RO121005B1

RO121005B1 - Încorporarea de bacterii lactice, exogene, în microflora bucală

Info

Publication number: RO121005B1
Application number: ROA200100152A
Authority: RO
Inventors: Jean-Richard Neeser; Bernhard Guggenheim; Elena Maria Comelli; Francesca Stingele; Pier Sandro Cocconcelli
Original assignee: Societe Des Produits Nestle S.A
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-07-26
Publication date: 2006-11-30
Also published as: US20050238590A1; CA2337082C; TW552142B; AU5415999A; TR200100406T2; BG105188A; US20020012637A1; PL345890A1; CN1240372C; HUP0103229A3; NZ509722A; ES2363201T3; JP2002522464A; WO2000009080A1; IL140641A; EP1104281A1; BR9912946A; IN2001CH00156A; AR020169A1; HUP0103229A2

Abstract

Invenţia se referă la utilizarea de bacterii lactice care nu aparţin microflorei rezidente în gură, care sunt slab acidifiante şi capabile să adere la pelicula de smalţ a dinţilor, în scopul profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare şi al infecţiei periodontale,precum şi la o compoziţie pentru sănătatea gurii, ce conţine un amestec de bacterii lactice.

Description

Orice persoană interesată are dreptul să formuleze în scris și motivat, la OSIM, o cerere de revocare a hotărârii de acordare a brevetului de invenție, în termen de 6 luni de ia publicarea mențiunii acesteia

RO 121005 Β1

Prezenta invenție se referă la utilizarea de bacterii lactice în microflora bucală, în scopul profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecției periodontale, precum și la o compoziție pentru sănătatea gurii, ce conține un amestec de bacterii lactice exogene.

Cavitatea bucală (gura) conține o microfloră proprie și una străină. Prima include microorganisme, care sunt capabile să stabilească o rezidență, mai mult sau mai puțin permanentă, pe suprafața gurii. Aceste bacterii sunt localizate în principal pe limbă, pe mucoasa bucală și pe dinți, în timp ce gingiile, buzele, obrajii, cerul gurii și fundul gurii susțin doar o microfloră foarte răzleață.

Pe limbă și pe mucoasa bucală, microflora naturală proprie include microorganisme selectate dintre: Streptococcus, Veillonella, Bacteroidesșî Haemophilus. Pe dinți, predomină Streptococci, Lactobacilli și Actynomyces, dar se poate găsi și o varietate de coci și bacili Gram pozitivi și Gram negativi.

Spre exemplu, Frandsen și col. au arătat că S. sanguis predomină pe mucoasa bucală, dar principalul său habitat este suprafața dinților, că S. gordonii crește în placa supragingivală matură, că S. oralis și S. mitis cresc în placa dentară inițială (Oral Microbiol. Immunol., 6,129-133,1991). Pe dinți, sunt localizate tulpini aparținând grupului mutans (S. criscetus, S. downei, S. ferus, S. macacae, S. mutans, S. rattus, S. sobrinus). Tulpini aparținând grupului S. milleri, predomină în abcesele dentare (S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius: Bentley et al., Int. J. System. Bacter. 1991, 41, 487-494; Wood et al., The Genera ofLacticAcid Bacteria, Blackie Academic and Professional, Chapman & Hali, W. H. eds., 1995).

Multe dintre aceste microorganisme sunt comensali inofensivi, dar o mulțime dintre acestea au fost recunoscute ca agenți etiologici pentru unele boli (Hill, M. J. and Marsh, P.

D. eds. Human Microbial Ecology, 1990, CRC Press, Boca Raton Florida, USA).

Placa dentară este un film care se formează pe suprafața dinților, constând din celule bacteriene într-o matrice de polizaharide extracelulare și produși salivari. Imediat după erupție, dinții sunt acoperiți cu un strat amorf de salivă - pelicula de smalț dobândită (AEP = acquired enamel pellicle), care are o grosime de aproximativ 1,3 pm și nu poate fi îndepărtată prin perierea normală a dinților. Depunerea bacteriilor pe dinți are loc imediat după formarea AEP, iar placa devine evidentă în 8...12 h, ca o structură multistratificată. Primul strat constă din bacterii (cei mai timpurii coloniști), care se atașează de dinți, în principal, prin recunoașterea specifică a receptorului pentru adezină; acesta formează un substrat pentru coloniștii secundari, care aderă unul la altul, prin legarea specifică analoagă, sau prin simpla juxtapunere. Coeziunea plăcii este garantată, în esență, prin trei mecanisme: prezența unei pelicule salivare pe stratul extern de bacterii, coagregarea specifică între diferite specii bacteriene și glucanii sintetizați de către bacterii și care rămân închiși în matricea plăcii (Skopeketa\.,Oral Microbiol. Immunol., 9,19-24,1994; Kolenbranderetal., Meth. Enzymol., 253, 385-397, 1995; Hiroi et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 193-198, 1992; Gibbons et al., Infect Immun., 52, 555-561, 1986).

Acizii organici, produși de către bacteriile orale (din cavitatea bucală), în timpul procesului de fermentație, cauzează, în mod direct, cariile dentare. Acești acizi atacă țesutul dur al dinților, cu eliberarea ulterioară de ioni, cum arfi: calciu, fosfat, carbonat, magneziu, fluorură, sodiu. Atunci când pH-ul din cavitatea bucală crește iar în jur de neutralitate, saliva se saturează cu calciu și, în consecință, este prevenită eliberarea sa din dinte.

Dintre toate resturile alimentare care se întâlnesc în gură, carbohidrații manifestă cel mai ridicat efect de inițiere a cariilor, fiind direct accesibili pentru fermentația de către bacteriile orale.

RO 121005 Β1

Potențial, toate microorganismele care fermentează zaharuri, sunt cariogene (produ- 1 cătoare de carii), dar agenții etiologici primari ai cariilor de coroană și de rădăcină sunt Streptococii mutans, deoarece aceștia sunt puternici producători de acizi; pot fi, de 3 asemenea, implicați și lactobacilii, care sunt acidurici puternici. La oameni, S. mutans și S. sobrinus sunt tulpinile cele mai cariogene și trăiesc pe dinți, necolonizând întreaga dentiție. 5 A fost demonstrată, într-adevăr, o scădere a numărului lor, de la molari spre dinții anteriori (Lindquist et al., Dent. Res., 69., 1160-1166, 1990). în plus, în placa contiguă umană, S. 7 mutans și S. sobrinus colonizează în mod preferențial cel mai apical situs predispus la carie spre zona de contact (Ahmady et al., Caries Res., 27, 135-139, 1993). O prevalență mai 9 mare a lui S. sobrinus a fost găsită, de asemenea, în regiunile molarilor, comparativ cu cea a lui S. mutans (Lindquist et al., Caries Res., 25., 146-152, 1991). 11

S-a constatat că S. mutans și S. sobrinus se atașează de pelicula de smalț a dinților, în principal, prin receptorul specific pentru adezină. Gibbons et al. au arătat că S. mutans 13 poartă o adezină care se leagă de componentele salivare din peliculă, în timp ce celulele de

S. sobrinus par să posede o adezină care se leagă de glucanii din peliculă (Infect. Immun., 15 52,555-561, 1986).

Microflora tranzitorie cuprinde bacterii exogene care pot fi prezente în mod ocazional 17 în gură, dar care nu stabilesc o rezidență permanentă (chiar dacă se efectuează administrări orale repetate ale acestor bacterii). Toate bacteriile alimentare și, în particular, bacteriile 19 lactice, pot face parte din această microfloră ocazională. Nu s-a arătat niciodată că aceste bacterii lactice exogene ar fi capabile să adere direct la pelicula dinților. Administrarea repe- 21 tată de bacterii lactice exogene poate conduce la colonizarea gurii pe toate suprafețele orale, cum ar fi limba, mucoasa bucală, gingiile, buzele, obrajii, cerul gurii, fundul gurii și dinții. 23 Această colonizare poate rezulta din atașări via legări specifice de bacteriile din microflora rezidentă (fenomene de co-agregare), sau via închiderea în matrice, a polizaharidelor 25 produse de către bacteriile rezidente, sau via aderarea la proteinele salivare (în special, glicoproteine). 27

S-a raportat că Lactobacillus casei rhamnosus GG (ATCC53103) colonizează gura, cel mai probabil pe epiteliul mucoasei bucale. Această tulpină aderă, de asemenea, la 29 epiteliul tractului intestinal (US 5032399, Gorbach ef al.; Micr. Ecol. in Health and Dis., 7, 295-298,1994). Spre deosebire de aceasta, L. rhamnosus nu aderă de dinți. 31

Brevetul JP 4021633 (Cyconmedix KK) a raportat, de asemenea, colonizarea gurii de către Lactobacillus acidophilus, cel mai probabil pe epiteliul mucoasei bucale. Mulți 33 Lactobacillus acidophilus sunt cunoscuți că aderă, de asemenea, la epiteliul tractului intestinal (EP 577904,199535; Perdigon etal., Medicina, 46,751-754,1986; Perdigonetal., 35 Immunology, 63, 17-23, 1988).

Bacteriile exogene pot produce și factori care inhibă creșterea microflorei rezidente 37 din gură. Spre exemplu, EP 759469 (Societe des Produits Nestle) a descris utilizarea unei bacteriocine produse de Micrococcus varians, pentru inhibarea dezvoltării patogenilor orali 39

S. sobrinus, S. sanguis, S. mutans și A. viscosus.

Au fost utilizate câteva strategii pentru reducerea dezvoltării microflorei rezidente din 41 gură, și anume o administrare de bacterii comensale cu microflora rezidentă, care nu sunt cariogene, cum ar fi Streptococcus mutans (JP 59220191) sau Streptococcus salivarius (JP 43 05004927) și/sau Stomatococcus mucilaginosus și/sau administrări repetate de bacterii lactice exogene, cum ar fi L. casei, L fermentum, L acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. 45 salivarius, L. bulgaricus și S. salivarius (Tanzer et al., Infec. and Immunity, 48,44-50,1985;

WO 92/14475; EP 0524732). 47

RO 121005 Β1

Aplicarea de bacteriocine este, de asemenea, una dintre strategiile investigate, care au fost puse la punct pentru reducerea cariilor dentare. Aceste molecule au atras interesul ca posibili agenți anticarie și ca factori importanți în modularea colonizării cavității bucale. Potențialul anticarie al aplicărilor anumitor bacteriocine provine din puternica și vasta lor activitate antibacteriană împotriva streptococilor mutans și a bacteriilor asociate cu placa dentară și a răspândirii lor naturale în bacterii considerate ca sigure pentru om (brevetul US 5368845 al lui Colgate și brevetul WO 94/12150 al lui Smithkline Beecham).

Aplicarea derivaților din lapte prezintă, de asemenea, interes pentru sănătatea gurii, într-adevăr, US 5427769 (Nestec S.A.) descrie o altă alternativă, prin care cariile dentare sunt prevenite prin punerea dințilorîn contact cu o compoziție comestibilă conținând caseină micelară, în cantitate suficientă pentru a inhiba colonizarea cu Streptococcus sobrinus. EP 748591 (Societe des Produits Nestle S.A.) raportează, de asemenea, utilizarea cazeinei micelare fluorurate sau a subunităților sale micelare pentru tratarea cariilor sau a plăcii dentare. US 4992420 (Nestec S.A.) descrie tratamentul cavității bucale cu kappa-cazeinoglicomacropeptidă derivată din lapte, pentru eradicarea plăcii și a cariilor dentare.

Bacteriile lactice care nu fac parte din microflora rezidentă a gurii, nu s-au dovedit niciodată capabile în mod real să adere direct la pelicula dinților. Astfel, prin colonizarea suprafeței dinților, asemenea bacterii lactice ar exercita o activitate inhibitoare împotriva creșterii microflorei rezidente, inclusiv a patogenilor orali.

Obiectul prezentei invenții este de a asigura utilizarea de bacterii lactice, care nu fac parte din microflora rezidentă a gurii, care sunt slab acidifiante și care sunt capabile să adere direct la pelicula de smalț a dinților, pentru prepararea unei compoziții destinate profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecției periodontale.

Bacteriile lactice au fost modificate genetic, în scopul creșterii aderenței lor la pelicula de smalț a dinților via factori de aderare și/sau modificate genetic, pentru a fi chiar mai puțin acidifiante, contribuind la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7.

Invenția se referă la utilizarea unei bacterii lactice capabilă de a disloca patogenii dinților sau de a preveni atașarea lor, în care numita bacterie lactică:

a) nu aparține microflorei rezidente în gură, și

b) când se administrează, contribuie la un pH în cavitatea bucală de aproximativ

5,5...7, și

c) este capabilă să adere direct la pelicula de smalț a dinților, adică având un procentaj de aderență la particule de hidroxiapatită acoperite cu salivă, de cel puțin 1,96, după aderența lor timp de 45 min, la 37°C, pentru prepararea unei compoziții destinate profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și a infecțiilor periodontale.

Bacteriile lactice pot fi selecționate din grupul constând din:

- o bacterie lactică, acidifiantă, care aderă la pelicula dinților și care a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă;

- o bacterie lactică, nonaderentă, care este slab acidifiantă și care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula dinților;

- o bacterie lactică acidifiantă, nonaderentă, care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula dinților și a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă, contribuind la un pH în cavitatea bucală de aproximativ 5,5...7.

Un alt obiect al prezentei invenții este acela de a furniza o compoziție pentru sănătatea gurii, compoziție conținând o bacterie lactică, care nu face parte din microflora rezidentă, care este slab acidifiantă și este capabilă să adere direct la pelicula de smalț a dinților.

RO 121005 Β1 într-o exemplificare preferată, compoziția pentru sănătatea gurii conține cel puțin o1 tulpină de bacterie lactică, selecționată din grupul alcătuit din tulpinile: CNCM1-1984, CNCM 1-1985, speciile de Lactococcus lactis, care nu aparțin microflorei rezidente în gură, și când3 se administrează, contribuie la un pH în cavitatea bucală, de 5,5...7 și este capabilă să adere direct la pelicula de smalț a dinților.5

Compoziția pentru sănătatea gurii poate conține cel puțin o bacterie lactică, care a fost modificată genetic, în scopul creșterii aderenței sale la pelicula de smalț a dinților via 7 factori de aderare și/sau modificată genetic, în sensul de a fi chiar mai puțin acidifiantă și de a contribui la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7. 9

Compoziția pentru sănătatea gurii poate conține bacterii lactice, selectate din grupul alcătuit din:11

- o bacterie lactică, acidifiantă, care aderă la pelicula dinților și care a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă;13

- o bacterie lactică, nonaderentă, care este slab acidifiantă și care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula dinților;15

- o bacterie lactică, acidifiantă, nonaderentă, care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula dinților și a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă;17 în cadrul descrierii care urmează, gura definește cavitatea bucală a omului sau a animalelor (cum arfi cele de companie), compusă din mucoasele bucale (gingii, buze, obraji, 19 cerul gurii și fundul gurii), limba și dinții (inclusiv structurile artificiale).

Microflora rezidentă în gură include toate microorganismele care trăiesc în mod 21 natural în gură, deoarece acestea pot stabili o rezidență permanentă pe suprafețele bucale. Microflora rezidentă în gură include, de asemenea, bacterii care trăiesc în regiunea inter- 23 facială, între țesutul dur și cel moale al dintelui (joncțiunea dinte-gingie), considerându-se că fisurile gingivale și sacul periodontal nu sunt prezente într-o gură sănătoasă. Această 25 microfloră include microorganisme selecționate dintre: Streptococcus, Staphilococcus, Enterococcus, Micrococcus, Peptostreptococcus, Peptococcus, Lactobacillus, 27 Corynebacterium, Actinomyces, Arachnia, Rothia, Alcaligenes, Eubacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Clostridium, Neisseria/Branhamella, Veillonella, 29 Enterobacteriaceae, Campylobacter, Eikenella, Actinobacillus, Capnocytophga, Haemophilus, Simonsiella, Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, 31 Leptotrichia, Wolinella/Selenomonas, Mycoplasma, Candida, Spirochaetes, Protozoa.

Microflora ocazională cuprinde bacterii exogene care pot fi prezente în mod întâm- 33 plător în gură, dar care nu stabilesc o rezidență permanentă. Această microfloră tranzitorie poate cuprinde toate microorganismele din alimente, cum ar fi: bifidobacteriile (B. infantis, 35 B. adolescentis, B. breve și B. longum); lactococii (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris și Lactococcus lactis subsp. lactic biovar diacetylactis); 37 streptococii (Streptococcus thermophilus, S. lactis, S. lactis cremoris și S. lactis diacetylactis)·, lactobacilii (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus 39 helveticus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus, 41 Lactobacillus fermentum și grupul acidofil cuprinzând: L.johnsonii; a se vedea, Fujisawa et al., Int. J. Syst. Bact., 42, 487-491, 1992); pediococii (Pediococcus pentosaceus, 43 PediococcusacidilacticișiPediococcushalophilus);enterococii;stafi\ococu(Staphylococcus xylosus și Staphylococcus carnosus); micrococii (Micrococcus varians); drojdiile din genurile 45 Debaromyces, Candida, Pichia, Torulopsis și Saccharomyces; și ciupercile din genurile Aspergillus, Rhizopus, Mucor și Penicillium. 47

RO 121005 Β1 în ceea ce privește primul obiect al prezentei invenții - utilizarea bacteriilor lactice care nu fac parte din microflora rezidentă din gură, care sunt slab acidifiante și capabile să adere direct la pelicula dinților - s-a manifestat interesul pentru prepararea unei compoziții destinate profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecției periodontale.

Bacteriile lactice, conform cu prezenta invenție, sunt slab acidifiante și capabile să adere direct la pelicula dinților, așa încât compozițiile preparate cu aceste bacterii lactice să fie destinate deplasării patogenilor de pe dinți sau prevenirii atașării lor. Bacteriile lactice, conform prezentei invenții, sunt slab acidifiante, ceea ce înseamnă că sunt mai puțin acidifiante decât tulpinile patogene. în consecință, acestea contribuie la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7. Acestea sunt, de preferință, de origine lactată.

Bacteriile lactice, conforme prezentei invenții, aderă la pelicula dinților, prin interacții specifice sau nespecifice și/sau prin factori de aderare. Factorii de aderare specifici sunt proteine sau polizaharide.

Cel puțin o bacterie lactică este selecționată din grupul alcătuit din: Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis și Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis și, în particular, din grupul constituit din tulpinile: CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 și LMG P-18997.

Aceste tulpini au fost selecționate dintre tulpinile de bacterii lactice, pentru capacitatea lor de aderare la pelicula dinților, temperatura lor optimă de creștere fiind de aproximativ 37°C, care este temperatura din cavitatea bucală. în plus, acestea sunt capabile să fermenteze glucoza și sucroza și nu sintetizează glucani - care sunt factorii de patogenitate ai tulpinilor cariogene.

în conformitate cu un alt obiect al prezentei invenții, se ia în considerare modificarea genetică a bacteriilor lactice, așa încât să adere la pelicula de smalț a dinților, prin intermediul unor factori de aderare. Pentru bacteriile lactice care deja aderă la pelicula de smalț a dinților, această modificare intenționează să facă tulpinile mai aderente la suprafața dinților. în același mod, orice bacterie lactică nonaderentă (nu lactobacili) poate fi modificată genetic, așa încât să adere la pelicula de smalț a dinților.

Această modificare a bacteriilor lactice poate fi realizată prin inserarea genelor X17390, X14490 sau X53657 (numere de acces în Banca de gene), spre exemplu. Aceste gene sunt responsabile în S. mutans, de exprimarea Antigenului l/ll care mediază aderarea la glicoproteinele salivare.

Conform invenției este, de asemenea, posibil să se modifice genetic bacteriile lactice în așa fel, încât să devină slab acidifiante. Pentru bacteriile lactice care sunt deja slab acidifiante, această modificare intenționează să amplifice amintitul efect de scădere a producerii de acid lactic, de către acestea.

Această modificare poate fi realizată în multe feluri și, de preferință, în conformitate cu unul dintre protocoalele descrise în următoarele documente: Boumerdassi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, 2293-2299, 1997; Platteeuw et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 3967-3971, 1995; Ito etal., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1569-1573, 1994.

Conform prezentei invenții, cel puțin o bacterie lactică, modificată genetic sau nu, este utilizată într-o cantitate eficientă, pentru prepararea compozițiilor destinate profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecțiilor periodontale, la om și animale, cum ar fi animalele de companie. Această cantitate este cuprinsă, de preferință, între 10⁴ și 10⁹ ufc/g.

RO 121005 Β1

De asemenea, este posibil să se utilizeze cel puțin o bacterie lactică în combinație1 cu derivați din lapte, cum ar fi lapte sau lapte fermentat, sau derivați ai laptelui selecționați dintre orice forme de cazeino-glicomacropeptide, cazeină micelară, cazeină micelară fluoru-3 rată, lapte închegat sau bacteriocină, spre exemplu.

Caracterizarea biochimică a tulpinilor selecționate5

Caracteristicile de fermentație: au fost testate 49 de glucide simple, cu ajutorul testului api 50 CH bioMerieux strip (bioMerieux SA, 69280 Marcy-l'Etoile, France), iar rezul- 7 țațele sunt prezentate în tabelul 1.

Curbele de acidifiere: curbele de acidifiere au fost determinate la 37’C, în urmă- 9 toarele condiții:

- S. sobrinus OMZ 176: sucroză FUM 1% și glucoză FUM 1%;11

- S. thermophilus CNCM 1-1985: sucroză Belliker 1% și glucoză Belliker 1%.

Inocularea a fost întotdeauna 5%; pH-ul a fost măsurat la fiecare 20 min;13

- S. thermophilus CNCM 1-1985 din fermentația sucrozei scade pH-ul la 4,5, în timp ce S. sobrinus OMZ 176 îl scade la 4.15

Tabelul 117

Fermentația glucidelor de către L. lactis CNCM 1-1987, L. lactis CNCM 1-1986 S.

thermophilus CNCM 1-1984, S. thermophilus, CNCM 1-1985 și S. thermophilus19

LMG P-18997

Glucidul	L. lactis	L. lactis	S. th.	S. th.	S. th. LMG
	CNCM I-	CNCM I-	CNCM I-	CNCM I-	P-18997
	1987	1986	1984	1985

Adonitol Esculină	+++	25
++	++++
Amigdalină	++++
D-arabinoză			27
L-arabinoză
D-arabitol			29
L-arabitol	+++
Arbutină	+++	+++	31
Celobioză	+++	++++
Dulcitol			33
Eritriol
D-fructoză	+	++++	35
D-fucoză
L-fucoză			37
Galactoză	++	++++

RO 121005 Β1

Tabelul 1 (continuare)

	Glucidul	L. lactis	L. lactis	S. th.	S. th.	S. th. LMG
3		CNCM I-	CNCM I-	CNCM I-	CNCM I-	P-18997
		1987	1986	1984	1985

5	β-Gentiobioză Gluconat	+++
7	2-ceto-Gluconat
	5-ceto-Gluconat
9	GIcNAc	+	++++
	D-Glucoză	+	++++	+ 0	++
11	Glicerol
	Glicogen
13	Inozitol
	Inulină
15	Lactoză	+	++++	+++ ++++	++++
	D-Lixoză
17	Maltoză	++
	Manitol	+++	++
19	D-Manoză	+	++++
	Melezitoză
21	Melibioză
	a-Metil-D-glucozid
23	a-Metil-D-manozid
	D-Rafinoză
25	Ramnoză
	Riboză	++	++
27	Salicin	+++	+++
	Sorbitol
29	L-Sorboză
	Amidon
31	Sucroză			+++ ++++	+++
	D-Tagatoză
33	Trehaloză	++
	D-Turanoză	++
35	Xilitol	+++
	D-Xiloză
37	L-Xiloză
	β-metil-Xilozid
39	+, ++, +++, ++++ arată dacă fermentația începe după 3, 6	24 sau 48 h.

RO 121005 Β1

Cel de-al doilea principal obiect al prezentei invenții vizează o compoziție pentru să-1 nătatea gurii, compoziție conținând o bacterie lactică care nu face parte din microflora rezidentă din gură, care este slab acidifiantă și care este capabilă să adere direct la pelicula 3 de smalț a dinților.

Aceste compoziții sunt destinate, în particular, pentru profilaxia sau tratamentul5 cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecției periodontale.

Menționata tulpină de bacterie lactică este selecționată din grupul alcătuit din:7

Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactiis și Lactococcus lactis subsp. biovardiacetylactisș'i, preferabil, din grupul alcătuit din tulpinile CNCM1-1984, CNCM1-1985,9

LMG P-18997, CNCM 1-1986 și CNCM 1-1987.

în asemenea compoziții destinate sănătății gurii, tulpinile de bacterii lactice potfi mo- 11 dificate genetic, așa cum s-a descris mai sus.

Numitele tulpini de bacterii lactice pot fi incluse, spre exemplu, într-un produs alimen- 13 tar, hrană pentru animale de companie, compoziție cosmetică sau farmaceutică.

în consecință, aceste compoziții sunt, de preferință: pastă de dinți, apă de gură, gumă 15 de mestecat, spray, băutură, bomboane, formule pentru copii, înghețată, deserturi înghețate, sosuri dulci pentru salate, preparate din lapte, brânză, quark (brânză dulce), iaurt, lapte 17 acru, lapte pentru cafea sau frișca, spre exemplu.

în aceste compoziții, tulpinile de bacterii lactice pot fi incluse singure sau în combi- 19 nație cu derivați din lapte, spre exemplu, în scopul obținerii de preparate sinergice. în consecință, aceste compoziții pentru sănătatea gurii conțin: 21

- o bacterie lactică care nu face parte din microflora rezidentă din gură, care este capabilă să adere direct la pelicula de smalț a dinților; 23

- orice formă de glicopeptide lactice, lapte închegat sau bacteriocină.

Glicopeptidele lactice sunt, de preferință: cazeino-glicomacropeptide (CGMP), ca- 25 zeină fluorurată sau non-micelară (care poate fi obținută așa cum a fost descris în brevetele EP 0604802 și 0748591) sau poate fi adăugat, de asemenea, și lapte închegat. Cazeino- 27 glicomacropeptidele sunt adăugate, de preferință, într-o cantitate minimă, de aproximativ 0,1 %. S-a constatat, de asemenea, că cazeino-glicomacropeptidele nu împiedică amintitele 29 bacterii lactice să adere la pelicula de smalț a dinților (fig. 2 și 3).

Pot fi preparate, de asemenea, compoziții sinergice, prin adăugarea a cel puțin unei 31 bacteriocine care este activă împotriva bacteriilor orale Gram-pozitive. în acest caz, compozițiile pentru igiena orală pot conține 0,00001...50% și, de preferință, între 0,00001 și 15% 33 bacteriocină purificată, raportat la greutatea compoziției. Bacteriocina este, de preferință, variacina (EP 0759469). 35

Pentru a proteja compoziția împotriva degradării, se poate include, de asemenea, un antioxidant oleo-solubil. Antioxidanții adecvați includ tocoferolii, butil-hidroxianisolul (BHA), 37 butil-hidroxitoluenul (BHT) și ascorbil palmitatul. Antioxidantul oleo-solubil este prezent în cantități cuprinse între 0,005 și 0,5%, de preferință, între 0,005 și 0,01%, raportat la masa 39 compoziției.

Abrazivii corespunzători utilizării în compozițiile de paste de dinți din prezenta invenție 41 includ: carbonat de calciu, aluminosilicat de calciu, oxid de aluminiu, hidrați de alumină, ortofosfat de zinc, particule de plastic și silice, dintre care silicea este abrazivul preferat. 43

Compozițiile conforme invenției vor avea un pH acceptabil pentru cavitatea bucală, iar activitatea amintitelor bacterii lactice, conținute în aceste compoziții, nu trebuie să fie corn- 45 promisă; pH-ul poate fi din domeniul 3,0...9,5, de preferință, din domeniul 3,5...6,5.

Aceste compoziții pot fi preparate prin procedee convenționale, care constau în 47 amestecarea ingredientelor în cantitățile relativ corespunzătoare, iar în final, și dacă este necesar, ajustarea pH-ului la valoarea dorită. 49

RO 121005 Β1

O metodă pentru screeningul bacteriilor lactice, capabile să adere de dinți, poate să cuprindă următoarele etape:

(1) prepararea anticorpilor monoclonali, care recunosc proteinele de suprafață, specifice, ale unei tulpini de bacterii lactice, capabile să adere de dinți și (2) screeningul oricărei tulpini de bacterii lactice prin utilizarea anticorpului monoclonal al tulpinii capabile să adere la dinți.

Anticorpii monoclonali, menționați, trebuie să fie utilizați ca instrument de detectare a menționatei tulpini de bacterii lactice printre alte tulpini care cresc alături de acestea.

Prezenta invenție nu trebuie limitată în ceea ce privește scopul acesteia prin exemplificările specifice descrise aici. într-adevăr, specialiștii din domeniu vor putea face ușor diferite modificări prezentei invenții, în afara celor descrise aici, în ceea ce privește descrierea anterioară și figurile însoțitoare. Asemenea modificări trebuie să se încadreze în scopul revendicărilor. Sunt citate aici diverse publicații, ale cărordescrierisuntîncorporate ca referință în întregimea lor, în măsura în care este necesar pentru înțelegerea prezentei invenții. Manipularea ADN, donarea și transformarea celulelor bacteriene sunt, cu excepția cazurilor în care se specifică altfel, efectuate în conformitate cu manualul lui Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989). Aceste exemple sunt precedate de o descriere scurtă a plasmidelor, tulpinilor și a diferitelor medii utilizate, precum și a metodei pentru producerea unui anticorp monoclonal.

Tulpinile S. thermophilus S118 (NCC 1529), S123(NCC 1561), L. lactissubsp. lactis 29 (NCC 2211), L. lactis subsp. lactis biovar dioacetylactis 69 (NCC 2225) au fost depuse, conform tratatului de la Budapesta, în Colecția Națională de Culturi de Microorganisme (CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986 și, respectiv, CNCM 1-1987), strada doctor Roux, nr. 25, Paris 75724, Franța, în data de 3 martie 1998. Tulpina S. thermophilus BF11116 (CNBL 1177) a fost depusă, conform tratatului de la Budapesta, în Colecțiile de Microorganisme Coordonate de Belgia LMG P-18997, K.L. Ledeganckstraat35, B-9000 gent, Belgia, pe 5 iulie 1999. Toate restricțiile, privind accesibilitatea la aceste depozite, vor fi retrase prin prima publicare a acestei cereri de brevet sau a altei cereri care revendică beneficiul priorității acestei cereri.

- fig. 1a, 1b și 1c reprezintă, respectiv, curbele de saturare a aderării pentru S. sobrinus OMZ 176, L. lactis NCC2211 și S. thermophilus NCC1561.

- fig. 2 reprezintă curbele obținute pentru cele trei tulpini, prin reprezentarea grafică a numărului de celule legate, în funcție de cantitățile crescătoare de CGMP;

- fig. 3 reprezintă curbele obținute pentru cele trei tulpini, prin reprezentarea grafică a numărului de celule legate, în funcție de cantitățile crescătoare de As-CGMP.

Exemplul 1. Tulpini și condițiile de cultură

Au fost supuse screeningului peste 100 de tulpini (aparținând colecției de culturi Nestle), din punctul de vedere al capacității lor de a se atașa la perle de hidroxiapatită acoperite de salivă și, în particular, următoarele 23 de tulpini; S. thermophilus YS4 (NCC 2284), S. thermophilus Sfi6 (NCC 1971), S. thermophilus Sfii 3 (NCC 2008), S. thermophilus Sfi21 (NCC 2038), S. thermophilus Sfi39 (NCC 2130), S. thermophilus Sfi42 (NCC 2145), S. thermophilus Sfi47 (NCC 2172), S. thermophilus S118 (NCC 1529), S. thermophilus S119 (NCC 1536), S. thermophilus S122 (NCC 1554), S. thermophilus S123 (NCC 1561), S. thermophilus S126 (NCC 1587), L. lactis subsp. cremoris 15 (NCC 92), L. lactis subsp. cremoris 25 (NCC 1932), L. lactis subsp. cremoris 136 (NCC 2419), L. lactis subsp. diacetylactis 8 (NCC 1970), L. lactis subsp. diacetylactis 28 (NCC 2057), L. lactis subsp. diacetylactis 69 (NCC 2225), L. lactis subsp. diacetylactis 80 (NCC 2272), L. lactis subsp. lactis 29 (NCC 2211), L. lactis subsp. lactis 50 (NCC 2224), L. lactis subsp. lactis 54 (NCC 2228), S. macedonicus 216 (NCC 2484).

RO 121005 Β1

Cele 5 tulpini orale: S. sobrinus OMZ176, S. oralis OMZ 607, A. naeslundiiOMZ 745, 1

V. dispar OMZ 493 și F. nucleatum OMZ 596 au fost obținute de la Institute fOr Orale Mikrobiologie und Allegemeine Immunologie, Universitatea din Ziirich, și au fost cultivate 3 în mediu FUM, în condiții de anaerobioză (GasPackSystem, BBL), la 37’C.

Toate tulpinile au fost păstrate în glicerol la -20°C și precultivate cu 14 h înainte de 5 utilizarea la temperatura lor optimă specifică; S. sobrinus OMZ 176 a crescut în mediu FUM (Gmiir et al.), lactococii și streptococii în mediu M17 (Difco), cu excepția lui S. thermophilus 1 NCC1529, S119, S122, NCC1561 și S126, care au crescut în mediu Belliker (preparat prin dizolvarea într-un litru de apă, a 20 g triptonă, 5 g extract de drojdie, 2,5 g gelatină, 5 g 9 dextroză, 5 g sucroză, 5 g lactoză, 4 g NaCI, 0,5 g acid ascorbic, 10 g bulion de carne).

Pentru numărarea pe placă: S. sobrinus OMZ 176 a fost cultivat în agar Mitis- 11 Salivarius (Difco), S. thermophilus NCC1529, S119, S 122, NCC1561, BF11116 și S126în agar Belliker (preparat prin adăugarea în lichidul Belliker, a 15 g de agar Bacto, Difco), iar 13 tulpinile de bacterii lactice rămase, în agar M17 (Oxoid).

Exemplul 2. Producerea unui anticorp monoclonal 15

Un anticorp monoclonal ar putea fi utilizat ca instrument pentru detectarea lui L. lactis subsp. lactis NCC2211 dintre 5 tulpini orale cultivate împreună pe discuri S-HA și care 17 formează un biofilm care simulează placa dentară. în consecință, anticorpul monoclonal a fost testat împotriva acestor tulpini, pentru a verifica că nu a existat nici o reacție încrucișată. 19 în acest scop, anticorpul monoclonal este produs așa cum au descris Granato et al.

în A mouse monoclonal IgE antibody anti-bovine milk lactoglobulin allows studies ofallergy 21 in the gastrointestinal tract, Clin. Exp. Immunol., 63,703-710, 1986.

Exemplul 3. Selecția de bacterii lactice aderente. 23

Atașarea de perle de hidroxiapatită acoperite de salivă (S-HA)

Pentru a selecta dintre tulpinile de bacterii lactice din produsele lactate, pe cele capa- 25 bile să se atașeze de perle de hidroxiapatită, acoperite de salivă (S-HA), a fost utilizat procedeul descris anteriorde Neeseretal. (1994), cu ușoare modificări: spălările perlelor au fost 27 făcute cu volume de 150 μΙ, iar hidroxidul de Hiamină a fost înlocuit cu hidroxidul de Benzethoniu (Sigma). 29

Pe scurt, toate tulpinile au fost cultivate până la sfârșitul fazei logaritmice în mediu

FUM, cu excepția lui S. thermophilus NCC1529, S119, S122, NCC1561 și S126, care au fost 31 cultivate în mediu Belliker. S. sobrinus OMZ 176, L. lactis subsp. lactis NCC2211,50 și 54,

S. thermophilus NCC1529, S119, S122, NCC1561 și S126 au crescute la 37’C, lactococii 33 rămași, la 30’C, iar streptococii rămași, la 42’C.

mg de perle de hidroxiapatită (BDH Chemicals Ltd, Poole, England) au fost aco- 35 perite cu 70 μΙ de salivă clarificată, obținută de la voluntari, în laborator, și preparate așa cum s-a explicat anterior (Neeseretal., 1994). Perlele acoperite de salivă au fost păstrate peste 37 noapte la 4°C, apoi spălate (mai întâi, cu apă distilată și apoi cu tampon HEPES) și, în final, inoculate cu 100 μΙ din suspensia bacteriană marcată metabolic (bacteriile au fost cultivate 39 în mediul lor, suplimentat cu 10 pCi/ml acid acetic, marcat cu ¹⁴C). Aderarea a avut loc în min, la 37’C, apoi, bacteriile nelegate au fost spălate, iar celulele atașate au fost numă- 41 rate direct într-un contor cu scintilație LKB (de tip Rackbeta 1219).

Procentele de aderare sunt exprimate ca radioactivitatea legată de perle, raportată 43 la radioactivitatea totală adăugată în fiecare godeu. Toate măsurătorile au fost efectuate în repetiții. Tabelul 2 raportează procentele de aderare la perlele de hidroxiapatită, acoperite 45 cu salivă, obținute pentru câteva tulpini alese și pentru S. sobrinus OMZ176 (tulpina de referință). 47

RO 121005 Β1

Tabelul 2

Procentele de aderare la perlele de hidroxiapatită, acoperite cu salivă, obținute pentru câteva tulpini alese

Tulpina	% de aderare (+ / - SD)
S. sobrinus OMZ 176	2,23 + /-0,49
S. thermophilus Sfi42 (NCC 2145)	0,08 + /-0,02
S. thermophilus Sfi47 (NCC 2172)	0,14 + /-0,04
S. thermophilus NCC 1529	2,89 + /-0,60
S. thermophilus S119 (NCC 1536)	0,15 + /-0,04
S. thermophilus S122 (NCC 1554)	0,93 + /-0,17
S. thermophilus NCC 1561	2,19 + /-0,50
S. thermophilus S126 (NCC 1587)	1,19 + /-0,56
L. lactis subsp. diacetylactis 28 (NCC 2057)	1,59 + /-0,17
L. lactis subsp. diacetylactis NCC 2225	1,96 + /-0,40
L. lactis subsp. diacetylactis 80 (NCC 2272)	1,20 + /-0,35
L. lactis subsp. lactis NCC 2211	2,85 + /-0,85

Patru tulpini: S. thermophilus NCC1529 (CNCM 1-1984), S. thermophilus NCC1561 (CNCM 1-1985), L. lactis subsp. lactis NCC2211 (CNCM 1-1986) (după cum urmează, L. lactis NCC2211) și L. lactis subsp. diacetylactis NCC2225 (CNCM 1-1987) au prezentat valori apropiate de S. sobrinus OMZ 176.

L. lactis NCC2211 și S. thermophilus NCC1561 au fost alese drept cei mai promițători candidați, deoarece cresc foarte bine la 37’C, care este temperatura din gură, în timp ce L. diacetylactis NCC2225 are o temperatură optimă de creștere de 30°C. în particular, L. lactis NCC2211 nu poate crește pe sucroză, dar poate fermenta o gamă largă de glucide, spre deosebire de alte tulpini orale, poate furniza glucoza cu ajutorul invertazei sale.

Curbele de saturare a aderării

Au fost determinate curbele reprezentând unitățile formatoare de colonii (ufc) legate, raportate la unitățile formatoare de colonii inoculate în godeu, pentru a verifica dacă ar putea fi obținută saturarea perlelor. Saturarea de 50% a reieșit direct din punctul de inflexiune al curbelor obținute. Au fost determinate curbele de saturare a aderării pentru S. sobrinus OMZ 176, L. lactis NCC2211 și S. thermophilus NCC1561. Acestea sunt prezentate în fig. 1.

Pentru cele trei tulpini, numărul de unități formatoare de colonii, (ufc) care trebuie inoculate în godeu pentru a obține o saturare de 50% a perlelor și numărul corespunzător de ufc legate au fost deduse direct din punctul de inflexiune al curbelor și sunt date în tabelul 3.

Tabelul 3

Numărul de ufc de inoculat per godeu, pentru a se obține o saturare de 50% a perlelor

S. sobrinus OMZ 176 L. lactis NCC2211 S. thermophilus NCC 1561	ufc/godeu	ufc legate	% aderare
4,00E + 07 1.00E + 07 3,00E + 07	4,00E + 06 9,00E + 05 2,00E + 06	10% 9% 7%

RO 121005 Β1

Exemplul 4. Efectul cazeino-glicomacropeptidelor 1

A fost studiată influența CGMP asupra aderării lui L lactis NCC2211 și a lui S. thermophilus NCC1561, pentru a verifica posibilitatea utilizării lor, în scopul favorizării predo- 3 minanței uneia dintre aceste două tulpini asupra celei patogene (îndeosebi S. sobrinus OMZ 176). Cazeino-glicopeptidele (CGMP) și derivații lor desializați (As-CGMP) au fost obținuți 5 de la Nestec S.A., Lausanne (pentru prepararea lor, vezi, Neeser et al., 1994).

A fost studiat efectul doză-răspuns asupra aderării la perlele S-HA, prin inocularea 7 în godeu, a 100 pl din suspensia bacteriană (ufc/ml corespunzând cu 50% saturare a perlelor, anterior calculată) care conținea CGMP sau As-CGMP în concentrații diferite și, apoi, 9 realizarea testului de aderare obișnuit. Au fost testate concentrații din domeniul 0,05...3 mg/ml. Nu s-a făcut nici o incubare anterioară a bacteriilor, în prezență de CGMP sau de As- 11 CGMP.

în fig. 2 sunt prezentate curbele obținute pentru cele trei tulpini, prin reprezentarea 13 grafică a numărului de celule legate, raportat la cantitățile crescătoare de CGMP, numărul de celule inoculate fiind cel corespunzător saturării de 50% a perlelor, calculat anterior 15 pentru fiecare tulpină. Puternica inhibare observată în cazul lui S. sobrinus OMZ 176 confirmă rezultatele anterioare, obținute de către Neeser et al. (1994) și Schtipbach et al. (J. 17

Dent. Res., 75, 1779-1788, 1996).

Așa cum reiese din fig. 2, 0,25 mg/ml au produs inhibarea cu 50% a aderării lui S. 19 sobrinus OMZ 176, în timp ce pentru obținerea aceluiași efect cu S. thermophilus NCC1561, au fost necesari peste 2 mg/ml. CGMP amplifică încet aderarea lui L. lactis NCC2211. 21

Ca și în cazul CGMP, derivatul desializat inhibă aderarea lui S. sobrinus OMZ 176; pentru producerea unei reduceri cu 50% a procentului de aderare, sunt necesari doar 0,05 23 mg/ml. As-CGMP nu influențează aderarea lui L. lactis NCC2211, în timp ce o favorizează slab pe cea a lui S. thermophilus NCC1561 (fig. 3). 25

Exemplul 5. Pasta de dinți

Pasta de dinți se prepară prin adăugarea a 10⁵ ufc/ml din cel puțin una dintre tulpinile 27 de bacterii lactice CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 sau LMG P18997, sub formă liofilizată, la următorul amestec, conținând: 29

- Clorură de cetii piridiniu ...................................... 1,65%;31

- Sorbitol (soluție 70 %) ....................................... 33,0%;

-Glicerină.................................................. 25,0%;33

- Carboximetil celuloză sodică 2,0%;

- Fluorură de sodiu ........................................... 0,25%;35

- Silice (RP 93).............................................. 26,3%;

- Silice ca agent de îngroșare.................................... 8,1%;37 (Sident 22)

- Zaharină sodică ............................................. 0,5%;39

- Poloxamer (Pluronic F108) 3,2%.

Această pastă de dinți este destinată profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecției periodontale.43

Exemplul 6. înghețata

Se prepară o smântână conținând 10,8% grăsimi lactice, 13,5% solide din lapte (nu 45 grăsimi), 0,3% Emulstab® SE30 și 0,3% spumă Emulstab® (Grindsted, DK), care este apoi pasteurizată la 105°C, timp de 20 s, omogenizată la 75°C și 300 bari, răcită la 38°C și 47 inoculată cu preculturi în mediu MRS, luată în faza de creștere exponențială, la un titru de

RO 121005 Β1

10⁷... 10⁸ ufc/ml, a cel puțin uneia dintre tulpinile de bacterii lactice CNCM 1-1984, CNCM I1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 sau LMG P-18997. Smântână este fermentată apoi, timp de 10 h, la 38°C, până la un pH de aproximativ 4,5. La sfârșitul fermentației, acestei creme i se adaugă sucroză și sirop de glucoză. Compoziția cremei este prezentată în tabelul 4, de mai jos.

Amestecul este apoi bătut, răcit la 4°C, păstrat la 4°C, răcit până la un grad de expansiune de 95% a volumului.

Tabelul 4

Ingrediente	Compoziție (kg) ’	Grăsimi (%)	Solide nongrăsimi (%)	Sucroză (%)	Conținut în solide (%)
Smântână (35%)	30,83	10,79	1,54		12,33
Lapte praf degresat	12,45		11,95		11,95
Emulstab® SE30	0,41				0,37
Spumă Emulstab®	0,41				0,36
Apă	55,91
Total: smântână bază	100,00	10,79	13,49	-	25,01
Smântână bază	74,14	8,00	10,00	-	18,54
Sucroză	22,06			15,00	15,00
Sirop de glucoză	3,80				3,00
înghețată fermentată	100,00	8,00	10,00	15,00	36,54

Exemplul 7. Iaurt

I de mediu de cultură MRS se sterilizează, timp de 15 min, la 121°C și se inoculează, apoi, cu 5% (în volum) dintr-o cultură activă din cel puțin una din tulpinile S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 sau LMG P-18997, conținând aproximativ 10⁹ufc/ml. După o incubare, timp de 8 h, la41°C, se obține un starter conținând 4,5.10⁸ ufc/ml.

I de lapte smântânit reconstituit, având un conținut de substanță uscată de 10%, la care se adaugă 0,1 % extract de drojdie, se sterilizează, timp de 15 min, la 121 °C și se inoculează cu 2% dintr-o cultură activă, de îngroșare, de Streptococcus thermophilus, comercială, conținând aproximativ 10⁹ celule/ml. După incubare, timp de 4 h, la 41 °C, se obține un starter conținând 4,5. 10⁸ celule/ml.

Un amestec de lapte integral, conținând 3,7% grăsimi, concentrat cu 2,5% lapte praf degresat și apoi pasteurizat, timp de 30 min, la 90°C, este apoi inoculat cu 2% (în volum) din starterul cel puțin uneia dintre tulpinile CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 sau LMG P-18997 și 3% (în volum) din starterul agentului de îngroșare Streptococcus thermophilus. Laptele inoculat este agitat, turnat în borcane și incubat, timp de 4 h, la 41 °C.

Iaurtul obținut are o consistență bună și textură moale, și este destinat sănătății gurii. Exemplul 8. Gumă de mestecat

O gumă de mestecat, pentru prevenirea sau tratarea cariilor dentare, a plăcii dentare sau a infecției periodontale, poate fi preparată prin adăugarea unei culturi active a cel puțin uneia dintre tulpinile S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 sau LMG P-18997, care să conțină aproximativ 1O⁴...1O⁹ufc/g, la următoarele ingrediente tipice:

- Xilitol .....................................................67,5%;

- Gumă de bază............................................... 20%;

- Carbonat de calciu............................................. 5%;

RO 121005 Β1

- Glicerina.....................................................3%;

- Pluronic F127.................................................2%;

- Gumă celulozică...............................................1%;

- Compuși de balast........................................... 0,5%;

-Aromă.......................................................1%.

Exemplul 9. Compoziții pentru hrana animalelor de companie

Un aliment pentru animale de companie, destinat sănătății gurii, se obține prin prepa- 7 rarea unui amestec furajer, făcut din: porumb, gluten de porumb, făină de pui și făină de pește, săruri, vitamine și minerale. Amestecul furajer este introdus într-un precondiționator 9 și umectat. Furajul umectat, la ieșirea din precondiționator, este introdus apoi într-un cuptorextruderși gelatinizat. Matricea gelatinizată, care iese din extruder, este împinsă printr-o ma- 11 triță și extrudată. Extrudatul este tăiat în bucăți adecvate, pentru hrănirea câinilor, uscat la aproximativ 110”C, timp de aproximativ 20 min, și răcit pentru formarea de granule, care au 13 o activitate a apei de aproximativ 0,6.

Granulele sunt stropite cu 3 amestecuri de acoperire. Fiecare amestec de acoperire 15 conține cultura activă a cel puțin uneia dintre tulpinile de S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 sau LMG P-18997, dar un amestec de acoperire utilizează grăsime hidroge- 17 nată de soia ca substrat de acoperire, un alt amestec de acoperire folosește apa ca substrat de acoperire, iar altul folosește digest proteic ca substrat de acoperire. Granulele conțin 19 aproximativ 10⁴... 10⁹ ufc/g din tulpinile amintite.

Claims

Revendicări

1. Utilizare a unei bacterii lactice, capabilă de a disloca patogenii dinților sau de a preveni atașarea lor, caracterizată prin aceea că numita bacterie tactică:

a) nu aparține microflorei rezidente în gură, și

b) când se administrează, contribuie la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ

5,5...7, și

c) este capabilă să adere direct la pelicula de smalț a dinților, adică având un procentaj de aderență la particule de hidroxiapatită, acoperite cu salivă, de cel puțin 1,96, după aderența lor, timp de 45 min, la 37°C, pentru prepararea unei compoziții destinate profilaxiei sau tratamentului cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecțiilor periodontale.
2. Utilizare în conformitate cu revendicarea 1, în care bacteriile lactice sunt selectate din grupul alcătuit din:

- o bacterie lactică, acidifiantă, care aderă la pelicula de smalț a dinților, și care a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă, contribuind la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7;

- o bacterie lactică, nonaderentă, care este slab acidifiantă, când se administrează, contribuie la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7, și care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula de smalț a dinților;

- o bacterie lactică, acidifiantă, nonaderentă, care a fost modificată genetic, așa încât să adere la pelicula de smalț a dinților, și care a fost modificată genetic, așa încât să fie slab acidifiantă, contribuind la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7.
3. Utilizare în conformitate cu revendicările 1 și 2, în care bacteria lactică este de origine lactată.
4. Utilizare în conformitate cu revendicările 1 la 3, în care cel puțin una dintre bacteriile lactice este selectată din grupul constând din: Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subs. lactis și Lactococcus lactis subs. lactis biovar diacetylactis.

RO 121005 Β1
5. Utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările 1 la 4, în care cel puțin una din bacteriile lactice este selectată din grupul constând din tulpinile CNCM 1-1984, CNCM I1985, CNCM 1-1987 și LGM P-18997.
6. Utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările precedente, în care bacteria lactică aderă la pelicula de smalț a dinților, prin intermediul factorilor de aderare.
7. Utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările 1 la 6, în care bacteria lactică a fost modificată genetic, pentru creșterea aderenței sale la pelicula de smalț a dinților, și/sau modificată genetic, pentru a deveni mai puțin acidifiantă.
8. Utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările 1 la 7, în care compoziția este una comestibilă, conținând o cantitate eficientă de bacterii lactice, pentru profilaxia sau tratamentul cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecțiilor periodontale.
9. Utilizare în conformitate cu revendicarea 8, în care compoziția conține cel puțin
10⁴...10⁹ cfu/g de bacterii lactice.

10. Utilizare în conformitate cu oricare dintre revendicările 1 la 9, în care bacteria lactică este combinată cu lapte, lapte fermentat, derivate din lapte sau bacteriocină.
11. Utilizare în conformitate cu revendicarea 10, în care derivatele din lapte sunt selecționate din orice formă de cazeină-glicomacropeptide, cazeină micelară, cazeină micelară fluorurată sau lapte închegat.
12. Compoziție pentru sănătatea gurii, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde cel puțin o tulpină de bacterie lactică, selectată din grupul constând din tulpina CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, speciile de Lactococcus lactis, care nu aparțin microflorei rezidente în gură, când se administrează, contribuie la un pH în cavitatea bucală, de aproximativ 5,5...7, și este capabilă să adere direct, la pelicula de smalț a dinților.
13. Compoziție în conformitate cu revendicarea 12, conținând o cantitate eficientă de bacterii lactice, pentru profilaxia sau tratamentul cariilor dentare, al plăcii dentare și al infecțiilor periodontale.
14. Compoziție în conformitate cu revendicarea 13, în care bacteria lactică este aleasă dintre Streptococcus thermophilus și lactococcus lactis species, în cantitate de 10⁴... 10⁹ cfu/g.
15. Compoziție în conformitate cu oricare dintre revendicările 12 la 14, în care bacteria lactică este combinată cu lapte, lapte fermentat, derivate din lapte sau bacteriocină.
16. Utilizare în conformitate cu revendicarea 15, în care derivatele din lapte sunt selecționate din orice formă de cazeină-glicomacropeptide, cazeină micelară, cazeină micelară fluorurată sau lapte închegat.