CN117717569A - 口服组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及口服组合物，特别是用于口腔卫生的组合物，其包含口腔卫生有效量的益生菌，所述益生菌包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株以及选自胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SD5870和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SD5846的菌株，并且其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌LAFTI L10、瑞士乳杆菌R0052或其混合物。

Description

口服组合物

本申请是于2014年7月4日提交的发明名称为“口服组合物”的第201480043888.5号中国专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年7月5日提交的美国临时专利申请USSN 61/843,158的优先权，将所述临时专利申请的全部内容援引加入本文。

技术领域

本发明涉及用于口服给药的益生菌组合物。特别地，本发明涉及具有有益效果(诸如改善健康，特别是口腔健康)的益生菌组合物，以及给药所述组合物的方法。

背景技术

口腔(例如口)为众多且多样的微生物菌群提供保护。当平衡被破坏时以及当在固有细菌中出现不均衡时，可发生病状(例如龋或牙周炎)。益生菌是可向宿主赋予健康益处的活的微生物。益生菌疗法的有益效果部分通过调节与宿主有关的现有微生物菌群，从而获得平衡且健康的微生物-宿主关系来实现。对于口腔，益生菌组合物可有助于恢复平衡的细菌群落，从而改善口腔健康。

龋是通常通过童年期的看护者传播的普遍存在的传染病，其持续整个寿命或直到完全无牙。主要通过抗微生物预防性方法(如刷牙或用牙线洁牙)来管理龋，由于所述方法的抗微生物作用，其大致上是有效的。近期龋病学中的进展使得对于龋形成的更广泛的微生态环境有了更好的理解，这对于将新的基于微生物的预防性治疗策略和技术应用于龋管理提供了机会。

龋中涉及的引发病原性细菌的感染为变异链球菌属细菌，最值得注意的是包封在由蔗糖自生成的不溶性表多糖的生物膜内的变异链球菌(Streptococcus mutans)。该粘附的噬斑提供致病菌成长并由碳水化合物产生多种有机酸(其逐渐溶解牙矿物)的生态位。现在对于龋进展更当代的理解包括微生物环境、生态和环境因素，其中微生物区系生态学上的改变或失衡使龋易于形成。为此，已提议益生菌疗法具有成为调节变异链球菌(S.mutans)和口腔微生物区系的有效手段的潜能(Caglar 2005a；Saha 2012；Tagg2003)，并且已有大量单个菌株用作益生菌潜能的临床研究(2001；Taipale 2012；Keller2011；Stecksén-Blicks 2009；Burton 2013；Caglar 2008；Caglar 2006；Caglar 2005b)。

不同菌株对抗龋的表面上的机制各不相同。例如，一些菌株通过与变异链球菌聚集而具有抗变异链球菌的活性，而其它的通过分泌特异的细菌素来直接杀死或抑制变异链球菌，以及其它的仍移居到噬斑，并与变异链球菌竞争其生态位。因此可能存在结合这些机制的互补性协同效应。再例如，两种益生菌菌株可分泌不同的细菌素，由于所述细菌素在变异链球菌中不同的生物化学靶，其可比其任一本身具有更高的结合变异链球菌杀死效果。

在某些情况中，可通过向组合物中加入益生元来增强益生菌组合物。益生元“饲喂”微生物菌群，以增强有益的细菌亚群；益生菌向微生物菌群的种群添加有益的培养物。术语“合生素”描述包含益生元和益生菌的组合物，例如包含果糖寡糖(FOS)(益生元)和双歧杆菌(益生菌)的组合物。本领域中的研究投入到成分类型之间的协同作用，以获得对于可如何通过互补性益生元成分的存在来增强益生菌的生长和存活的更好的理解。

尽管已知大量的益生菌组合物，但各组合物具有独特的特性和特定的健康益处。在于2012年7月22日提交的共同拥有的美国临时申请USSN 61/674,390中记载了一种对于口腔健康具有益处的益生菌组合物的实例，所述申请公开了包含唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(BLIS/>)和至少五种乳杆菌(Lactobacillus)细菌的益生菌组合。

然而，一直存在对于改善的益生菌组合物制剂的需求，特别是对于导致改善的口腔健康、改善的口腔集群、改善的功效、改善的贮存期、对于不同和特定的口腔疾病的功效以及其它改善中的一种或多种的制剂以及给药或使用其的方法。

发明内容

本发明的一个方面提供用于口腔卫生的组合物，其包含口腔卫生有效量的益生菌，所述益生菌包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株。

本发明的第二方面提供用于口腔卫生的组合物，其包含口腔卫生有效量的益生菌，所述益生菌包含瑞士乳杆菌菌株和胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株。

本发明的第三方面提供用于口腔卫生的组合物，其包含口腔卫生有效量的益生菌，所述益生菌包含瑞士乳杆菌菌株和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SD5846。

本发明的第四方面提供用于治疗或预防龋的组合物，其包含龋预防有效量的益生菌，所述益生菌包含胚芽乳杆菌SD5870。

本发明的第五方面提供用于治疗或预防龋的组合物，其包含龋预防有效量的益生菌，所述益生菌包含长双歧杆菌SD5846。

本发明的第六方面提供上述益生菌用于口腔卫生的用途。

本发明的第七方面提供上述益生菌用于制备用于口腔卫生的药物的用途。

本发明的第八方面提供治疗或预防个体中口腔病况或疾病的方法，其包括向所述个体口服给药上述益生菌。

本发明的第九方面提供市售包装品，其包含上述益生菌及其用于口腔卫生的说明。

所述益生菌包含瑞士乳杆菌菌株，或基本上由其组成。所述益生菌可包含瑞士乳杆菌菌株和一种或多种其它益生细菌，或基本上由其组成，所述一种或多种其它益生细菌优选为乳杆菌、双歧杆菌和/或链球菌属，更优选一种或多种其它乳杆菌，更优选一种其它乳杆菌。所述益生菌可包含瑞士乳杆菌菌株和胚芽乳杆菌菌株(特别是胚芽乳杆菌SD5870，商业上称作胚芽乳杆菌Lp-2001)，或基本上由二者组成。术语“基本上由...组成”表示不存在其它益生细菌，或者其它益生细菌以无关紧要的量存在。所述瑞士乳杆菌菌株优选包括瑞士乳杆菌LAFTI L10、瑞士乳杆菌R0052或其混合物。所述瑞士乳杆菌菌株更优选包括瑞士乳杆菌LAFTI L10。

为了特定地治疗或预防龋，作为另外的选择，所述益生菌可包含胚芽乳杆菌SD5870或长双歧杆菌SD5846。所述益生菌优选包含胚芽乳杆菌SD5870与唾液链球菌M18和唾液链球菌K12中之一或二者的组合。优选地，所述益生菌基本上由胚芽乳杆菌SD5870组成，或者基本上由胚芽乳杆菌SD5870与唾液链球菌M18和唾液链球菌K12中之一或二者组成，使得不存在其它益生细菌，或者其它益生细菌以无关紧要的量存在。

口腔卫生包括预防或治疗口腔的病况或疾病。这样的病况或疾病包括例如龋(蛀牙)、口臭、龈炎、包括口疮性口炎(口疮)的口腔溃疡、念珠菌病和牙周病。在本发明的一个方面中，口腔中的变异链球菌群落被抑制，得到更好的口腔卫生。在一特别优选的实施方案中，龋被预防。可使用本发明的个体包括例如哺乳动物。个体可包括灵长类、人或驯养动物。驯养动物的一些实例为犬、猫和马。

以所述组合物的总重量计，所述组合物可包含约0.0001重量％至约100重量％的益生菌。任选地，所述益生菌可为所述组合物的约0.001重量％至约50重量％，或者约0.001重量％至约10重量％，或者约0.001重量％至约5重量％。所述组合物中益生菌的口腔卫生有效量一些程度上取决于个体的年龄、益生细菌的类型、给药频率、剂型、给药方法和个体的共生口腔微生物区系的变异性。例如，约10⁷至10¹¹个菌落形成单位(CFU)的益生菌剂量通常为适合的；特别是对于锭剂，优选每个锭剂约10⁸至10¹⁰个CFU的益生菌剂量，最优量取决于所述组合物中益生菌的一种或多种菌株以及给药频率(可为每天1个锭剂至4个锭剂)。益生菌的给药可在任意方便的时间进行，例如在刷牙期间或刷牙之后，或者在膳食期间或膳食之后。

组合物包含膳食益生菌，并且可包含本领域通常已知的其它成分，例如一种或多种再矿化剂、益生元、载体、稀释剂、赋形剂等。所述其它成分优选药学上可接受的，或者至少对于口腔中使用可接受的。

变异链球菌通过分泌溶解矿物质钙和磷酸盐来产生腐蚀牙基质的作用。在酸分泌数月后，去矿化会扩展至釉质，并最终扩展至牙本质。尽管在该阶段是可逆的，但进一步的进展会导致龋洞形成，并使牙修复成为必需。唾液具有重要的作用，其不仅作为令人不愉悦的酸的天然缓冲剂，而且是用于牙的再矿化的钙和磷酸盐的来源，这自然地阻滞或者甚至逆转病理。则龋形成是通过致病菌的去矿化与再矿化的动态平衡。干预和预防性治疗经常集中于通过加入用于再矿化效果的药剂来使所述平衡向再矿化倾斜。再矿化剂包括例如酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙(CPP-ACP)、β-磷酸三钙、无定形磷酸钙的纳米颗粒(NACP)、羟基磷灰石(hydroxyapitite)、甘油磷酸钙或者钙与磷酸盐的其它变体。可以所述组合物的1-10wt％，优选1-4wt％的量加入所述再矿化剂。还向许多牙科制品中添加氟化物，因为其是再矿化的有效催化剂，并且其掺入结晶结构，得到比最初的更有抗性的牙表面。值得注意的是，酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙(CPP-ACP)(参见美国专利7,491,694，将其公开内容通过援引加入本文)是特别有效的，因为源自乳蛋白质的结合肽将磷酸钙结合并稳定化为容易被生物利用的溶解的无定形形式。预计防止去矿化的益生菌制剂与再矿化剂(特别是CPP-ACP)的组合在龋的预防性治疗中会具有甚至更高的有效性。

在某些情况中，将益生元包含入组合物中增强了益生菌的有效性。益生元主要起到饲喂微生物菌群的作用。术语“合生素”描述包含益生元和益生菌的组合物。可用于本发明的益生元的一些实例包括例如单糖、二糖和寡糖，诸如甘露糖、果聚糖、果糖寡糖(FOS)、木寡糖(xylooligosaccharide)(XOS)、聚葡萄糖和半乳寡聚糖(GOS)、乳果糖、塔格糖、菊糖、麦芽糖糊精、拉克替醇及其混合物。通常，所使用的益生元的量远大于益生菌的量，例如克量的益生元可用于毫克量的益生菌。

用于口服组合物的载体、稀释剂和赋形剂是本领域通常已知的，并且包括例如吸收剂、酸化剂、碱化剂、粘合剂、缓冲剂、包衣、着色剂、控释剂、控释载体、稀释剂、崩解剂、泡腾剂、调味剂、助流剂、滑润剂、增塑剂、溶解度增强剂、湿润剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、增香剂等。一些具体实例包括乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素(例如微晶纤维素)、水糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或脂质物质(例如硬脂)或者其适合的混合物。

赋形剂的特别优选的种类是代糖，其用作对于血糖水平具有减少的或可忽略的作用的甜味剂。优选地，所述代糖是非生龋的。这样的代糖包括例如糖醇(例如异麦芽酮糖醇(isomalt))、甜叶菊、阿司帕坦、三氯蔗糖(sucralose)、纽甜(neotame)、乙酰氨基磺酸钾和糖精。甜叶菊和异麦芽酮糖醇是特别值得注意的。甜叶菊是基于甜菊醇糖苷，并包含植物甜叶菊(Stevia rebaudiana)的提取物。异麦芽酮糖醇是两种二糖的等摩尔混合物，所述两种二糖各自包含两种糖，葡萄糖和甘露醇((α-D-吡喃葡糖苷基(glucopyranosido)-1,6-甘露醇)，以及葡萄糖和山梨糖醇(α-D-吡喃葡糖苷基-1,6-山梨糖醇)。异麦芽酮糖醇特别地改善了本发明的组合物的稳定性。某些代糖(例如异麦芽酮糖醇)还可被认为是益生元。

可将本发明的组合物向个体以口服剂型口服给药或者以局部剂型给药。适合的剂型包括例如片剂(例如泡腾片剂和/或多层片剂)、丸剂、散剂、锭剂(包括多层锭剂)、药囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊剂、糊剂(例如牙膏)、食品和糖果(例如口香糖)。这样的剂型的配制是本领域公知的。本发明的组合物具有在至少24个月的时间，甚至在至少30个月的时间，于室温(20-25℃)下维持有效CFU数的益生菌菌株的良好的稳定性。在某些储存条件(例如在2-8℃的冷藏条件)下和/或在不同递送系统(例如药囊剂/药筒(powder stick))中，贮存期可延长至超过36个月。

所述组合物可以市售包装品连同所述组合物用于口腔卫生的说明的形式在市场上提供。市售包装品包括例如瓶、罐、塑料定型包装、盒等。可提供例如视觉或音频形式的说明，如在文字中、在图片中，在声音和/或视频记录介质上，或其组合。

会描述本发明的其它特征，或者本发明的其它特征在随后的详细描述期间会变得清楚。

附图说明

为了可使本发明被更清楚地理解，现将其实施方案通过实施例的方式参照随附的附图进行详细描述，在所述附图中：

图1描绘显示细菌涂拭区的培养皿以及如何测定抑制区(ZOI)的示意图。

图2描绘变异链球菌染色体的物种特异性DNA区段的PCR扩增子的1.5％琼脂糖凝胶。模式株变异链球菌25175用作阳性对照。

图3描绘显示益生菌单独以及两种的所有可能的组合对于变异链球菌25175的延迟拮抗作用实验的定量的图。使用用0.1％ CaCO₃平衡pH的BHI琼脂将实验重复至少4次。

图4描绘显示益生菌单独以及两种的所有可能的组合对于新鲜分离的变异链球菌13的延迟拮抗作用实验的定量的图。使用用0.1％ CaCO₃平衡pH的BHI琼脂将实验重复至少4次。

图5描绘显示益生菌单独以及两种的所有可能的组合对于新鲜分离的变异链球菌14的延迟拮抗作用实验的定量的图。使用用0.1％ CaCO₃平衡pH的BHI琼脂将实验重复至少4次。

图6描绘显示益生菌单独以及两种的所有可能的组合对于新鲜分离的变异链球菌15的延迟拮抗作用实验的定量的图。使用用0.1％ CaCO₃平衡pH的BHI琼脂将实验重复至少4次。

图7描绘显示具有抗微生物特性的益生菌菌株的不同组合对于变异链球菌菌株的协同拮抗作用的表格。用来自至少四个单独重复实验的数据通过单向ANOVA对组分菌株单独地进行比较。

图8描绘显示益生菌菌株的过氧化氢的相对产生的比较的表格。+++24小时内，++48小时内，+72小时内，以及-无产生。

图9描绘显示不同益生菌菌株以及变异链球菌菌株对于人支气管上皮细胞系16HBE14o-的粘附的图。

图10描绘显示不同益生菌菌株与变异链球菌25175的聚集比较的图。用Bonferroni事后检验(post hoc test)通过单向ANOVA进行比较。

具体实施方式

在整个说明书中参考属/种名称以及菌株命名。有时，生物体的分类变化，并且可向任意给定的生物体指定不同的名称和/或菌株命名。益生菌生物体在本文中是指无论生物体的名称和/或菌株命名是否改变，其具有某些会保持相同的基因组。由所述基因组，本领域技术人员可以容易地确定任意给定的生物体是否被本说明书涵盖，无论其名称和/或菌株命名是什么。

实施例1：变异链球菌分离和DNA提取

使用无菌探针收集来自4个不同个体的噬斑，并直接涂在轻型唾液链球菌(mitissalivarius)-杆菌肽变异链球菌选择性琼脂，然后在微量需氧条件中，于37℃下孵育48小时。然后将单个菌落分象限划线在BHYE板上，然后再在微量需氧条件中，于37℃下孵育48小时。随后对分离的菌落进行基因分型以确定它们的种类。使用InstaGene Matrix(BioRad)，与制造商的说明类似地进行细菌DNA的提取。简言之，挑选单个菌落，并将其分散在1mL的无菌H₂O中。然后将该混合物在10,000rpm下离心1分钟，并丢弃上清液。向团块加入200μLIntaGene Matrix，将样品快速涡旋，并将其在水浴中于55℃下孵育20分钟。然后将样品移除，并在沸水浴中孵育30分钟。然后将样品再次涡旋，然后在10,000rpm下离心3分钟。收集上清液，并将其在-20℃下储存，直至用于PCR。

所有PCR试剂获自Invitrogen。将提取的DNA样品在包含1X PCR缓冲液、15mMMgCl₂、200mM dNTP混合物、10μM MUT-F引物、10μM MUT-R引物、5U Taq DNA聚合酶、10μLDNA模板和ddH₂O(至多50μL的终体积)的反应混合物中进行PCR。引物扩增编码变异链球菌的gtfB细胞外葡萄糖基转移酶的517-bp DNA区。

MUT-F:5’–ACT ACA CTT TCG GGT GGC TTG G–3’(SEQ ID NO:1)

MUT-R:5’–CAG TAT AAG CGC CAG TTT CAT C–3’(SEQ ID NO:2)

热循环条件为最初在95℃下变性1分钟，随后进行在95℃下变性30秒的30个循环，在59℃下退火30秒，并在72℃下延长1分钟。包括在72℃下持续5分钟的最终延长步骤。然后将PCR产物与DNA加样缓冲液混合，并在1.5％琼脂糖凝胶上用0.05％EtBr在100V下分离45分钟，并在紫外线激发下显像。

实施例2：延迟拮抗作用

为了测试益生菌对于变异链球菌的拮抗作用，基本上按照之前由Tagg和Bannister(Tagg 1979)实施的进行延迟拮抗作用。将液体培养物接种入MRS(对于乳杆菌或双歧杆菌)和BHYE(对于链球菌)，然后在微量需氧条件中，于37℃下过夜孵育。参照图1，然后使用无菌棉签，将过夜悬浮液以量过的1cm宽条线涂拭至含0.1％(w/v)CaCO₃的BHI或CB板上。BHI板包含18.5g脑心浸液(BHI,Difco)、7.5g琼脂(Fisher)和1gCaCO₃(Sigma)。CB板包含22g Columbia血(Difco)、7.5g琼脂(Fisher)和1g CaCO₃(Sigma)。然后将所述板在微量需氧条件中，于37℃下孵育。48小时后，用玻璃载玻片刮去细菌生长，并将板用氯仿蒸汽再灭菌20分钟。然后将模式株变异链球菌ATCC25175和4个新鲜的分离物的过夜悬浮液垂直地穿过划线，并将板再孵育。48小时后计算抑制区(ZOI)(细菌生长的两个区域之间的距离减去直接接种益生菌的1cm)。使用Prism 4(GraphPad)进行统计。使用单向ANOVA来进行特定益生菌和益生菌组合之间的比较。以协同系数(其为单个处理的和除以组合处理)的形式计算协同作用。>1的值表明组合的协同作用(Wang 2012)。

为了测定在龋中具有益生菌潜能的菌株，对许多益生菌的商业化菌株进行变异链球菌拮抗作用筛选。首先，如实施例1中所述，通过将来自4个个体的噬斑样品接种至变异链球菌选择性轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂板上来获得病原体的新鲜分离物。检查菌落基因型是否存在变异链球菌特异性标记序列(将其与模式株变异链球菌ATCC 25175进行对比)(图2)。选择四个分离物(每个个体1个)。

在两种培养基类型上进行针对这些4个分离物和变异链球菌25175的延迟拮抗作用测定，以快速地筛选具有任何拮抗作用的益生菌菌株。表1表明对于这些实验中测定的任意复制物以及5种菌株中的任一种存在或不存在抑制区(ZOI)。观察到菌株唾液链球菌K12、唾液链球菌M18、胚芽乳杆菌SD5870、瑞士乳杆菌R0052以及长双歧杆菌(L.helveticus)SD5846(商业上称作长双岐杆菌Bl-05)在两种琼脂类型上均具有拮抗作用，而瑞士乳杆菌LAFTI L10的拮抗作用仅在BHI琼脂上是明显的。因此，在随后的定量延迟拮抗作用实验中使用BHI琼脂。为了对拮抗作用定量，对于各益生细菌重复实验至少四次，并且多达八个单独实验，并明确地测量抑制区。评估所有益生细菌菌株的等量混合物的所有可能的2者的组合，以测试潜在的协同效应。测量五种致病菌株的ZOI，并在四个实验之间平均。结果在图3至图6中表明。

一般而言，证明与新鲜的分离物相比，变异链球菌的培养物保藏菌株对于由益生菌分泌的拮抗因子具有更大的抗性(图3)。例如在单个益生菌实验中，完全未观察到对于变异链球菌25175的拮抗作用，而对于变异链球菌13，所有6种益生菌(除了长双岐杆菌(B.longum)SD5846)都是拮抗性的。作为单个菌株，瑞士乳杆菌LAFTI L10和瑞士乳杆菌R0052能够拮抗所有四种新鲜分离的变异链球菌，而唾液链球菌(S.salivarius)K12和胚芽乳杆菌(L.plantarum)SD5870拮抗四种中的三种。唾液链球菌M18拮抗四种病原性分离物中的两种，长双歧杆菌SD5846仅拮抗一种，并且在所有情况中，它们的平均ZOI比其它益生菌菌株相对较弱。

表1：基于针对五种变异链球菌菌株的延迟拮抗作用测定的定量观察，存在或不存在ZOI。

在许多情况中，当将两种菌株等量组合时，平均ZOI较大，并且某些细菌似乎比其它组合地更好。例如对于分离的变异链球菌15(图6)，在2种菌株的15种可能的组合中，7种比瑞士乳杆菌R0052(单独益生菌的最大抑制)的ZOI更大。在这7种组合中，六种包含瑞士乳杆菌LAFTI L10或胚芽乳杆菌SD5870。这对于所有病原性菌株被证明是正确的；在抑制变异链球菌分离物13、14、15和17，或者甚至变异链球菌25175的各情况下，4种最大的ZOI总是包含瑞士乳杆菌LAFTI L10或胚芽乳杆菌SD5870的组合。

图7表明平均抑制区(ZOI)，以及计算的拮抗作用的协同。表明通过1-向Anova，与其单独组分菌株相比，对于组合所计算的ZOI的显著性差异。通过将益生菌的组合的ZOI除以单独测量的其组分ZOI的和的协同系数(SQ)表明相对协同作用。黑体表明具有大于50％协同作用(SQ>1.5)的组合。NA表示无拮抗作用，而US表示未确定的协同作用，因为仅以组合的形式观察到拮抗作用。瑞士乳杆菌LAFTI L10与长双歧杆菌SD5846的组合以及胚芽乳杆菌SD5870与瑞士乳杆菌R0052的组合均比其单独的组分更显著地拮抗变异链球菌的菌株。当分别针对变异链球菌菌株25175、13、14、15和17测试时，瑞士乳杆菌LAFTI L10与长双歧杆菌SD5846的组合非常地协同(US、1.8、3.7、2.4和2.2)。胚芽乳杆菌与瑞士乳杆菌R0052也是协同的，分别表现出NA、3.3、1.5、1.8和1.6的SQ。

然而有趣地是，当将各个来自这样的两种协同组合的组分细菌(瑞士乳杆菌LAFTIL10和胚芽乳杆菌SD5870)组合在一起时，这得到特别强的活性以及协同作用。由所有五种变异链球菌菌株的显著的空白所示，这样组合的2种菌株的ZOI是最高地协同的。对于所有变异链球菌菌株，瑞士乳杆菌LAFTI L10和胚芽乳杆菌SD5870的ZOI实际上高于两种菌株单独地加在一起的ZOI，这通过1-向ANOVA证明高度显著的。对于变异链球菌25175，通过任一益生菌菌株，完全没有抑制，但是当将两种菌株组合在一起时，有非常显著的抑制(约20mm)。这强烈地表明了所述益生菌之间的协同活性，并且实际上对于变异链球菌25175、13、14、15和17的菌株，协同系数分别为US、3.4、3.9、4.2和4.2。

实施例3：过氧化氢产生

为了测试过氧化氢产生，应用与Kang等人(Kang 2011)近期所使用相似的通常使用的方法。基本上，通过加入0.25mg/mL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和0.1ng/mL过氧化物酶改变标准琼脂生长培养基(对于乳杆菌或双歧杆菌为MRS，并且对于链球菌为BHYE)。简言之，将0.125g TMB和5mg过氧化物酶分别在1mL二甲基亚砜(DMSO)和水中溶解。将这些溶液使用0.2μm注射器滤器灭菌，并立即加入0.5L液体琼脂培养基，随后高压灭菌后冷却至<50℃。然后注板。从储藏板挑选单个益生菌菌落，并使用接种环直接在TMB/过氧化物酶琼脂和标准琼脂对照板上划线。然后将板在37℃下，于微量需氧条件中放置72小时。通过与标准MRS或BHYE划线对照板对比，每24小时评估菌落以及周围的琼脂颜色向蓝色或红色的任意变化。将实验重复三次。

由于许多乳杆菌产生过氧化氢作为针对周围细菌的拮抗剂，所以测定菌株的过氧化氢产生。证实所测试的11种乳杆菌菌株中的10种产生一些过氧化氢。唾液链球菌不产生，而两种嗜热链球菌以及所有5种双歧杆菌产生不同程度的H₂O₂(图8)。所有被观察到具有变异链球菌拮抗作用的菌株均是最快产生H₂O₂的，观察到其在接种的24小时内如此，除了嗜热链球菌。

实施例4：细胞表面粘附

除非另外说明，细胞培养试剂从GIBCO获得。永生化的人支气管上皮细胞系16HBE14o-在补充有10％ FBS和2mM L-谷氨酰胺的MEM培养基上生长，并使用标准细胞培养操作在37℃和5％ CO₂下维持。将细胞以1x10⁵细胞/孔的浓度接种在组织培养物处理过的24孔板的孔中，并使其生长至融合(约48小时，大约5x 10⁵细胞/孔)。然后将细胞培养基抽出，并用500μL包含多种稳定期细菌细胞悬浮液(其在MRS(乳杆菌和双歧杆菌)或BHYE(链球菌)中过夜生长)的100倍稀释物的新鲜培养基替换。然后将板在37℃和5％ CO₂下孵育。5小时后抽出培养基，并将单层用PBS彻底洗涤三次，以移除非松散粘附的细菌。然后通过加入Triton^TMX-100至0.1％的终浓度来使真核细胞破裂。然后通过滴板法进行溶菌悬浮液中所包含的剩余粘附CFU的计数。在96孔板中以10倍的步骤进行系列稀释，直至10^-6，然后将10μL的不同稀释物一式三份地点到适合的琼脂上(对于乳杆菌和双歧杆菌MRS，并且对于链球菌BHYE)。将琼脂板在37℃下，于微量需氧条件中孵育24小时，之后对CFU进行计数。以总CFU除以孔中如通过16HBE14o-细胞的无细菌对照孔的细胞计数测定的支气管细胞数目的形式报告粘附。

为了递送其功效，细菌必须与口腔内的变异链球菌共定位。为了测试益生细菌在口腔内停留的潜能，进行结合亲和力测定(图9)。所述测定测试细菌与16HBE14o-人支气管上皮细胞(其与口腔上皮细胞有共同的细胞谱系，并且它们在表型上类似)的单层的粘附。将细菌接种在MEM培养基上，并使其生长5小时，然后将游离细菌洗涤掉，并对剩余的破裂的真核细胞和细菌细胞混合物进行CFU计数。发现通常变异链球菌病原体未很好地粘附至细胞，所测试的乳杆菌也没有(图9)。然而相比之下，最初分离自人咽喉的唾液链球菌非常紧密地粘附。

实施例5：与变异链球菌共聚集

将多种益生细菌或者变异链球菌接种在1mL液体MRS(对于乳杆菌或双歧杆菌)或BHYE(对于链球菌)，然后在37℃下，于微量需氧条件中过夜孵育。然后将管在2000rpm下离心5分钟，并抽出上清液，然后在1mL PBS中再悬浮。将该步骤重复3次。然后将悬浮的细胞在100μL PBS中以2倍系列稀释步骤于96孔板中系列稀释，直至128倍。使用EON酶标仪(BioTek)读取板在600nm下的吸光度。由所得的数据，建立吸光度相对于稀释的曲线，并且对于所测试的各个细菌，外推0.3的吸光度下的稀释。根据所述外推，将包含200μL的悬浮的细菌的一式三份的孔在96孔板中直接稀释。对于各个细菌，还加入100μL的同一稀释物连同100μL稀释的变异链球菌。通过用多通道吸液管将孔上下吸液，使混合物均匀地分散。然后将板用无菌澄清塑料薄膜密封，然后立即在酶标仪中连同PBS空白于37℃下孵育。6小时后在600nm下读孔。

还通过聚集测定来评估菌株与变异链球菌的直接粘附和相互作用的潜能(图10)。测定单个菌株以及与变异链球菌的等份混合物在37℃下孵育时，于600nm下的吸光度变化。升高的吸光度表明当与任一单独的菌株相比，由于聚集更快的沉降。实验表明在无生物膜下，变异链球菌不会自动聚集。然而，与任一单独的细菌相比，加入瑞士乳杆菌(LAFTI L10或R0052)的任一菌株导致吸光度的显著增加。

实施例6：体外效果的讨论

在此已表明细菌的特定菌株的独特性质具有改变口腔微生物区系环境的潜能，以改善口腔健康并减少导致龋的变异链球菌。该结论通过以下具体的发现支持：与所有所测试的菌株(包括唾液链球菌M18和鼠李糖乳杆菌GG，其均为在龋的治疗中良好确认)相比，物种瑞士乳杆菌的菌株(LAFTI L10和R0052)更好地抑制病原体变异链球菌。

其次，菌株胚芽乳杆菌SD5870和瑞士乳杆菌LAFTI L10之间具有实质性的和显著的协同作用，这在于它们抑制新鲜分离的变异链球菌的5种菌株以及非常致病性的变异链球菌菌株的组合能力。在体外瑞士乳杆菌LAFTI L10和变异链球菌的共聚集进一步强调了它在口腔内定位和递送其效果的强大潜能。最后，当在龋的体外模型中组合时，表明所述益生菌组合具有协同减少变异链球菌的潜能。该发现是预料不到的，因为我们之前已经观察两种或更多种不同的益生菌的组合通常导致比单独的益生菌中的任意一种更差的抑制。组合可通常导致更差的抑制是由于组合中的不同益生菌可能相互竞争以及相互抑制。与单独益生菌相比维持在同一水平的抑制甚至是预料不到的，更不要说发现益生菌组合间的协同作用了。

已可靠地表明数种细菌菌株通过不同机制影响龋病原体。值得注意的是，表明唾液链球菌M18在体外和临床研究中具有抗变异链球菌的活性。也有相当多的临床研究兴趣表明在短期和长期研究中益生菌鼠李糖乳杆菌GG具有抗龋效果。在本发明中表明数种益生细菌菌株在它们的变异链球菌拮抗作用上超出这些益生菌。尽管使用鼠李糖乳杆菌GG没有观察到变异链球菌菌株的拮抗作用，使用唾液链球菌M18观察到相当大的拮抗作用。然而值得注意的是，观察到与唾液链球菌M18相比，对于至少一种变异链球菌的菌株，数种所测试的益生菌菌株(包括胚芽乳杆菌SD5870和长双歧杆菌SD5846以及相关的菌株唾液链球菌K12)均具有更强的拮抗作用，而所研究的两种瑞士乳杆菌菌株(LAFTI L10和R0052)实际上对于所有的测试菌株具有更强或相等的拮抗作用。

最感兴趣的是当将菌株瑞士乳杆菌LAFTI L10与胚芽乳杆菌SD5870组合时，观察到对于所测试的所有五种病原体强的抗变异链球菌协同作用。对于该组合所观察到的拮抗作用比所测试的任何其它单独的益生菌菌株或组合更强，并且对于所有五种变异链球菌菌株，在拮抗作用上，其比两种单独的益生菌加在一起更有效至少3倍。

尽管不知道所述协同作用是基于何种代谢机制，但已知瑞士乳杆菌的一些菌株分泌细菌素，如瑞士乳杆菌素(helveticin)J和瑞士乳杆菌素V-1829，并且同样地胚芽乳杆菌的菌株具有多种细菌素以及在pln基因座编码的其它抗菌物质，它的分泌物由群感(quorum)机制调节。尽管不知道胚芽乳杆菌SD5870是否表达任何抗菌因子，但认为它们的表达(尽管多样)在胚芽乳杆菌菌株中是相对常见的。拮抗变异链球菌的抗菌肽当由两种益生菌分泌时在互补致死的组合中可特别有效。

有趣的是4种具有变异链球菌拮抗作用的非链球菌菌株都在最强的H₂O₂生产者之中。然而唾液链球菌K12和M18可通过分泌特定细菌素来发挥抗变异链球菌活性，似乎胚芽乳杆菌SD5870和瑞士乳杆菌LAFTI L10至少部分通过分泌H₂O₂来发挥抗变异链球菌活性。报道变异链球菌能够产生和降解过氧化氢，但虽然如此也容易受到其影响(推测在阈浓度)。在体内定位在变异链球菌周围的过氧化氢的水平可通过对于瑞士乳杆菌LAFTI L10与变异链球菌所观察到的直接聚集来进一步提高，并从而起附加因子的作用，通过其实现高度的拮抗作用。

本文的发现支持以下结论：瑞士乳杆菌针对变异链球菌具有显著拮抗作用，进一步地，瑞士乳杆菌LAFTI L10和胚芽乳杆菌SD5870的特定组合协同作用，以在口腔健康的体外模型中拮抗并抑制变异链球菌的生长。这些发现对于龋的基于微生物的治疗策略具有重要影响。

实施例7：体内效果

可如下测定体内效果。用每组30-40名个体进行随机的、双盲的、安慰剂对照的临床试验。将个体刷牙后用益生菌锭剂中的等剂量的最少十亿CFU的瑞士乳杆菌LAFTI l10和胚芽乳杆菌SD5870进行每日两次治疗，持续28-30天的时间。如使用高敏感度频-域红外线光热辐射度测量和调制发光测定，可预期在龋前去矿化表面积的检测中降低>20％。还预期变异链球菌和噬斑水平的降低。

预期加入酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙(CPP-ACP)或其它再矿化剂会表现如下显著的体内效果。用每组30-40名个体进行随机的、双盲的、安慰剂对照的临床试验。所述研究会包括如下4组：第一治疗组，其中用等计量的最少十亿CFU的瑞士乳杆菌LAFTI l10和胚芽乳杆菌SD5870治疗个体；第二治疗组，其中用十亿CFU的瑞士乳杆菌LAFTI l10和胚芽乳杆菌SD5870的组合以及有效剂量的CPP-ACP或其它再矿化剂治疗个体；第三治疗组，其中用有效剂量的CPP-ACP或其它再矿化剂治疗个体；以及第四治疗组，其中用安慰剂对照治疗个体。所述研究会在刷牙后用益生菌锭剂以每天两次剂量持续28-30天的时间。如使用高敏感度频-域红外线光热辐射度测量和调制发光测定，可预期在龋前去矿化表面积的检测中降低>20％。还预期变异链球菌和噬斑水平的降低。

实施例8-锭剂制剂和稳定性

根据表2配制7/16英寸圆形锭剂。

表2

将锭剂的密封包装在室温(20-25℃)下，于60-65％的环境湿度下储存。根据工业标准选择性涂布培养法，在给定的时间点培养来自锭剂的细菌。因此，将锭剂在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解，系列稀释，并一式三份地种板至对于唾液链球菌(CABK12)的选择性琼脂和乳酸杆菌(Rogosa)琼脂板。在37℃下，于微量需氧条件中孵育48小时后，进行CFU计数。甚至在27个月后，仍然有大量活的益生菌菌株(至少约4x10⁸ CFU/锭剂)。具有大量和足量数目的活细菌以递送益生菌健康益处。

实施例9-现有技术产品的延迟拮抗作用

用上述延迟拮抗作用测定法测试市售可得益生菌产品。表3提供各产品的益生细菌组分。

表3

简言之，在37℃，于无菌条件下，将各产品的一个锭剂在5mL 1X PBS中通过摇动溶解，持续2小时。然后，在棉签的帮助下，在BHI和补充有CaCO₃的BHI琼脂板的直径上，将溶液在1cm宽的线内涂布。将这些板在37℃下，于微量需氧条件中孵育48h，然后移除生长的细菌，并将琼脂灭菌。之后，将变异链球菌的5种不同菌株(ATCC菌株和Integra分离物13、14、15和17)涂拭在板上(与益生菌线垂直)，并使其生长另外48h。将该操作重复两次，它们中的各个对于各条件使用一式三份。与本发明的组合物不同，对于所测试的市售可得益生菌产品在各条件的六个复制物中，未观察到生长抑制。

还应注意如实施例8中所描述，在将本发明的锭剂储存27个月后益生细菌计数为约4x10⁸ CFU/锭剂，与所测试的现有技术产品相比是非常有利的，并且大大优于超过一半的所测试的现有技术产品。

参考文献：将各参考文献的全部内容通过援引加入。

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在检查本发明的详细描述后，本发明的新特征对于本领域技术人员会是明显的。然而，应理解权利要求书的范围不应由实施例中所说明的优选实施方案所限制，而应给予与说明书整体相一致的最宽泛的解释。

Claims (36)

1.用于口腔卫生的组合物，其包含口腔卫生有效量的益生菌，所述益生菌包含瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株以及一种或多种选自胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SD5870和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SD5846的菌株，并且其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌LAFTI L10、瑞士乳杆菌R0052或其混合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述益生菌还包含一种或多种选自乳杆菌和双歧杆菌中的菌株。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述益生菌基本上由所述瑞士乳杆菌菌株和胚芽乳杆菌SD5870组成。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌LAFTI L10。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌R0052。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述益生菌基本上由所述瑞士乳杆菌菌株和长双歧杆菌SD5846组成。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌LAFTI L10。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌R0052。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其还包含再矿化剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述再矿化剂包含酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其还包含益生元。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其被配制为片剂、丸剂、散剂、锭剂、药囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊剂、糊剂、食品或糖果。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其被配制为牙膏、口香糖或泡腾片剂。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述用于口腔卫生包括预防或治疗龋、口臭、龈炎、口腔溃疡、口疮性口炎、念珠菌病和/或牙周病。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述用于口腔卫生是治疗或预防龋。

16.用于治疗或预防龋的组合物，其包含龋预防有效量的益生菌，其中所述益生菌包含胚芽乳杆菌SD5870。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述益生菌还包含唾液链球菌(Streptococcus salivarius)。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的组合物，其中所述益生菌还包含唾液链球菌M18。

19.权利要求16-18中任一项所述的组合物，其中所述益生菌还包含唾液链球菌K12。

20.根据权利要求16-18中任一项所述的组合物，其中所述益生菌基本上由胚芽乳杆菌SD5870和唾液链球菌M18组成。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述益生菌还包含长双歧杆菌SD5846。

22.根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含再矿化剂。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述再矿化剂包含酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙。

24.根据权利要求16-23中任一项所述的组合物，其还包含益生元。

25.根据权利要求16-24中任一项所述的组合物，其被配制为片剂、丸剂、散剂、锭剂、药囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊剂、糊剂、食品或糖果。

26.根据权利要求16-24中任一项所述的组合物，其被配制为牙膏、口香糖或泡腾片剂。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物在制备用于口腔卫生的药物中的用途，包括向有需要的个体施用有效量的所述组合物。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述个体为人、犬、猫或马。

29.组合物在制备用于治疗或预防个体之龋的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的益生菌，其中所述益生菌包含瑞士乳杆菌菌株，并且其中所述瑞士乳杆菌菌株为瑞士乳杆菌LAFTI L10、瑞士乳杆菌R0052或其混合物。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述益生菌还包含胚芽乳杆菌SD5870。

31.根据权利要求29-30中任一项所述的用途，其中所述益生菌还包含一种或多种选自唾液链球菌和长双歧杆菌SD5846的菌株。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含益生元。

33.根据权利要求29-32中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含再矿化剂。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述再矿化剂包含酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙。

35.根据权利要求29-34中任一项所述的用途，其中所述组合物被配制为片剂、丸剂、散剂、锭剂、药囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊剂、糊剂、食品或糖果。

36.根据权利要求29-34中任一项所述的用途，其中所述组合物被配制为牙膏、口香糖或泡腾片剂。