹａｍａｍｏｔｏＹ，ＭｕｋａｉＴ．２０１４．ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＳＢＴ２０５５ｒｅｄｕｃｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙａｎｄｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ．ＰｌｏＳＯｎｅ９：ｅ１０８８２７．
９．ＣａｒｒｅｒａｓＮＬ，ＭａｒｔｏｒｅｌｌＰ，ＣｈｅｎｏｌｌＥ，ＧｅｎｏｖｅｓＳ，ＲａｍｏｎＤ，ＡｌｅｉｘａｎｄｒｅＡ．２０１８．Ａｎｔｉ－ｏｂｅｓｉｔｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓＣＥＣＴ８１４５ｉｎＺｕｃｋｅｒｆａｔｔｙｒａｔｓ．ＢｅｎｅｆＭｉｃｒｏｂｅｓ９：６２９－６４１．
１０．ＰａｎｉｇｒａｈｉＰ，ＰａｒｉｄａＳ，ＮａｎｄａＮＣ，ＳａｔｐａｔｈｙＲ，ＰｒａｄｈａｎＬ，ＣｈａｎｄｅｌＤＳ，ＢａｃｃａｇｌｉｎｉＬ，ＭｏｈａｐａｔｒａＡ，ＭｏｈａｐａｔｒａＳＳ，ＭｉｓｒａＰＲ，ＣｈａｕｄｈｒｙＲ，ＣｈｅｎＨＨ，ＪｏｈｎｓｏｎＪＡ，ＭｏｒｒｉｓＪＧ，ＰａｎｅｔｈＮ，ＧｅｗｏｌｂＩＨ．２０１７．ＡｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｓｙｎｂｉｏｔｉｃｔｒｉａｌｔｏｐｒｅｖｅｎｔｓｅｐｓｉｓａｍｏｎｇｉｎｆａｎｔｓｉｎｒｕｒａｌＩｎｄｉａ．Ｎａｔｕｒｅ５４８：４０７－４１２．
１１．ＰａｎｄｅｙＫＲ，ＮａｉｋＳＲ，ＶａｋｉｌＢＶ．２０１５．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ，ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ－ａｒｅｖｉｅｗ．ＪＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ５２：７５７７－７５８７．
１２．ＬｉｎＴ－Ｈ，ＬｉｎＣ－Ｈ，ＰａｎＴ－Ｍ．２０１８．Ｔｈｅｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｄｅｎｔａｌｃａｒｉｅｓ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１０２：５７７－５８６．
１３．ＧｒｕｎｅｒＤ，ＰａｒｉｓＳ，ＳｃｈｗｅｎｄｉｃｋｅＦ．２０１６．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｆｏｒｍａｎａｇｉｎｇｃａｒｉｅｓａｎｄｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．ＪＤｅｎｔ４８：１６－２５．
１４．ＡｈｏｌａＡＪ，Ｙｌｉ－ＫｎｕｕｔｔｉｌａＨ，ＳｕｏｍａｌａｉｎｅｎＴ，ＰｏｕｓｓａＴ，ＡｈｌｓｔｒｏｍＡ，ＭｅｕｒｍａｎＪＨ，ＫｏｒｐｅｌａＲ．２００２．Ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｈｅｅｓｅａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｄｅｎｔａｌｃａｒｉｅｓｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓ．ＡｒｃｈＯｒａｌＢｉｏｌ４７：７９９－８０４．
１５．ＫｒａｓｓｅＰ，ＣａｒｌｓｓｏｎＢ，ＤａｈｌＣ，ＰａｕｌｓｓｏｎＡ，ＮｉｌｓｓｏｎＡ，ＳｉｎｋｉｅｗｉｃｚＧ．２００６．ＤｅｃｒｅａｓｅｄｇｕｍｂｌｅｅｄｉｎｇａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｇｉｎｇｉｖｉｔｉｓｂｙｔｈｅｐｒｏｂｉｏｔｉｃＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ．ＳｗｅｄＤｅｎｔＪ３０：５５－６０．
１６．ＴｗｅｔｍａｎＳ，ＫｅｌｌｅｒＭＫ．２０１２．Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｆｏｒｃａｒｉｅｓｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ．ＡｄｖＤｅｎｔＲｅｓ２４：９８－１０２．
１７．ＫｉｍＨ－Ｓ，ＫｉｍＹ－Ｙ，ＯｈＪ－Ｋ，ＢａｅＫ－Ｈ．２０１７．Ｉｓｙｏｇｕｒｔｉｎｔａｋｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓｄｕｅｔｏｃａｌｃｉｕｍ？ＰＬＯＳＯＮＥ１２：ｅ０１８７２５８．
１８．ＧＡＲＤＮＥＲＲＧ，ＲＵＳＳＥＬＬＪＢ，ＷＩＬＳＯＮＤＢ，ＷＡＮＧＧ－Ｒ，ＳＨＯＥＭＡＫＥＲＮＢ．１９９６．ＵｓｅｏｆａＭｏｄｉｆｉｅｄＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ－ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａＳｈｕｔｔｌｅＶｅｃｔｏｒＴｏＴｒａｎｓｆｅｒａＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ^Ｎ _Ｌ－１，４－Ｄ－ＥｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅＧｅｎｅｉｎｔｏＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｕｎｉｆｏｒｍｉｓａｎｄＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｒｕｍｉｎｉｃｏｌａＢ１４．ＡＰＰＬＥｎｖＭＩＣＲＯＢＩＯＬ６２：７．
１９．ＳｉｍｏｎＲ，ＰｒｉｅｆｅｒＵ，ＰｕｈｌｅｒＡ．１９８３．ＡＢｒｏａｄＨｏｓｔＲａｎｇｅＭｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎＶｉｖｏＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＴｒａｎｓｐｏｓｏｎＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｉｎＧｒａｍＮｅｇａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１：７８４－７９１．
２０．ＹｕＺ，ＺｈｏｕＮ，ＺｈａｏＣ，ＱｉｕＪ．２０１３．Ｉｎ－ＧｅｌＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＬ－ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＯｘｉｄａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｒｕｓｓｉａｎＢｌｕｅ－ＦｏｒｍｉｎｇＲｅａｃｔｉｏｎ．ＰＬＯＳＯＮＥ８：ｅ５５５４８．
２１．ＰａｎｇＸ－Ｙ，ＣｕｉＷ－Ｍ，ＬｉｕＬ，ＺｈａｎｇＳ－Ｗ，ＬｖＪ－Ｐ．２０１４．ＧｅｎｅＫｎｏｃｋｏｕｔａｎｄＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＲｅｖｅａｌｅｄｔｈｅＲｏｌｅｏｆＮ－ＡｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅｉｎＡｕｔｏｌｙｓｉｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓＬｊｊ－６．ＰＬＯＳＯＮＥ９：ｅ１０４８２９．
２２．ＬｏｒｔａｌＳ，Ｃｈａｐｏｔ－ＣｈａｒｔｉｅｒＭ－Ｐ．２００５．Ｒｏｌｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｌｙｓｉｓｉｎｃｈｅｅｓｅ．ＩｎｔＤａｉｒｙＪ１５：８５７－８７１．
２３．ＤａｓｈｐｅｒＳＧ，ＢｕｔｌｅｒＣＡ，ＬｉｓｓｅｌＪＰ，ＰａｏｌｉｎｉＲＡ，ＨｏｆｆｍａｎｎＢ，ＶｅｉｔｈＰＤ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ－ＳｉｍｐｓｏｎＮＭ，ＳｎｅｌｇｒｏｖｅＳＬ，ＴｓｉｒｏｓＪＴ，ＲｅｙｎｏｌｄｓＥＣ．２００５．ＡＮｏｖｅｌＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＦｅｏＢＰｌａｙｓａＲｏｌｅｉｎＭａｎｇａｎｅｓｅＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０：２８０９５－２８１０２．
２４．ＨｅＪ，ＭｉｙａｚａｋｉＨ，ＡｎａｙａＣ，ＹｕＦ，ＹｅｕｄａｌｌＷＡ，ＬｅｗｉｓＪＰ．２００６．ＲｏｌｅｏｆＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＦｅｏＢ２ｉｎＭｅｔａｌＵｐｔａｋｅａｎｄＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ７４：４２１４－４２２３．
２５．Ａｎａｙａ－ＢｅｒｇｍａｎＣ，ＨｅＪ，ＪｏｎｅｓＫ，ＭｉｙａｚａｋｉＨ，ＹｅｕｄａｌｌＡ，ＬｅｗｉｓＪＰ．２０１０．ＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＦｅｒｒｏｕｓＩｒｏｎＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＦｅｏＢ１ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ７８：６８８－６９６．
２６．ＩｍｌａｙＪＡ．２０１３．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍａｍｏｄｅｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１１：４４３－４５４．
２７．ＬｏｒｑｕｅｔＦ，ＧｏｆｆｉｎＰ，ＭｕｓｃａｒｉｅｌｌｏＬ，ＢａｕｄｒｙＪ－Ｂ，ＬａｄｅｒｏＶ，ＳａｃｃｏＭ，ＫｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍＭ，ＨｏｌｓＰ．２００４．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｏｘＢＧｅｎｅ，ＷｈｉｃｈＥｎｃｏｄｅｓ
ＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅｉｎＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１８６：３７４９－３７５９．
２８．ＳｅｄｅｗｉｔｚＢ，ＳｃｈｌｅｉｆｅｒＫＨ，ＧｏｔｚＦ．１９８４．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１６０：２７３－２７８．
２９．ＳｏｌｏｍｏｎＥＩ，ＳｕｎｄａｒａｍＵＭ，ＭａｃｈｏｎｋｉｎＴＥ．１９９６．ＭｕｌｔｉｃｏｐｐｅｒＯｘｉｄａｓｅｓａｎｄＯｘｙｇｅｎａｓｅｓ．ＣｈｅｍＲｅｖ９６：２５６３－２６０６．
３０．ＣｌａｕｓＨ，ＦｉｌｉｐＺ．１９９７．Ｔｈｅｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆａｌａｃｃａｓｅ－ｌｉｋｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓｓｔｒａｉｎ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｓ１５２：２０９－２１６．
３１．ＨｕｌｌｏＭ－Ｆ，ＭｏｓｚｅｒＩ，ＤａｎｃｈｉｎＡ，Ｍａｒｔｉｎ－ＶｅｒｓｔｒａｅｔｅＩ．２００１．ＣｏｔＡｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＩｓａＣｏｐｐｅｒ－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＬａｃｃａｓｅ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１８３：５４２６－５４３０．
３２．ＳｃｈｌｏｓｓｅｒＤ，ＨｏｆｅｒＣ．２００２．Ｌａｃｃａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＭｎ（２＋）ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｎａｔｕｒａｌＭｎ（３＋）ｃｈｅｌａｔｏｒｓａｓａｎｏｖｅｌｓｏｕｒｃｅｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＨ（２）Ｏ（２）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｍａｎｇａｎｅｓｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６８：３５１４－３５２１．
３３．ＨａｒｋｉｎＪＭ，ＯｂｓｔＪＲ．１９７３．Ｓｙｒｉｎｇａｌｄａｚｉｎｅ，ａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｌａｃｃａｓｅａｎｄｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎｆｕｎｇｉ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ２９：３８１－３８７．
３４．ＭａｓｓｅｙＶ，ＭｕｌｌｅｒＦ，ＦｅｌｄｂｅｒｇＲ，ＳｃｈｕｍａｎＭ，ＳｕｌｌｉｖａｎＰＡ，ＨｏｗｅｌｌＬＧ，ＭａｙｈｅｗＳＧ，ＭａｔｔｈｅｗｓＲＧ，ＦｏｕｓｔＧＰ．１９６９．ＴｈｅＲｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＦｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈＳｕｌｆｉｔｅＰＯＳＳＩＢＬＥＲＥＬＥＶＡＮＣＥＴＯＴＨＥＰＲＯＢＬＥＭＯＦＯＸＹＧＥＮＲＥＡＣＴＩＶＩＴＹ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２４４：３９９９－４００６．
３５．ＭｕｌｌｅｒＦ，ＭａｓｓｅｙＶ．１９６９．Ｆｌａｖｉｎ－ＳｕｌｆｉｔｅＣｏｍｐｌｅｘｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２４４：４００７－４０１６．
３６．ＧｈｉｓｌａＳ，ＭａｓｓｅｙＶ．１９７５．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｌａｖｏｅｎｚｙｍｅｌａｃｔａｔｅｏｘｉｄａｓｅｂｙｏｘａｌａｔｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５０：５７７－５８４．
３７．ＳｌｏｍｃｚｙｎｓｋｉＤ，ＮａｋａｓＪＰ，ＴａｎｅｎｂａｕｍＳＷ．１９９５．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＬａｃｃａｓｅｆｒｏｍＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ６１－３４．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６１：９０７－９１２．
３８．ＲｉｌｅｙＭＡ，ＣｈａｖａｎＭＡ．２００７．Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ－ＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．
３９．ＣｏｔｔｅｒＰＤ，ＲｏｓｓＲＰ，ＨｉｌｌＣ．２０１３．Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ－ａｖｉａｂｌｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ？ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１１：９５．
４０．Ｍａｒｔｙ－ＴｅｙｓｓｅｔＣ，ＴｏｒｒｅＦｄｅｌａ，ＧａｒｅｌＪ－Ｒ．２０００．ＩｎｃｒｅａｓｅｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄｅｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓｕｐｏｎＡｅｒａｔｉｏｎ：ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆａｎＮＡＤＨＯｘｉｄａｓｅｉｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６６：２６２－２６７．
４１．ＨｅｒｔｚｂｅｒｇｅｒＲ，ＡｒｅｎｔｓＪ，ＤｅｋｋｅｒＨＬ，ＰｒｉｄｍｏｒｅＲＤ，ＧｙｓｌｅｒＣ，ＫｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍＭ，ＭａｔｔｏｓＭＪＴｄｅ．２０１４．Ｈ２Ｏ２ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＳｐｅｃｉｅｓｏｆｔｈｅＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＧｒｏｕｐ：ａＣｅｎｔｒａｌＲｏｌｅｆｏｒａＮｏｖｅｌＮＡＤＨ－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＦｌａｖｉｎＲｅｄｕｃｔａｓｅ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ８０：２２２９－２２３９．
４２．ＴｈａｒｒｉｎｇｔｏｎＧ，ＳｏｒｒｅｌｌｓＫＭ．１９９２．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｂｙＭｉｌｋＣｕｌｔｕｒｅＦｉｌｔｒａｔｅｓｆｒｏｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ．ＪＦｏｏｄＰｒｏｔ５５：５４２－５４４．
４３．ＤａｈｉｙａＲＳ，ＳｐｅｃｋＭＬ．１９６８．ＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄｅＦｏｒｍａｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉａｎｄＩｔｓＥｆｆｅｃｔｏｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ１．ＪＤａｉｒｙＳｃｉ５１：１５６８－１５７２．
４４．ＰｒｉｃｅＲＪ，ＬｅｅＪＳ．１９７０．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｅｃｉｅｓｂｙｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ．ＪＭｉｌｋＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌ３３：１３－１８．
４５．ＧｏｆｆｉｎＰ，ＭｕｓｃａｒｉｅｌｌｏＬ，ＬｏｒｑｕｅｔＦ，ＳｔｕｋｋｅｎｓＡ，ＰｒｏｚｚｉＤ，ＳａｃｃｏＭ，ＫｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍＭ，ＨｏｌｓＰ．２００６．ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＡｃｅｔａｔｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅＳｕｒｖｉｖａｌｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｄｕｒｉｎｇｔｈｅＳｔａｔｉｏｎａｒｙＰｈａｓｅｏｆＡｅｒｏｂｉｃＧｒｏｗｔｈ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ７２：７９３３－７９４０．
４６．ＬｅｅＳＪ，ＧｒａｌｌａＪＤ．２００１．Ｓｉｇｍａ３８（ｒｐｏＳ）ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＰｒｏｍｏｔｅｒＥｎｇａｇｅｍｅｎｔｖｉａ－１０ＲｅｇｉｏｎＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７６：３００６４－３００７１．
４７．ＰｏｕｗｅｌｓＰＨ，ＬｅｅｒＲＪ．１９９３．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ：Ｐｌａｓｍｉｄｓａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ６４：８５－１０７．
４８．ＣｏｍｐｉｌａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｒｏｍｏｔｅｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ｜ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ｜ＯｘｆｏｒｄＡｃａｄｅｍｉｃ．
４９．ＣｈａｎｇＹ－Ｙ，ＷａｎｇＡ－Ｙ，ＣｒｏｎａｎＪＥ．１９９４．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ（ＰｏｘＢ）ｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｓｉｇｍａｆａｃｔｏｒｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｈｅｒｐｏＳ（ｋａｔＦ）ｇｅｎｅ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１１：１０１９－１０２８．
５０．ＴａｎｉａｉＨ，ＩｉｄａＫ，ＳｅｋｉＭ，ＳａｉｔｏＭ，ＳｈｉｏｔａＳ，ＮａｋａｙａｍａＨ，ＹｏｓｈｉｄａＳ．２００８．ＣｏｎｃｅｒｔｅｄＡｃｔｉｏｎｏｆＬａｃｔａｔｅＯｘｉｄａｓｅａｎｄＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅｉｎＡｅｒｏｂｉｃＧｒｏｗｔｈｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＲｏｌｅｏｆＬａｃｔａｔｅａｓａｎＥｎｅｒｇｙＳｏｕｒｃｅ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９０：３５７２－３５７９．
５１．ＥｓｃｈｅｎｂａｃｈＤＡ，ＤａｖｉｃｋＰＲ，ＷｉｌｌｉａｍｓＢＬ，ＫｌｅｂａｎｏｆｆＳＪ，Ｙｏｕｎｇ－ＳｍｉｔｈＫ，ＣｒｉｔｃｈｌｏｗＣＭ，ＨｏｌｍｅｓＫＫ．１９８９．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓｉｎｎｏｒｍａｌｗｏｍｅｎａｎｄｗｏｍｅｎｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌｖａｇｉｎｏｓｉｓ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２７：２５１－２５６．
５２．ＨａｗｅｓＳＥ，ＨｉｌｌｉｅｒＳＬ，ＢｅｎｅｄｅｔｔｉＪ，ＳｔｅｖｅｎｓＣＥ，ＫｏｕｔｓｋｙＬＡ，Ｗｏｌｎｅｒ－ＨａｎｓｓｅｎＰ，ＨｏｌｍｅｓＫＫ．１９９６．ＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄｅ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉａｎｄＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆＶａｇｉｎａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１７４：１０５８－１０６３．
５３．ＶｏｌｔａｎＳ，ＭａｒｔｉｎｅｓＤ，ＥｌｌｉＭ，ＢｒｕｎＰ，ＬｏｎｇｏＳ，ＰｏｒｚｉｏｎａｔｏＡ，ＭａｃｃｈｉＶ，Ｄ’ＩｎｃａＲ，ＳｃａｒｐａＭ，ＰａｌｕＧ，ＳｔｕｒｎｉｏｌｏＧＣ，ＭｏｒｅｌｌｉＬ，ＣａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏＩ．２００８．ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｒｉｓｐａｔｕｓＭ２４７－ＤｅｒｉｖｅｄＨ２Ｏ２ＡｃｔｓａｓａＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇＭｏｌｅｃｕｌｅＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ－γ ｉｎｔｈｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＭｕｃｏｓａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３５：１２１６－１２２７．
５４．ＺｈｕＬ，ＫｒｅｔｈＪ．２０１２．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆＨｙｄｒｏｇｅｎＰｅｒｏｘｉｄｅｉｎＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＡｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆＯｒａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．ＯｘｉｄＭｅｄＣｅｌｌＬｏｎｇｅｖ２０１２．
５５．ＺｈｕＬ，ＸｕＹ，ＦｅｒｒｅｔｔｉＪＪ，ＫｒｅｔｈＪ．２０１４．ＰｒｏｂｉｎｇＯｒａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ－ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｘＢｉｎＰｌａｑｕｅＳａｍｐｌｅｓ．ＰＬＯＳＯＮＥ９：ｅ８６６８５．
５６．ＫｕｒａｍｉｔｓｕＨＫ，ＨｅＸ，ＬｕｘＲ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＭＨ，ＳｈｉＷ．２００７．ＩｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎＯｒａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｏｌＢｉｏｌＲｅｖＭＭＢＲ７１：６５３－６７０．
５７．ＫｒｅｔｈＪ，ＺｈａｎｇＹ，ＨｅｒｚｂｅｒｇＭＣ．２００８．ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＡｎｔａｇｏｎｉｓｍｉｎＯｒａｌＢｉｏｆｉｌｍｓ：ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓａｎｄＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９０：４６３２－４６４０．
５８．ＨｉｌｌｍａｎＪＤ，ＳｏｃｒａｎｓｋｙＳＳ，ＳｈｉｖｅｒｓＭ．１９８５．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｐａｔｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｈｕｍａｎｄｅｎｔａｌｐｌａｑｕｅ．ＡｒｃｈＯｒａｌＢｉｏｌ３０：７９１－７９５．
５９．ＫｗａｎＲＣＨ，ＬｅｕｎｇＨＦ，ＨｏｎＰＹＴ，ＢａｒｆｏｒｄＪＰ，ＲｅｎｎｅｂｅｒｇＲ．２００５．Ａｓｃｒｅｅｎ－ｐｒｉｎｔｅｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｕｓｉｎｇｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｏｒｒａｐｉｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｗａｓｔｅｗａｔｅｒ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ６６：３７７－３８３．
６０．ＲａｈｍａｎＭＡ，ＰａｒｋＤ－Ｓ，ＣｈａｎｇＳ－Ｃ，ＭｃＮｅｉｌＣＪ，ＳｈｉｍＹ－Ｂ．２００６．Ｔｈｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｍｏｄｉｆｉｅｄｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｆｏｒｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｏｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．ＢｉｏｓｅｎｓＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ２１：１１１６－１１２４．
６１．ＳｉｔｕｍｏｒａｎｇＭ，ＧｏｏｄｉｎｇＪＪ，ＨｉｂｂｅｒｔＤＢ，ＢａｒｎｅｔｔＤ．ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＰｙｒｕｖａｔｅＢｉｏｓｅｎｓｏｒＵｓｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｓｉｔｅｄＰｏｌｙｔｙｒａｍｉｎｅ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ１４：１７－２１．

実施例２：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉから過酸化水素を生成するピルビン酸オキシダーゼは、ホスホチジルエタノールアミンによって触媒的に活性化される。
ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｏｘ）は、オキシドレダクターゼファミリーの酵素である。過酸化水素を生成するＰｏｘ酵素及び酢酸を生成するＰｏｘ酵素がある。過酸化水素を生成するＰｏｘ酵素では、ピルビン酸、リン酸、及び酸素が、補因子であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）及びチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を使用して、アセチルリン酸、二酸化炭素、及び過酸化水素に変換される（１）。酢酸生成Ｐｏｘ酵素は、ピルビン酸の酸化的脱炭酸を触媒して、二酸化炭素及び酢酸を形成し、電子は膜に埋め込まれた電子担体を介して電子伝達系に直接移動する（２，３）。

過酸化水素を生成するＰｏｘ酵素は、複数の異なる細菌によって生成される。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰｏｘ酵素が最もよく研究されている。これらの酵素は、ホモ四量体構造を形成する（４，５）。中枢代謝におけるＰｏｘ酵素の役割は、好気性代謝中に酢酸キナーゼと協調してＡＴＰ生成を増加させると考えられている（６）。ＴＣＡサイクルを有さないＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、グルコースからの追加のＡＴＰ生成はこの経路由来であると考えられている（７）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰｏｘは、酢酸キナーゼの基質としてアセチルリン酸を生成することにより、好気性成長において観察される促進されたバイオマスの重要な構成要素であると考えられている（６）。さらに、Ｐｏｘからの過酸化水素の生成も群集レベルで重要であり得る。過酸化水素は一部の細菌に有毒であるため、Ｐｏｘ活性により産生因子の有機体に適応度の利点が得られ得る。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、ｐｏｘ欠損変異体は、おそらく接着特性の低下によって、また潜在的に共生細菌との競争の低下によって、ラットの疾患モデルにおいて毒性の低下を示す（８）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓは、主にＰｏｘを介して、口腔病原菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎを阻害するのに十分な過酸化水素を生成することが知られている（９）。

最もよく研究されている酢酸生成Ｐｏｘは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のものである。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘは、他のＰｏｘ酵素と同じ補因子に依存しており、ホモ四量体でもある（１０）。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘは、酢酸を生成し、最終的な電子受容体として酸素を利用することはないが、膜に埋め込まれたユビキノン８電子伝達分子を利用する（２）。ＣｉｄＣは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来の別の酢酸生成Ｐｏｘ酵素であり、電子をメナキノンに伝達し、細胞死経路に重要な役割を有する（３）。ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰＱＯも酢酸を生成し、電子をキノンに伝達する（１１）。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘ、ＰＱＯ、及びＣｉｄＣの１つの特徴は、リン脂質によって触媒的に活性化されることであり、リン脂質は、膜周辺位置で酵素を活性化することにより、膜電子シャトルへの効率的な移動を促進すると考えられている（３，１１，１２）。酵素の脂質活性化を妨害するＥ．ｃｏｌｉＰｏｘ中の変異体は、タンパク質のＣ末端領域に局在している。さらなる生化学的分析により、Ｃ末端領域（アミノ酸５５８～５６８）中で脂質活性化ヘリックスが同定され、脂質相互作用により、先行するアルファヘリックスの活性部位からの移動を誘導し、次いでフェニルアラニン４６５が活性部位に配置され、ＴＰＰとＦＡＤとの間の電子伝達が増強される（１３～１５）。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘのリン脂質活性化は、Ｋ型及びＶ型のアロステリック活性化のハイブリッドであり、ピルビン酸のｋ_ｍは、酵素の代謝回転率の増加と共に減少する。しかし、ＣｉｄＣでは、活性化はＶ型であり、酵素の代謝回転率が実質的に増加する（３）。

現在の研究では、過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素が、一般的な細菌膜成分であるホスホチジルエタノールアミンによって特異的に触媒的に活性化されるＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉから同定された。さらに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、五量体構造を採用し、Ｐｏｘ酵素にとって新規である五量体の二量体を採用する可能性があることが示された。これらの特徴は、過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素に固有のものであり、様々な細菌種からのＰｏｘの構造及び機能にかなりの変動があることを示している。

結果
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの特徴付け
Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘはよく研究されており、この酵素は、リン脂質によって触媒的に活性化されることが知られている（１２，１３，１７）。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ｇｌｕｔｉｃａｔｉｃｕｍのＣｉｄＣ及びＰＱＯは、それぞれ脂質で活性化される他のピルビン酸オキシダーゼである（３，１１）。よく研究されている別のＰｏｘ酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のものである（１，６，１８）。この酵素は、リン脂質によって触媒的に活性化されることは示されておらず、これは、Ｐｏｘ酵素の触媒的活性化に変動性があることを示している。

最初に、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘ酵素の生化学的特性を決定した。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは事前に精製されており、その後の試験に使用した（１６）。ピルビン酸及びリン酸のｋ_ｍ値及びｋ_ｃａｔ値を決定した。ピルビン酸及びリン酸のｋ_ｍは、それぞれ３４２．２μＭ及び８ｍＭであり、ｋ_ｃａｔは、０．３６７ｓ^－１であった（図１３及び図２２）。他のいくつかのピルビン酸オキシダーゼ酵素の最適ｐＨはほぼ５．５であるため、様々なｐＨでのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの活性の試験を行い、そのｐＨ活性プロファイルを決定した。他のＰｏｘ酵素と一致して、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、５．５～６のｐＨ範囲で最も高い活性であった（図１３Ｃ）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、溶液中で五量体構造を形成する
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉＰｏｘの両方が、四量体構造を形成することが知られている（１，１０）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘも四量体を形成したか否かを判断するために、精製酵素を使用してゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。興味深いことに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、２つの主要なピークで溶出された。１つ目のピークは、計算分子量が６９４ｋＤａであり、２つ目は、計算分子量が３４５ｋＤａである（図１４Ａ～１４Ｂ）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘ単量体の分子量は６８ｋＤａである。したがって、第１のピークは、十量体に対応し、第２のピークは、五量体に対応した。最後のピークは、非結合ＦＡＤに対応した（図１４Ａ）。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる画分の分析では、約６８ｋＤａ及び１３８ｋＤａでＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの単量体及び二量体形態と一致する距離を移動した２つの異なるバンドが明らかになった（図１４Ｃ）。ゲルろ過からの最後のピークに対応する画分１３及び１４は、いかなるタンパク質も含まず、また、未結合ＦＡＤの存在が確認される黄色であった（図１４Ｃ）。１３８ｋＤａのタンパク質バンドが実際にＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの二量体であることを確認するために、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。還元条件下において、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは単量体としてのみ移動し、これは、１３８ｋＤａのバンドは、７２位がアミノ酸配列内の唯一のシステインであるため、おそらく７２位においてジスルフィド結合によって連結されている二量体であることを示している（図１４Ｄ）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのリン脂質活性化
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘ、ＣｉｄＣ、及びＰＱＯと同様のリン脂質によって活性化され得るという仮説が立てられた（２，３，１１）。ホスホチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスホチジルコリン（ＰＣ）、及びホスホチジルグリセロール（ＰＧ）のいずれかを添加することにより、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを触媒的に活性化できるか否かの試験を行った。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、ＰＥによって特異的に触媒的に活性化されたが、ＰＣやＰＧによっては活性化されなかった（図１５Ａ）。使用したリン脂質は同じアシル鎖構造（１６：０～１８：１）を含み、ヘッド基のみが異なり、これは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのリン脂質活性化に特異性があることを示している。ＰＥによるＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの完全な活性化プロファイルを決定するために、ＰＥ濃度のより広い範囲にわたって倍数活性を測定し、ＰＥを含まない酵素と比較して６倍超の活性化を観察した（図１７Ｂ）。このレベルの活性化は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣｉｄＣＰｏｘ（３倍活性化）のレベルを超えている（３）。

ＰＥがどのように酵素を活性化するかについての機構的洞察を得るために、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの速度論的パラメータをＰＥの存在下で試験した（図１６）。ＰＥを添加すると、ピルビン酸及びリン酸のｋ_ｍは、それぞれ５１９．９μＭ及び１．２５ｍＭであり、ｋ_ｃａｔは、６．８５ｓ^－１であった（図２３）。ＰＥの非存在下での酵素と比較したｋ_ｃａｔの約１８倍の増加及びリン酸ｋ_ｍの減少は、これらのパラメータが触媒活性化の主要な駆動因子であることを示唆しており、これはリン脂質の活性化時においてＥ．ｃｏｌｉＰｏｘ及びＣｉｄＣ中で観察されたｋ_ｃａｔの増加と一致する（３，１９）。ここで観察された活性化は、ｋ_ｃａｔが増加し、リン酸ｋ_ｍが減少したため、Ｖ型及びＫ型の活性化のハイブリッドであり、これもＥ．ｃｏｌｉＰｏｘと一致している（１５，１９）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘがＰＥミセルに挿入されるか否かも調査した。共沈実験は、ＰＥの存在下及び非存在下でＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを使用して実施した。ほぼすべての酵素が可溶性画分中に残存し、ＰＥと共沈しなかった。これはＥ．ｃｏｌｉＰｏｘとは対照的であった（１３）（図１７）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘのＣ末端は、脂質の活性化に重要である。
Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘのＣ末端は、酵素の脂質活性化に重要である（１３）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘ中でＣ末端が重要であるか否かの試験を行うために、最後の３２アミノ酸を欠いたＣ末端短縮型を生成した。酵素を精製し、ＰＥによって活性化される能力について試験を行った（図１８Ａ）。酵素は、ＰＥの非存在下で約１．３２Ｕ／ｍｇの比活性を有し、これは、完全長酵素の比活性よりも大きい（図１３Ｃ及び図１８Ｂ）。これは、脂質活性化を部分的に模倣するより大きい活性を有するＥ．ｃｏｌｉｐｏｘ短縮型と一致している（２０）。さらに、Δ３２酵素は、完全長酵素による約６倍の活性化と比較して、ＰＥによって弱くのみ活性化され、ＰＥを含まない酵素よりも約２倍高かった（図１５Ｂ及び図１８Ｃ）。これは、Ｃ末端配列がＰｏｘ酵素の脂質活性化に重要であることを示している。

考察
ここでは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉからの過酸化水素生成ピルビン酸オキシダーゼ酵素がＰＥによって特異的に触媒的に活性化されるが、他のリン脂質では活性化されず、酵素の最後の３２アミノ酸がこの活性化に重要であることが実証された。これは、リン脂質によって活性化されることが示されている最初の過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素であると考えられている。さらに、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、溶液中で五量体構造を形成し、その溶液中で少なくとも２つのサブユニットがシステイン７２間にジスルフィド結合を形成することが示された。他のＰｏｘ酵素は、四量体構造を形成し、ジスルフィド結合形成のエビデンスはなく、これは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘが他のＰｏｘ酵素とは異なる構造を有することを示す（１，１０）。

ＰＥのみが触媒活性に影響を有することは興味深いことである。これは、リン脂質ヘッド基のサイズ、形状、及び電荷が触媒活性化にとって重要であることを示唆している。Ｐｏｘ酵素が、膜にすでに組み込まれているリン脂質と相互作用する場合、ヘッド基は、細胞質に露出し、酵素に最も近接している。細胞質に面するエタノールアミンとの相互作用は、Ｃ末端の３２アミノ酸を介して発生する可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘと同様に、この相互作用は、ＦＡＤとＴＰＰとの間の電子伝達を促進し、リン酸ｋｍを減少させる酵素内のコンフォメーションシフトを誘発すると仮定した。この相互作用は、静電力によって媒介される可能性がある。実際に、リン脂質とのＣｉｄＣの相互作用は、主に静電力によって駆動されると考えられており、これは、ヘッド基との相互作用があることを示唆している（３）。さらに、ＰＥは、細菌膜の豊富な成分であることが知られているが、ＰＣはより一般的に真核生物及び哺乳動物の膜成分である（２１，２２）。したがって、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは細菌酵素であるため、ＰＥのみによる活性化は合理的である。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉによる過酸化水素生成の促進は、複雑な微生物群集において有益であり得る。実際に、Ｐｏｘによる過酸化水素の生成は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのような歯科病原体の阻害において重要であることが示されている（１６）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの五量体構造は、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰｏｘで観察されたものとは異なる（１，１０）。ゲルろ過データに基づくと、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉはまた、十量体または五量体の二量体を形成するが、これらのいずれが発生し得るかは不明である。興味深いことに、二量体が五量体の分子量と一致する溶出容量の画分に存在するため、五量体構造の成分である、ジスルフィド結合によって連結された二量体の形成も観察された。したがって、五量体の構造は、３つの単量体及び１つの二量体、または１つの単量体及び２つの二量体のいずれかで構成されている必要がある。

Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘ脂質活性化は、ピルビン酸Ｋ_ｍが減少し、ｋ_ｃａｔが増加するＫ型とＶ型のアロステリック活性化の混合物である（１９，２３）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘで観察された脂質活性化も、Ｋ型及びＶ型のアロステリック活性化の混合物であったが、変化した特定のパラメータは異なっていた。ピルビン酸ｋ_ｍはわずかに増加し、リン酸ｋ_ｍは減少した。Ｋ_ｃａｔは、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘと同様に実質的に（１８倍）増加した。ピルビン酸及びリン酸のｋ_ｍの変化は互いに相殺し得るため、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの脂質活性化は、主に酵素の代謝回転率の増加によって駆動されると考えられている。これは、酵素に対する脂質活性化の主な効果が、フェニルアラニンをＴＰＰとＦＡＤとの間の界面に近づくようにシフトさせて、電子伝達の効率を高めることであることを示すＥ．ｃｏｌｉＰｏｘの構造データと一致している（１５）。これにより、酵素の代謝回転率が実質的に向上すると考えられている。また、酵素の活性化がｋ_ｃａｔの１０倍の増加によってのみ駆動されたＣｉｄＣの活性化とも一致している（３）。

Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘは挿入して、基質の存在下で脂質と共沈する（１３）。これらの条件下では、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘとＰＥの共沈は観察されなかった。これは、挿入がなく、相互作用が一時的及び／または遠心力に耐えることができないほど弱い可能性があることを示唆している。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘは、膜内のユビキノン８に直接電子を伝達する必要があるため、膜に挿入させるか、膜と強固に結合させる必要性が高い場合がある（２）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣｉｄＣピルビン酸オキシダーゼは、リン脂質と相互作用するが、相互作用は、静電力によって媒介されると考えられており、これは、必ずしも膜に挿入する必要がないことを示している（３）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの膜への挿入及び強固な相互作用は、電子を膜電子シャトルに伝達する必要がないため、それほど重要ではない場合がある。膜との弱い結合はまた、過酸化水素の生成を調節するメカニズムであり得る。会合が強すぎるか、または膜への挿入があった場合、過剰な過酸化水素の生成により、細胞を中毒化させ得る。あるいは、リン脂質との単一の相互作用は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを活性化されたコンフォメーションにシフトさせる可能性があり、この場合、脂質活性化のための継続的な相互作用や挿入を必要としない。実際、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘの研究は、脂質活性化因子が酵素を活性化されたコンフォメーションに固定し得ることを示唆している（２３）。

Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘ、ＣｉｄＣ、及びＰＱＯは、唯一の既知の脂質活性化Ｐｏｘ酵素である（３，１１，１３）。これらのＰｏｘ酵素はおそらくこの能力を進化させたため、膜の近くまたは膜で最も活性が高く、電子を膜の電子シャトルに容易に伝達させ得る（３，１５）。本明細書において、及び以前に、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘが過酸化水素を生成し、それ自体が電子を酸素に伝達することが実証された（１６）。Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘの脂質活性化特徴は、その最終的な電子受容体に基づいて論理的である。しかし、膜内ユビキノンや電子シャトルに電子を伝達しないことを考慮すると、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの脂質活性化の有用性は明確ではない。この観察の１つの仮説は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘの脂質活性化は、電子受容体としてユビキノン８を利用し、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｘにより類似した祖先のＰｏｘからの痕跡要素であり得ることである。酸素が存在する進化の歴史の期間中に祖先のＰｏｘ酵素が発生した場合、祖先の酵素は、偶然による酸素への伝達ではなく、膜ユビキノンへの電子伝達を確実に行うために脂質活性化された可能性がある。この特徴は、細菌にとって必ずしも不利であるとは限らなかったため、後の過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素でも維持された可能性がある。したがって、酵素の脂質活性化を失う選択圧はほとんどまたはまったくなかったであろう。実際に、過酸化水素を生成するｐｏｘが脂質の活性化を保持することは有利であり得る。

過酸化水素の生成は自己阻害性であり得、生成細胞に損傷を与える可能性がある。過酸化水素を生成するＰｏｘの脂質活性化は、過酸化水素の生成を細胞の周辺点に配置するため、有益であり得る。この点から過酸化水素が拡散することにより、細胞の内部はより少ない過酸化水素にさらされ、酵素が細胞の中央に配置されている場合よりも多く排出される。この場合、Ｐｏｘ酵素の脂質活性化を持続させることにより、過酸化水素生成の自己毒性を減少させ得る。

本明細書に記載されているのは、リン脂質ホスホチジルエタノールアミンによって活性化される最初の過酸化水素生成Ｐｏｘ酵素である。また、他の既知のＰｏｘ酵素とは異なるオリゴマー構造も示されている。まとめて、これらのデータは、異なる細菌種からのＰｏｘ酵素がそれらの構造及び機能が異なり得ることを示している。

材料及び方法
ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸オキシダーゼ酵素またはピルビン酸：酸素２－オキシドレダクターゼ（リン酸化）（ＥＣ１．２．３．３）は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＳＴＹＭ１株に由来した（１６）。

Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘΔ３２の精製
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ欠失変異体は、図２４に記載のプライマーを使用して、ＳＴＹＭ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＦＬＡＧ－ＣＴＣベクター（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にライゲートした。生成物をＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、コンストラクトをＰＣＲ及び配列決定によって確認した。コンストラクトをＬＯＢＳＴＲＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉΔ３２ＰｏｘをＣ末端Ｈｉｓ_６－Ｐｏｘとして発現させた。種培養物を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した４０ｍＬのＬＢに１：１００に希釈し、ＯＤ_６００が０．４～０．８に達するまで３７℃で成長させた。細胞を氷上で１０分間冷却し、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、細胞を２５℃で２０時間振とうしながらインキュベートした。細胞を３２００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離することによって回収し、ＥＤＴＡを含まないｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１ｍＬの２０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７に再懸濁した。細胞を氷上での超音波処理によって溶解し、可溶性細胞溶解物を、１６０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離することにより回収した。可溶性細胞溶解物を０．２２μｍＰＶＤＦフィルタでろ過し、１ｍＬベッド体積のＨｉｓＰｕｒｅＮｉ－ＮＴＡレジン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にアプライした。カラムを２５ｍＭイミダゾールを含む２カラム容量のバッファ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で２回洗浄し、結合したタンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファでカラムから溶出した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって評価した。

ピルビン酸オキシダーゼ活性アッセイ及び速度論的パラメータ
ピルビン酸オキシダーゼ活性は、以前に記載されたとおり測定した（１６）。簡潔に説明すると、５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１５μＭＦＡＤ、３００μＭＴＰＰ、０．０３％Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン（ｓｉｇｍａ）、０．０１５％４－アミノアンチピリン（ｓｉｇｍａ）、及び３３μｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を精製ｐｏｘ酵素と組み合わせた。室温で１０分間インキュベートした後、リン酸ナトリウムｐＨ５．６を５０ｍＭの最終濃度まで添加して反応を開始させた。２５℃でのキノンイミン色素の形成は、５５０ｎｍでの吸光度の増加によって測定し、比活性は記載のとおり算出した。１単位のＰｏｘ活性は、１分あたり１μｍｏｌの過酸化水素の生成として定義され、これは速度論的分析のためにμＭ／分に変換した。

ピルビン酸及びリン酸のｋ_ｍ測定ならびにｋ_ｃａｔの測定には、５０ｍＭ濃度の代わりに基質の希釈液を使用した。酵素濃度は１．７６μＭであった。各基質濃度についてのＶ_０をプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェアのｋｃａｔ非線形回帰関数を使用してデータをフィッティングした。ホスホチジルエタノールアミン（ＰＥ）の存在下でのｋ_ｍ及びｋ_ｃａｔの決定には、ＰＥを７．２ｍＭの濃度で使用し、酵素濃度は１７０ｎＭであった。

リン脂質活性化アッセイ
クロロホルムに溶解したホスホチジルエタノールアミン（１６：０～１８：１）（ＡｖａｎｔｉＬｉｐｉｄｓ）、ホスホチジルコリン（１６：０～１８：１）（ＡｖａｎｔｉＬｉｐｉｄｓ）、及びホスホチジルグリセロール（１６：０～１８：１）（ＡｖａｎｔｉＬｉｐｉｄｓ）をアルゴンガスの定常流下で蒸発させ、真空デシケーターで１時間乾燥させて、残留クロロホルムを蒸発させた。リン脂質を２０ｍＭＢｉｓ－Ｔｒｉｓ１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６に再懸濁し、２２５ｒｐｍで３０分間振とうしながら３７℃でインキュベートした。懸濁液を３０秒間ボルテックスし、各使用の直前にボルテックスした。

リン脂質をピルビン酸オキシダーゼアッセイ混合物に様々な濃度で添加し、酵素活性を上記のとおり測定した。倍数活性は、リン脂質を含まない酵素活性と比較して計算した。

ゲルろ過分析
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを分析する前に、タンパク質標準を混合し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。タンパク質標準は、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ガンマグロブリン（１５０ｋＤａ）、オボアルブミン（４４ｋＤａ）、ミオグロブリン（１７ｋＤａ）、及びビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）であった。各標準のピーク溶出容量及びダルトン単位の分子量のＬｏｇ_１０を使用して、標準曲線をプロットした。８４０μｇの精製Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを、５０ｍＭピルビン酸塩、３００μＭＴＰＰ、及び１５μＭＦＡＤの存在下、室温で１０分間インキュベートした後、カラムにアプライした。溶出中に２８０ｎｍでの吸光度を記録した。１０ｍＬの空隙容量後、溶出が終了するまで１ｍＬの画分を収集した。Ｐｏｘ画分のピーク体積を使用して、標準曲線に従って分子量を計算した。

ゲルろ過からの各画分のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘは、クーマシー染色による非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析後に可視化した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、５％のβ－メルカプトエタノールをサンプルバッファに含めた。

ＰＥ共沈降
ＰＥは、活性化実験のために上記のとおり調製した。３μｇのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉＰｏｘを、５０ｍＭピルビン酸塩、３００μＭＴＰＰ、及び１５μＭＦＡＤと共に、１ｍＭＰＥまたはＰＥ非含有のいずれかと共に室温で３０分間インキュベートした。ＰＥ画分は、１６，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離することにより沈殿させた。上清を可溶性画分として吸引し、ＰＥペレットを等量のバッファに再懸濁した。画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、クーマシー染色によって可視化した。

参考文献
１．ＳｅｄｅｗｉｔｚＢ，ＳｃｈｌｅｉｆｅｒＫＨ，ＧｏｔｚＦ．１９８４．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１６０：２７３－２７８．
２．ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＣＣ，ＨａｇｅｒＬＰ．１９７５．Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｐｉｄ－ｄｅｐｌｅｔｅｄｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｓｙｓｔｅｍｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｗｉｔｈｃｅｌｌｅｎｖｅｌｏｐｅｎｅｕｔｒａｌｌｉｐｉｄｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５０：７１３９－７１４６．
３．ＺｈａｎｇＸ，ＢａｙｌｅｓＫＷ，ＬｕｃａＳ．２０１７．ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣｉｄＣＩｓａＰｙｒｕｖａｔｅ：ＭｅｎａｑｕｉｎｏｎｅＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５６：４８１９－４８２９．
４．ＭｕｌｌｅｒＹＡ，ＳｃｈｕｌｚＧＥ．１９９３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｔｈｉａｍｉｎｅ－ａｎｄｆｌａｖｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｚｙｍｅｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９６５－９６７．
５．Ｒａｍｏｓ‐ＭｏｎｔａｎｅｚＳ，ＴｓｕｉＨ－ＣＴ，ＷａｙｎｅＫＪ，ＭｏｒｒｉｓＪＬ，ＰｅｔｅｒｓＬＥ，ＺｈａｎｇＦ，ＫａｚｍｉｅｒｃｚａｋＫＭ，ＳｈａｍＬ－Ｔ，ＷｉｎｋｌｅｒＭＥ．２００８．ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｐｘＢ（ｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ）ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｂｙａＣＢＳ－ＨｏｔＤｏｇｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ（ＳｐｘＲ）ｉｎｓｅｒｏｔｙｐｅ２Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６７：７２９－７４６．
６．ＬｏｒｑｕｅｔＦ，ＧｏｆｆｉｎＰ，ＭｕｓｃａｒｉｅｌｌｏＬ，ＢａｕｄｒｙＪ－Ｂ，ＬａｄｅｒｏＶ，ＳａｃｃｏＭ，ＫｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍＭ，ＨｏｌｓＰ．２００４．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｏｘＢＧｅｎｅ，ＷｈｉｃｈＥｎｃｏｄｅｓＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅｉｎＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１８６：３７４９－３７５９．
７．ＴａｎｉａｉＨ，ＩｉｄａＫ，ＳｅｋｉＭ，ＳａｉｔｏＭ，ＳｈｉｏｔａＳ，ＮａｋａｙａｍａＨ，ＹｏｓｈｉｄａＳ．２００８．ＣｏｎｃｅｒｔｅｄＡｃｔｉｏｎｏｆＬａｃｔａｔｅＯｘｉｄａｓｅａｎｄＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅｉｎＡｅｒｏｂｉｃＧｒｏｗｔｈｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ＲｏｌｅｏｆＬａｃｔａｔｅａｓａｎＥｎｅｒｇｙＳｏｕｒｃｅ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９０：３５７２－３５７９．
８．ＳｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇＢ，ＣｕｎｄｅｌｌＤＲ，ＳａｎｄｒｏｓＪ，ＰｅａｒｃｅＢＪ，Ｉｄａｎｐａａｎ‐ＨｅｉｋｋｉｌａＩ，ＲｏｓｅｎｏｗＣ，ＭａｓｕｒｅＨＲ．１９９６．Ｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ，ａｓａｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｖｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１９：８０３－８１３．
９．ＫｒｅｔｈＪ，ＺｈａｎｇＹ，ＨｅｒｚｂｅｒｇＭＣ．２００８．ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌＡｎｔａｇｏｎｉｓｍｉｎＯｒａｌＢｉｏｆｉｌｍｓ：ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓａｎｄＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９０：４６３２－４６４０．
１０．ＷａｎｇＡＹ，ＣｈａｎｇＹＹ，ＣｒｏｎａｎＪＥ．１９９１．ＲｏｌｅｏｆｔｈｅｔｅｔｒａｍｅｒｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｉｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｌｉｐｉｄｂｉｎｄｉｎｇ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６：１０９５９－１０９６６．
１１．ＳｃｈｒｅｉｎｅｒＭＥ，ＥｉｋｍａｎｎｓＢＪ．２００５．Ｐｙｒｕｖａｔｅ：ＱｕｉｎｏｎｅＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｆｒｏｍＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ：ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ１８７：８６２－８７１．
１２．ＣｈａｎｇＹ－Ｙ，ＣｒｏｎａｎＪＥ．１９８４．ＡｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｍｕｔａｎｔｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｕｅｔｏａｌｔｅｒｅｄｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ８１：４３４８－４３５２．
１３．ＧｒａｂａｕＣ，ＣｈａｎｇＹＹ，ＣｒｏｎａｎＪＥ．１９８９．ＬｉｐｉｄｂｉｎｄｉｎｇｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｉｓｄｉｓｒｕｐｔｅｄｂｙｓｍａｌｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｇｉｏｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６４：１２５１０－１２５１９．
１４．ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＣＣ，ＨａｇｅｒＬＰ．１９７１．ＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅＰｙｒｕｖａｔｅＯｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩＩＩ．ＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＤＡＳＡＮＡＬＬＯＳＴＥＲＩＣＥＦＦＥＣＴＯＲＦＯＲＴＨＥＥＮＺＹＭＥ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２４６：１５８３－１５８９．
１５．ＮｅｕｍａｎｎＰ，ＷｅｉｄｎｅｒＡ，ＰｅｃｈＡ，ＳｔｕｂｂｓＭＴ，ＴｉｔｔｍａｎｎＫ．２００８．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｍｅｍｂｒａｎｅｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｅｎｚｙｍｅｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ１０５：１７３９０－１７３９５．
１６．ＣｏｒｎａｃｃｈｉｏｎｅＬＰ，ＫｌｅｉｎＢＡ，ＤｕｎｃａｎＭＪ，ＨｕＬＴ．２０１９．ＩｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓｂｙｙｏｇｕｒｔ－ｄｅｒｉｖｅｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｒｅｑｕｉｒｅａｃｔｉｖｅｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＡＥＭ．０１２７１－１９．
１７．ＧｒａｂａｕＣ，ＣｒｏｎａｎＪＥ．１９８６．ＩｎｖｉｖｏｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｑｕｉｒｅｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｐｉｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：３７４８－３７５１．
１８．ＲｉｓｓｅＢ，ＳｔｅｍｐｆｅｒＧ，ＲｕｄｏｌｐｈＲ，ＭｏｌｌｅｒｉｎｇＨ，ＪａｅｎｉｃｋｅＲ．１９９２．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｒｏｍｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｅｎｚｙｍｅｂｉｎｄｉｎｇａｎｄｓｕｂｕｎｉｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１：１６９９－１７０９．
１９．ＢｅｒｔａｇｎｏｌｌｉＢＬ，ＨａｇｅｒＬＰ．１９９１．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｔｈｉａｍｉｎｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６：１０１６８－１０１７３．
２０．ＲｅｃｎｙＭＡ，ＧｒａｂａｕＣ，ＣｒｏｎａｎＪＥ，ＨａｇｅｒＬＰ．１９８５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｌｐｈａ－ｐｅｐｔｉｄｅｒｅｌｅａｓｅｄｕｐｏｎｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６０：１４２８７－１４２９１．
２１．ＶａｎｃｅＪＥ．２０１５．ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＴｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ１６：１－１８．
２２．ＺｈａｎｇＹ－Ｍ，ＲｏｃｋＣＯ．２００８．Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｉｐｉｄｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａ．ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６：２２２－２３３．
２３．ＭａｔｈｅｒＭＷ，ＧｅｎｎｉｓＲＢ．１９８５．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｌｉｐｉｄ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｉｄａｓｅｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６０：１６１４８－１６１５５．

Claims

ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を発現する細菌株を対象に投与することを含む、前記対象の歯周病を治療する方法。
前記細菌株が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである、請求項１に記載の方法。
前記細菌株が、前記ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作される、請求項１または請求項２に記載の方法。
前記細菌株が操作された細菌株である、請求項１に記載の方法。
前記細菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、請求項４に記載の方法。
前記細菌株がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株である、請求項４または請求項５に記載の方法。
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
前記細菌株がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、請求項４または請求項５に記載の方法。
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｕｒｕｍからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子がＬＤＢＮＤ＿１４８７である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記細菌株がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記細菌株が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して一定量の過酸化水素阻害剤を産生し、それによって前記対象の前記歯周病を治療する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記細菌株を前記対象に投与することにより、口腔微生物叢の腸内毒素症が矯正される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物がリン脂質によって活性化される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物がホスホチジルエタノールアミンによって活性化される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子を含む操作された細菌株。
前記細菌株が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、請求項１６に記載の操作された細菌株。
前記細菌株が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株である、請求項１６または請求項１７に記載の操作された細菌株。
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである、請求項１８に記載の操作された細菌株。
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが、ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子産物を過剰発現するように操作されている、請求項１９に記載の操作された細菌株。
前記細菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株である、請求項１６または請求項１７に記載の操作された細菌株。
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓからなる群から選択される、請求項２０に記載の操作された細菌株。
前記細菌株が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、請求項１６または請求項１７に記載の操作された細菌株。
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｕｒｕｍからなる群から選択される、請求項２３に記載の操作された細菌株。
前記ＳＴＹＭ１ｐｏｘ遺伝子がＬＤＢＮＤ＿１４８７である、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の操作された細菌株。
前記細菌株がＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの成長を阻害する、請求項１６～２５のいずれか１項に記載の操作された細菌株。
前記細菌株が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して一定量の過酸化水素阻害剤を産生する、請求項１６～２６のいずれか１項に記載の操作された細菌株。
請求項１６～２７のいずれか１項に記載の操作された細菌株を含む医薬組成物。
対象において歯周病を治療する方法であって、前記方法は、ＳＴＹＭ１ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子産物を発現する操作された細菌株を前記対象に投与することを含み、ここで、前記細菌株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、前記方法。
ＳＴＹＭ１ＬＤＢＮＤ＿１４８７ｐｏｘ遺伝子を含む操作された細菌株であって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株である、前記細菌株。