BG105188A

BG105188A - Включване на ексогенни млечнокисели бактерии в оралната микрофлора

Info

Publication number: BG105188A
Application number: BG105188A
Authority: BG
Inventors: Jean - Richard NEESER; Bernhard Guggenheim; Elena - Maria COMELLI; Francesca Stingele; Pier COCCONCELLI
Original assignee: Societe Des Produits Nestle S.A.
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2001-09-28
Also published as: US20020012637A1; TW552142B; JP2002522464A; WO2000009080A1; US6942849B2; AR020169A1; EP1104281A1; US20050238590A1; AU773799B2; TR200100406T2; DE69943283D1; EP1104281B1; IN2001CH00156A; KR20010072440A; IL140641A; HUP0103229A2; BR9912946A; ATE501640T1; CN1312704A; PL345890A1

Abstract

Изобретението се отнася до използване на млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлорана устата, слабо подкисляваща е и има способността да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите, за получаването на препарат за профилактика илилечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтални инфекции.

Description

Настоящото изобретение се отнася до инкорпорирането на екзогенни млечни бактерии в оралната микрофлора с цел профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО НИВО НА ТЕХНИКАТА

Устата (устната кухина) съдържа постоянно и непостоянно обитаваща микрофлора. Първата включва микроорганизми, които могат да установят повече или по - малко постоянно обитание по повърхностите в устата. Тези бактерии са главно локализирани върху езика, устната лигавица и зъбите, докато венците, устните, бузите, небцето и пода на устата поддържат доста слабо микрофлора.

Върху езика и устната лигавица, естествено обитаващата микрофлора включва микроорганизми избрани от Streptococcus, Veillonella, Bacterioides и Haemophilus. Върху зъбите преобладават стрептококи, лактобацили и актиномицес, но могат да бъдат открити разнообразни Грам положителн и отрицателни коки и пръчки.

Например, Frandsen et al. показаха, че X sanguis преобладава в устната лигавица, но първичното му местообитание е повърхността на зъбите, 5. gordonii се развива върху вече развита плака над венците, S. oralis и S. mitis се развиват върху първоначално образуваща се зъбна плака (Oral Microbiol. Immunol., 6, 129-133, 1991). Щамове принадлежащи към групата на мутаните са локализирани върху зъбите (S. criscetus, S. downei, S. ferus, S. macacae, S. mutans, S. rattus, S. sobrinus). Щамове принадлежащи към групата на S. milleri преобладават при зъбните абцеси (S. anginosus, S. constellatus, S. intermedius; Bentley et al., Int. J. System. Bacter. 1991, 41, 487-494; Wood et al., The Geneta of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academic and Professional, Chapman & Hall, W.H. eds., 1995).

Много от тези микроорганизми са безвредни паразити, но за много от тях е установено, че са етиологичния агент на някои заболявания (Hill, M.J. & Marsh, P.D. eds Human Microbial Ecology, 1990, CRC Press, Boca Raton Florida, USA).

Зъбната плака е филм, който се образува на повърхността на зъбите, състоящ се от бактериални клетки в сърцевина от извънклетъчни полизахариди и слюнни продукти. Веднага след израстването, зъбите се покриват с аморфен слой от слюнка, придобитата емайлна пеликула (ПЕП) е дебела около 1.3 pm и не може да бъде отстранена чрез нормално миене на зъби. Разполагането на бактериите върху зъбите следва веднага след образуването на ПЕП и плаката започва да се забелязва 8-12 часа след това като многослойна структура. Първият слой се състои от бактерии (най-ранните колонизатори), които се прикрепват към зъбите главно чрез специфично адхезин - рецепторно разпознаване, те образуват субстрат за вторите колонизатори, които се прикрепват един към друг чрез аналогично специфично свързване или чрез просто разполагане един до друг. Кохезията на плаката жизненоважно се гарантира чрез три механизма: присъствието на слюнната пеликула върху външния бактериален слой, специфично съвместно агрегиране между различните бактериални видове и глюканите, синтезирани от бактериите и, които остават вплетени в сърцевината на плаката (Skopek et al., Oral Microbiol. Immunol., 9, 19-24, 1994; Kolenbrander et al., Meth. Enzymol., 253, 385397, 1995; Hiroi et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 193-198, 1992; Gibbons et al., Infect. Immunol., 52, 555-561,1986).

Органичните киселини, продуцирани от устните бактерии по време на процеса на ферментация, причиняват пряко зъбни кариеси. Тези киселини атакуват твърдите тъкани на зъбите с последващо освобождаване на йони като калциеви, фосфатни, карбонатни, магнезиеви, флуорни, натриеви йони. Когато pH на устната кухина се повиши отново до около неутралното, слюнката се насища с калций и следователно се предотвратява освобождаването му от зъбите.

Между всичките хранителни остатъци, които се откриват в устата, въглехидратите показват най-силния причиняващ кариеси ефект, тъй като са директно налични за ферментация от устните бактерии.

Потенциално, всички микроорганизми, ферментиращи захари са кариесгенни, но главните етиологични агенти на кариеси по коронката и корените на зъбите са мутани стрептококи, т.к. те са силни продуценти на киселини; но също така могат да участвуват и лактобацили, които са силно киселиногенни . При хората, S. mutans и S. sobrinus са най - силно кариесогенните щамове и те се развиват върху зъбите без да колонизират цялата зъбна система. Наистина беше показано намаляване на техния брой от кътайте към предните зъби (Lindquist et al., Dent. Res., 69, 1160-1166, 1990). Нещо повече, при човешката плака, S. mutans и S. sobrinus предпочитаемо колонизират най-предразположените към кариеси места апикално на контактната област (Ahmady et al., Caries Res., 27, 135-139, 1993). Освен това, беше установено по-високо преобладаване на <S. sobrinus в областта на кътниците сравнено с това на S. mutans (Lindquist et al., Caries Res., 25, 146-152,1991).

Беше показано, че S. mutans и S. sobrinus се прикрепват към пеликулата на зъбите главно чрез адхезин - рецептор. Gibbons et al. показа, че S. mutans притежава адхезин, който се свързва със слюнни компоненти в пеликулата, докато клетките на S. sobrinus очевидно притежават адхезин, който се свързва с глюкан в пеликулата (Infect. Immunol., 52, 555-561, 1986).

Случайната микрофлора включва екзогенни бактерии, който могат случайно да присъствуват в устата, но които не се установяват за постоянно (дори да се осъществява повторно приемане през устата на тези бактерии). Всички хранителни бактерии и по-специално млечно киселите бактерии могат да бъдат част от тази временна микрофлора. До сега не е доказано, че тези екзогенни млечнокисели бактерии притежават способност директно да се прикрепват към пеликулата на зъбите. Многократното приемане на екзогенни млечнокисели бактерии може обаче да доведе до колонизиране на устата на всички устни повърхности като език, устната лигавица, венците, устните, бузите, небцето, долната част на устата и зъбите. Това колонизиране може да бъде резултат от прикрепване чрез специфично свързване с бактериите от постоянната микрофлора (феномен на съвместно - агрегиране) или чрез вплитане в сърцевината на полизахаридите продуцирани от постоянните бактерии или чрез адхезия към слюнните белтъци (особено гликопротеини).

Беше съобщено, че Lactobacillus casei rhamnosus GG (ATCC 53103) колонизира устата, най - вероятно епитела на устната лигавица. Този щам освен това се прикрепва към епитела на чревния тракт (Патент на САЩ 5032399, Gorbach et al.; Mier. Ecol. In Health and Dis., 7, 295-298, 1994). Противоположно на това, L. rhamnosus не се прикрепва към зъбите.

В Японски Патент N4021633 (Cyconmedix КК) се съобщава колонизиране на устата от Lactobacillus acidophilus, най-вероятно върху епитела на устната лигавица. Известни са много щамове Lactobacillus acidophilis, които се прикрепват също така към епитела на чревния тракт (ЕР577904; ЕР199535; Perdigon et al., Medicina, 46, 751-754, 1986; Perdigon et al., Immunology, 63,17-23,1988).

Също така, екзогенните бактерии могат да продуцират фактори, които инхибират растежа на постоянната микрофлора в устата. Например, в ЕР 759469 (Societe des Produits Nestle) е описана употребата на бактериоцин, продуциран от Micrococcus various за инхибирането на развитието на устните патогени S', sobrinus, S. sanguis,

S. mutans и A. viscosus.

Бяха използувани различни стратегии за намаляване развитието на постоянна микрофлора в устата, предимно поемането на бактерии коменсалисти от постоянната микрофлора, които не са кариесогенни, като например Streptococcus mutans (Японски Патент 59220191) или Streptococcus salivarius (Японски Патент 05004927) и/или Stomatococcus mucilaginosus, и/или повторно приемане на екзогенни млечни бактерии като L. casei, L. fermentum, L. acidophilis, L. crispatus, L. gasseri, L. salivaris, L. bulgaricus и S. salivarius (Tanzer et al., Infec. and Immunity, 48,44-50; WO92/14475).

Прилагането на бактериоцини е също така една от изследваните стратегии, които бяха установени, за намаляване на зъбните кариеси. Тези молекули привлякоха интерес като перспективни антикариесни агенти и като фактори важни при модулиране колонизирането на устната кухина. Анти-кариесният потенциал на приложения на някои бактериоцини идва от техния потенциал и широка антибактериална активност срещу стрептококи от групата мутанс и бактерии свързвани със зъбната плака и тяхното естествено срещане при бактерии, считани безопасни за човека (Патент на САЩ 5368845 на Колгейт, и WO94/12150 на Smithkline Beecham).

Прилагането на млечни производни също така предтавлява интерес за здавословността на устата. Наистина, патент на СЩ 5427769 (Nestec S.A.) описва друга алтернатива, където зъбните кариеси се предотвратяват чрез поставяне на зъбите в контакт с ядивен npenaparq съдържащ мицеларен казеин в количество достатъчно да инхибира колонизирането от Streptococcus sobrinus. Освен това в Европейски Патент (Societe des Produits Nestle S.A.) се съобщава употребата на флуориран мицеларен казеин или неговите мицеларни субединици за лечение на зъбни кариеси или плака. Патент на САЩ 4992420 (Nestec S.A.) описва лечение на устната кухина с капа-казеиногликомакропептид, получен от мляко, за премахване на плака и кариеси.

Млечните бактерии, които не са част от постоянната микрофлора на устата, никога не са покзвали, че наистина притежават способност директно да се прикрепват към пеликулата на зъбите. Следователно при колонизиране на повърхността на зъбите, такива млечни бактерии биха упражнили инхибиторна активност срещу растежа на постоянната микрофлора, включително устните патогени.

ОБОБЩЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Обект на настоящото изобретение е осигуряване използуването на млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата, която е слабо подкисляваща и която притежава способност да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите, получаването на препарат, предназначен за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

Млечна бактерии, която може да бъдат генетично променена за да се увеличи прикрепването й към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори и/или генетично променена, за да бъде по - слабо подкисляваща средата, допринасяйки за pH на устната кухина от около 5.5-7.0.

Млечната бактерия може да бъде подбрана от група, състояща се от:

• подкисляваща млечна бактерия, които се прикрепва към пеликулата на зъбите и която е генетично променена, така че да е слабо подкисляваща;

• неприкрепвяща се млечна бактерия, която е слабо подкисляваща и която е генетично променена така че да се прикрепва към пеликулата на зъбите;

• неприкрепваща се, подкисляваща млечна бактерия, която е генетично променена така че да се прикрепва към пеликулата на зъбите и е генетично променена така че да е слабо подкисляваща.

Друг обект на настоящото изобретение е да осигури препарат за здравословност на устата, съдържащ млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора, която е слабо подкисляваща и която притежава способност да се прикрепва директно към' пеликулата на зъбите.

В предпочитан метод, на препаратът за здравословност на устата включва поне един щам млечна бактерия, подбран от група състояща се от щамовете CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM I1987 и LMG Р-18997.

Препаратът за здравословност на устата може да включва поне една млечна бактерия, която е генетично променена, така че да се увеличи прикрепването й към пеликулата на зъбите чрез адхезионен фактор и/или е генетично променена за да бъде по - слабо подкисляваща и да поддържа pH на устната кухина от около 5.5-7.0.

Препаратът за здравословност на устата може да съдържа млечна бектирия подбрана от група състояща се от:

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В рамките на следващото описание, устата се дефинира като устна кухина на хора и животни като например домашни любимци, изградена от устна лигавица (венци, устни, бузи, небце и под на устата), езика и зъбите (включително изкуствени структури).

Постоянната мекрофлора на устата включва всички микроорганизми, които естествено обитават устата т.к. те могат да установят постоянно обитаване на устните повърхности. Постоянната микрофлора на устата също така включва бактерии, които живеят на граничната област между твърдите и меки тъкани на зъбите (точката на свързване зъб-венец), въпреки че процепите във венците и периодонталните джобове не присъствуват в здрава уста. Тази микрофлора включва микроорганизме, подбрани от Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Micrococcus, Peptostreptococcus, Peptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Actinomyces, Arachnia, Rothia, Alcaligenes, Eubacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Clostridium, Neisseria/Branhamella, Veillonella, Enterobacteriaceae, Campylobacter, Eikenella, Actinobacillus,

Capnocytophga, Haemophilus, Simonsiella, Bacteroides, Fusobacterium, Porphynomonas, Prevotella, Leptotrichia, Wolinella/Selenomonas, Mycoplasma, Candida, Spirochaetes, Protozoa.

Случайната микрофлора включва екзогенни бактерии, които могат при даден случай да присъствуват в устата, но не установяват постоянно местообитание. Тази случайна микрофлора може да включва всички микроорганизмиц срещащи се в храната като например бифидобактерии (В. infantis, В. adolescentis, В. breve и В. longum); лактококи (Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и Lactococcus lactis подвид lactic biovar diacetylactis), стрептококи (Streptococcus thermophilus, S. lactis, S. lactis cremoris u S. lactis diacetylactis); лактобацили (Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei подвид casei, Lactobacillus delbruckii подвид lactis, Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum и ацидофилна група включваща L. johnsonii, виж Fujisawa et al., Int. J. Syst. Bacte., 42, 487-491, 1992); педиококи (Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici и Pediococcus halophilus); ентерококи, стафилококи (Staphylococcus xylosus u Staphylococcus camosus); микрококи (Micrococcus varians), дрожди от род Debaromyces, Candida, Pichia, Torulopsis u Saccharomyces; и гъби от род Aspergicllus, Rhizopus, Mucor u Penicillium.

По отношение на първия обект на насоящото изобретение се има предвид използуването на млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата, която е слабо подкисляваща и която притежава способност да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите, за получаването на препарат, предназначен за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

Млечните бактерии съгласно изобретението са слабо подкисляващи и те притежават способност да се прикрепват директно към пеликулата на зъбите така че препаратите, които са получени с тези млечни бактерии са предназначени за заместване на патогените от зъбите или за предотвратяване на тяхното прикрепване. Млечните бактерии съгласно настоящото изобретение са “слабо подкисляващи”, което означава, че те подкисляват по-слабо средата в сравнение с патогенните щамове. Съответно, те допринасят pH на устната киселина да бъди 5.5 - 7. По - специално те са с млечен произход.

Млечните бактерии съгласно изобретението се прикрепват към пеликулата на зъбите чрез специфични или неспецифични взаимодействащи и/или адхезионни фактори. Специфични адхезионни фактори са белтъци или полизахариди.

Поне една млечна бактерия е подбрана от група състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis u Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis и no - специално от група състояща се от щамовете CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM1-1987 и LMG Р-18997.

Тези щамове са подбрани между щамове млечни бактерии по тяхната способност да се прикрепват към пеликулата на зъбите, тяхната оптимална температура на растеж е около 37°С, което е и температурата на устната кухина. Нещо повече, те притежават способност да ферментират глюкоза и захароза и не синтезират глюкани, които са фактори на патогенността на кариесгенните щамове.

Съгласно друг обект на настоящото изобретение, се разгжда генетично модифициране на млечни бактерии така че те да се прикрепват към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори. За млечни бактерии, които вече се прикрепват към пеликулата на зъбите, с това модифициране е се има предвид, щамовете да станат по 11 прикрепващи се към повърхността на зъбите. По същият начин, всяка неприкрепваща се млечна бактерия (не лактобацили) може да бъде генетично модифицирана така че да се прикрепва към пеликулата на зъбите.

Това модифициране на млечни бактерии може например да бъде постигнато чрез инсерция на гени XI7390, X 14490 или X 53657 (Регистрационните номера в GenBank). Тези гени са отговорни за експресията на Антиген Ι/II при 5. mutans, който опосредствува адхезията към слюнните глико протеини.

Съгласно изобретението, също така е възможно генетично да се модифицират млечни бактерии така че те да са слабо подкисляващи. За млечни бактерии, които вече са слабо подкисляващи, се има предвид увеличаване на въпросния ефект чрез намаляване продукцията им на млечна киселина.

Модифицирането може да бъде постигнато по различни начини и по - специално съгласно протоколите описани в следните документи: Boumerdassi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, 2293-2299, 1997; Platteeuw et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 3967-3971, 1995; Ito et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1569-1573, 1994.

Съгласно настоящото изобретение, поне една млечна бактерия генетично променена или не, е използувана в “ефективно количество” за получаването на препарат, предназначен за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция при хора или животни като например домашни любимци. Това количество по - специално включва 10⁴ до 10⁹ cfu/g.

Също така е възможно да се използува, поне една млечна бактерия, в комбинация с млечни производни като например мляко или ферментирано мляко, или млечни производни подбрани например от която и да е форма на казеино-гликомакропептид, мицеларен казеин, флуориран мицеларен казеин, подсирено мляко или бактериоцин.

БИОХИМИЧНО ОХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА ПОДБРАНИТЕ ЩАМОВЕ

Ферментационен профил: Бяха изследвани 49 прости захари с api 50 СН bioMeriex тест с лентички (bioMerieux SA, 69280 Marcyl’Etoile, Франция) и резултатите са посочени в Таблица 1.

Криви на подкисляване: Кривите на подкисляване бяха определени при температура 37°С, при следните условия:

• S. sorbinus OMZ176: среда FUM със 1 % захароза и среда FUM с 1 % глюкоза • S. thermophilus CNCM 1-1985: среда Belliker с 1 % захароза и Среда Belliker с 1 % глюкоза.

Инокулатът беше винаги 5 %, pH беше отчитано всеки 20 min.

S. thermophilus CNCM 1-1985 при ферментация на захароза намалява pH до 4.5 докато S. sobrinus OMZ 176 до 4.

Таблица 1. Ферментация на захари от L. lactis CNCM 1-1987, L. lactis CNCM 1-1986, S. thermophilus CNCM 1-1984, S', thermophilus CNCM I1985 и S', thermophilus LMG P-18997.

Захар	L. lactis CNCM 1-1987	L. lactis CNCM 1-1986	5. th. CNCM 1-1984	S. th. CNCM 1-1985	S. th. LMG P- 18997
Адонитол Аескулин	+++ ++	++++

Амигдалин D-Арабиноза L-Арабиноза D-Арабитол L-Арабитол Арбутин Целобиоза Дулцитол Еритритол D-Фруктоза D-Фукоза L-Фукоза Галактоза β-Гентиобиоза Глюконат 2-кетоГлюконат 5-кетоГлюконат N-ацетилглюкозамин D-Глюкоза	+4-++ +++ +++ +++ + ++ + +	+++ +-Н-+ ++++ ++++ +++ ++++ ++++	+	-н-	++
Глицерол
Гликоген
Инозитол
Инулин
Лактоза	+	++++		++++	++++
D-Ликсоза
Малтоза	++

Манитол	+++
D-маноза	+
Мелецитоза
Мелибиоза
а-Метил-D-
глюкозид
а-Метил-D-
манозид
D-Рафиноза
Рамноза
Рибоза	++
Салицин	+++
Сорбитол
L-Сорбоза
Нишесте
Захароза
D-Тагатоза
Трехалоза	++
D-Тураноза	++
Ксилитол	+++
D-ксилоза
L-Ксилоза
β-Метил-
ксилозид

++ ++++ ++ +++ +++

1-+++ +++ +, ++, +++, ++++ показват дали ферментацията започва след 3, 6, 24 или 48 часа.

Вторият основен обект на настоящото изобретение се отнася до препарат за здравословност на устата, включващ млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата, която е слабо подкисляваща и която притежава способност да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите.

По - специално, тези препарати са предназначени за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

Въпросният щам млечна бактерия е подбран от група състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis и no - специално от група, състояща се от щамовете CNCM1-1984, CNCM1-1985, CNCM I1986, CNCM 1-1987 и LMG Р-18997.

При тези препарати за здравословност на устата, щамовете млечни бактерии могат да бъдат генетично модифицирани съгласно описаното по - горе.

Въпросните щамове млечни бактерии могат да бъдат например включени в храна, храна за домашни любимци, козметични или фармацефтични препарати.

Съответно, тези препарати например са по специално паста за зъби, вода за уста, дъвки, спрей, напитки, бонбони, детски храни, сладолед, замразени десерти, сладки сосове за салати, млечни препарати, сирене, извара, кисело мляко, подкислено мляко, сметана за кафе, бита сметана.

В тези препарати, щамовете млечни бактерии могат да бъдат включени самостоятелно или в комбинация с млечни производни, например за получаването на синергични препарати. Съответно тези препарати за здравословност на устата включват:

• млечни бактерии, които не са част от постоянната микрофлора на устата, които притежават способност да се прикрепват директно към пеликулата на зъбите;

• всяка форма на млечни гликопептиди, подсирено мляко или бактериоцин.

Млечните гликопептиди са по-специално казеиногликомакропептиди (CGMP), флуориран или не мицеларен казеин (които могат да бъдат получени както е описано в патенти ЕР 0 604 802 и ЕР 0 748 591) или може да бъде добавено подсирено мляко . По специално казеино-гликомакропептидите се добавят в минимално количество от около 0.1 %. Освен това беше показано, че казеиногликомакропептидите не предотвратяват прикрепването на въпросните млечни бактерии към пеликулата на зъбите (Фиг. 2 и Фиг. 3).

Синергичните препарати могат да бъдат получени добавяйки поне един бактериоцин, който е активен срещу Грам-положителни орални бактерии. В този случай, препарати за орално почистване могат да включват 0.00001 до 50 % и по - специално от 0.00001 до 15 % пречистен бактериоцин по отношение на теглото на препарата. Бактериоцинът е по - специално вариации (ЕР 0 759 469).

С цел да се предпази препарата от разграждане, може в него да бъде включен мастноразтворим антиоксидант. Подходящи антиоксиданти включват “токофероли”, бутил-хидроксианизол (ВНА), бутил-хидрокситолуол (ВНТ) и аскорбил-палмитат. Масторазтворимият антиоксидант присъствува в количества от около 0.005 % до 0.5 %, по специално 0.005 % до 0.01 % по отношение теглото на препарата.

Подходящи абразивни вещества, използувани при препарати представляващи пасти или прах за зъби съгласно настоящото изобретение включват калциев карбонат, калциев алуминосиликат, двуалуминиев триокис, хидрати на двуалуминиев триокис, цинков ортофосфат, пластмасови частички и силициев двуокис, като от тях предпочитан абразивен агент е силициевият двуокис.

Препаратите съгласно изобретението притежават pH, което е орално приемливо и в рамките, на което активността на въпросните млечни бактерии не е изложена на риск. pH може да бъде в диапазона 3.0 - 9.5, по - специално в диапазона 3.5 до 6.5.

Тези препарати могат да бъдат получени чрез традиционни методи, включващи смесване заедно на съставките в потходящи отношения и накрая ако е необходимо коригиране на pH до желаната стойност.

Метод за скрининг на млечни бактерии притежаващи способност да се прикрепват към зъбите може да включва етапи на:

(1) получаване на моноклонални антитела разпознаващи специфични повърхностни белтъци от щамове на млечни бактерии, притежаващи способност да се прикрепват към зъбите, и (2) скрининг на който и да е щам млечна бактерия чрез

използуването на моноклонално антитяло от щам, притежаващ способност да се прикрепва към зъбите.

Въпросните моноклонални антитела могат да бъдат използувани като средство за детекция на въпросния щам млечна бактерия между други щамове развиващи се в близост.

Настоящото изобретение не трябва да се ограничава по отношение на обхвата си от специфичните методи описани тук. Наистина, разнообразни модификации на изобретението в допълнение на описаните тук могат да бъдат очевидни за всеки с познания и опит в съществуващото ниво на техниката от предхождащото описание и придружаващите ги фигури. Счита се, че такива модификации попадат в обхвата на патентните претенции. Тук са цитирани различни публикации, които са инкорпорирани чрез цитат в цялата тяхна пълнота до степен необходима за разбиране на настоящото изобретение. ДНК манипулациите, клонирането и трансформацията на бактериалните клетки са, освен където е изрично обозначено, проведени съгласно учебника на Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). Тези примери се предшествуват от кратко описание на използуваните плазмидите, щамовете и различните хранителни среди, както и метода за получаване на моноклонално антитяло.

Щамовете S', thermophilus S118 (NCC 1529), S123 (NCC 1561/ L. lactis подвид lactis 29 (NCC 2211), L. lactis подвид lactis biovar diacetylactis 69 (NCC 2225) бяха депозирани съгласно Будапещенския Договор в Националната Колекция за Култури Микроорганизми (съответно CNCM 1-1984, CNCM 1-1986, CNCM 1-1986 и CNCM I1987), 25 rue du docteur Roux, 75724 Париж, Франция на 3 Март 1998 г. Щамът 5. thermophilus BF 11116 (CNBL1177) беше депозиран съгласно Будапещенския Договор в Белгийската Обединена Колекция за Микроорганизми LMG P-18997, K.L. Ledeganckstraat 35, В-9000 Гент, Белгия на 5 Юли 1999 г. Всички ограничения относно достъпността до тези депозити ще бъдат оттеглени след първата публикация на тази патентна заявка или друга патентна заявка, която претендира за приоритет към тази патентна заявка.

ФИГУРИ

- Фигури 1а, 16 и 1в представляват адхезионните криви на насищане съответно за S. sobrinus OMZ 176, L. lactis NCC2211 и S. thermophilus NCC 1561.

- Фигура 2 показва кривите, получени за три щама, чрез изобразяване броят на свързаните клетки срещу увеличаващи се количества CGMP.

- Фигура 3 показва кривите, получени за три щама, чрез изобразяване броят на свързаните клетки срещу увеличаващите се количества As-CGMP.

Пример 1. ЩАМОВЕ И УСЛОВИЯ НА КУЛТИВИРАНЕ

Бюха скринирани повече от 100 щама (принадлежащи на колекцията за клетъчни култури на Нестле) за тяхната способност да се прикрепват към хидроксиапатитни перли, обвити със слюнка и по специално следните 23 щама: S. thermophilus YS4 (NCC 2284), £ thermophilus Sfi6 (NCC 1971), S. thermophilus Sfil3 (NCC 2008), S. thermophilus Sfi21 (NCC 2038), £ thermophilus Sfi39 (NCC 2130), £ thermophilus Sfi42 (NCC 2145), £ thermophilus Sfi47 (NCC 2172),£ thermophilus SI 18 (NCC 1529), £ thermophilus SI 19 (NCC 1536),£ thermophilus S122 (NCC 1554), £ thermophilus S123 (NCC 1561),£ thermophilus SI26 (NCC 1587), L. lactis подвид cremoris 15 (NCC 92), L. lactis подвид cremoris 25 (NCC 1932), L. lactis подвид cremoris 136 (NCC 2419), L. lactis подвид diacetylactis 8 (NCC 1970), L. lactis подвид diacetylactis 28 (NCC 2057), L. lactis подвид diacetylactis 69 (NCC 2225),

L. lactis подвид diacetylactis 80 (NCC 2272), L. lactis подвид lactis 29 (NCC 2211), L. lactis подвид lactis 50 (NCC 2224), L. lactis подвид lactis 54 (NCC 2228), £ macedonicus 216 (NCC 2484).

Петте орални щама, £ sobrinus OMZ 176, £ oralis OMZ 607, A. naeslundii OMZ 745, V. dispar OMZ 493 и F. nucleatum OMZ 596 бяха получени от Института за Орална Микробиология и Обща Имунология, Университет на Цюрих и те бяха култивирани на среда FUM в условия на анаеробиоза (GasPackSystem, BBL) при 37оС.

Всички щамове бяха съхранявани в глицерол при температура 20°С и съживени преди работа за 14 часа при тяхната специфична оптимална температура; S. sobrinus OMZ 176 расте на среда FUM (Gmuer et al.) лактококите и стрептококите на среда М 17 (Difco) с изключение на S', thermophilus NCC1529, SI 19, S122, NCC1561 и S126, които бяха култивирани на среда Belliker (приготвена чрез разтварянето на 20g триптон, 5 g дрождев екстракт, 2.5 g желатин, 5 g глюкоза, 5 g захароза, 5 g лактоза, 4 g NaCl, 0.5 g аскорбинова киселина, 10g говежди екстракт в 11 вода).

За преброяване на колониите на петри: S. sobrinus OMZ 176 беше култивиран на Mitis-Salivarius arap (Difco), S. thermophilus NCC1529, SI 19, S122, NCC1561, BF11116 и SI26 на Belliker arap (приготвен чрез ® прибавянето към течна среда Belliker на 15 g Bacto arap, Difco), и останалите щамове млечни бактерии бяха култивирани на Ml 7 arap (Oxoid).

Пример 2: ПОЛУЧАВАНЕ НА МОНОКЛОНАЛНО АНТИТЯЛО

За като средство за детектиране на L. lactis подвид lactis NCC2211 между 5 орални щама, растящи съвместно на S-НА дискове и образуващи биофилм, стимулиращ зъбната плака, е използувано моноклонално антитяло. Следователно, моноклоналното антитяло е ф изследвано срещу тези щамове, за да се обредели дали съществува кръстосана реакция.

Моноклоналното антитяло е получено съгласно описанието на Granato et al. “A mouse monoclonal IgE antibody anti-bovine milk lactoglobulin allows studies of allergy in the gastrointestinal tract., Clin. Exp. Immunol., 63, 703-710,1986.

Пример 3: СЕЛЕКЦИЯ НА ПРИКРЕПВАЩИ СЕ МЛЕЧНИ

БАКТЕРИИ

Прикрепване към хидроксиапатитни перли (S-НА) обвити със слюнка

За да се подберат между щамове млечни бактерии онези, които притежават способност да се прикрепват към хидроксиапатитни перли (S-НА), обвити със слюнка, беше използувана процедура по - рано описана от Neeser et al. (1994) с малки модификации: промиването на перлите беше проведено с обеми от 150 μΐ и хиамин хидроксидът беше заместен с бензетониев хидроксид (Sigma).

На кратко, всички щамове бяха култивирани до края на логаритмичната фаза на среда FUM, с изключение на S', thermophilus NCC1529, SI 19, S122, NCC1561 и S126, които бяха култивирани на среда Belliker. S. sobrinus OMZ 176, L. lactis подвид lactis NCC2211, 50 и 54, S. thermophilus NCC1529, SI 19, S122, NCC1561 и S126 бяха култивирани при температура 37°С, останалите лактококи при температура 30°С и останалите стрептококи при температура 42°С.

mg хидроксиапатитни перли (BDH Chemicals Ltd., Poole, Англия) бяха покрити с 70 μΐ просветлена слюнка, получена от доброволци в лабораторията и обработена както беше обяснено по рано (Neeser et al., 1994). Покритите със слюнка перли бяха съхранявани за една нощ при 4°С, след което промити (първо с дестилирана вода и след това с HEPES буфер) и накрая инокулирани с 10 μΐ метаболитно белязана бактериална суспензия (бактериите бяха култивирани на подходящата за тях среда с добавени към средата 10 pCi/ml ¹⁴С оцетна киселина). След инкубирани за 45 min при 37°С беше постигната адхезия, след което несвързаните клетки бяха отмити и прикрепените клетки директно отчетени с LKB сцинтилационен брояч (тип 1219 Rackbeta).

Процента на адхезия беше изразен като отчетената радиоактивност свързана с перлите отнесена към общата радиоактивност добавена във всяко гнездо. Всички измервания бяха проведени в три повторения. В Таблица 2 са показани процента на адхезията на обвити със слюнка хидроксиапатитни перли, получени за няколко скринирани щама и за S', sobrinus OMZ 176 (контролния щам).

Таблица 2. Процент адхезия към обвити със слюнка хидроксиапатитни перли, получена за няколко скринирани щама

ЩАМ	% АДХЕЗИЯ (+/-CO)
5. sobrinus OMZ 176	2.23 +/- 0.49
5. thermophilus Sfi42 (NCC 2145)	0.08 +/- 0.02
S thermophilus Sfi47 (NCC 2172)	0.14+/-0.04
S. thermophilus NCC 1529	2.89+/-0.60
S. thermophilus SI 19 (NCC 1536)	0.15+/-0.04
S. thermophilus S122 (NCC 1554)	0.93+/-0.17
S. thermophilus NCC 1561	2.19 +/- 0.50
S', thermophilus S126 (NCC 1587)	1.19+/-0.56
L. lactis подвид diacetylactis 28 (NCC 2057)	1.59+/-0.17
L. lactis подвид diacetylactis NCC 2225	1.96+/-0.40
L. lactis подвид diacetylactis 80 (NCC 2272)	1.20 +/-0.35
L. lactis подвид lactis NCC 2211	2.85 +/- 0.85

Четири щама - S. thermophilus NCC 1529 (CNCM 1-1984), 5. thermophilus NCC 1561 (CNCM 1-1985), L. lactis подвид lactis NCC 2211 (CNCM 1-1986) (тук no - долу L. lactis NCC 2211) и L. lactis подвид diacetylactis NCC 2225 (CNCM 1-1987) показаха стойности близки do S. sobrinus OMZ 176.

L. lactis NCC 2211 и S. thermophilus NCC 1561 бяха избрани като по-обещаващи кандидати, т.к. те се развиват много добре при температура 37°С, която е температурата на устата, докато L. diacetylactis NCC 2225 има оптимална температура на растеж ЗО°С. По специално, L. lactis NCC 2211 не може да се развива на захароза, но той може да ферментира голям спектър от захари, нещо повече друг орален щам може да осигури глюкоза чрез своята инвертаза.

Адхезионни криви на насищане

Бяха определени кривите на свързани CFU срешу CFU иноколирани в гнездата за да се провери дали може да бъде постигнато © насищане на перлите. Стойността, съответствуваща на 50 % насищане беше директно изведена от точката на извивката на получените криви. Бяха определени адхезионните криви на насищане за S. sobrinus OMZ 176, L. lactis NCC 2211 и S. thermophilus NCC 1561. Те, са показани на Фигура 1.

Броят на CFU, с който трябва да бъдат инокулирани гнездата за да се постигне 50 % насищане на перлите и съответният брой на свързани CFU, бяха директно изведени за трите щама от точката на извивката на кривите и са посочени в Таблица 3.

	cfu/гнездо	Свързани cfu	% адхезия
S. sobrinus OMZ 176	4.00E+07	4.00E+06	10%
L. lactis NCC 2211	1.00E+07	9.00E+05	9%
S. thermophilus NCC1561	3.00E+07	2.00E+06	7%

Пример 4: ВЛИЯНИЕ НА КАЗЕИНОГЛИКОМАКРОПЕПТИДИ

Беще изследвано влиянието на CGMP върху адхезията на L. lactis NCC 2211 и S. thermophilus NCC 1561 с цел да се провери възможността за използуването му за подпомагане преобладаването на един от тези два щама над патогенни такива (главно S'. sobrinus OMZ 176). Казеино-гликопептид (CGMP) и неговото десиалирано производно (As-CGMP) бяха получени от Nestec S.A., Lausanne (за тяхното получаване виж Neeser et al., 1994).

Влиянието на отговора на дозата беше изследвано по отношение прикрепването към S-НА перли чрез инокулиране в гнездата 100 μΐ бактериална суспензия (CFU/ml съответствуващи на предварително изчисленото 50 % насищане на перлите), която съдържа CGMP или AsCGMP в различни концентрации и след това провеждайки адхезионния анализ както обикновено. Бяха изследвани концентрации в диапазона 0.05-3 mg/ml. Не беше провеждано предварително инкубиране на бактерии в присъствието на CGMP или As-CGMP.

На Фигура 2 са представени кривите получени за трите щама чрез нанасяне броя на свързаните клетки срещу увеличаващи се количества CGMP, броят на инокулираните клетки са тези, които съответствуват на 50 % насищане на перлите, предварително изчислени за всеки щам. Силното инхибиране наблюдавано в случая със S'. sobrinus OMZ 176 потвърждава предишни резултати получени от Neeser et al. (1994) и Schuepbach et al. (J. Dent. Res., 75, 1779-1788, 1996).

Както е очевидно от Фигура 2, 0.25 mg/ml предизвикват 50 % инхибиране на адхезията на S', sobrinus OMZ 176, докато повече от 2 mg/ml бяха необходими за да се постигне същият ефект при S'. thermophilus NCC 1561. CGMP слабо усилва адхезията на L. lactis NCC 2211.

Както е случаят с CGMP, десиалираното производно инхибира адхезията на 5. sobrinus OMZ 176, като бяха необходими само 0.05 mg/ml за предизвикване на 50 % инхибиране на адхезията. As-CGMP не повлиява адхезията на L. lactis NCC 2211, докато той слабо я подпомага при 5. thermophilus NCC 1561 (Фигура 3).

Пример 5: ПАСТА ЗА ЗЪБИ

Беше приготвена паста за зъби чрез добавянето на 10⁵ cfu/ml в лиофилизирана форма от поне един от щамовете млечни бактерии CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 или LMG Р18997, към следната смес, съдържаща:

Цетил пиридин хлорид Сорбитол (70 % разтвор) Глицерин Натриева карбоксиметил целулоза Натриев флуорид Силициев двуокис (RP 93) Уплътняващ силициев двуокис (Sident 22) Натриев захарин Полоксамер (Pluronic Fl 08)

1.65% 33.0% 25.0% ' 2.0% 0.25 % 26.3 % 8.1 % 0.5 % 3.2%

Тази паста за зъби е предназначена за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

Пример 6: СЛАДОЛЕД

Беше приготвена сметана, съдържаща 10.8 % млечни мазнини, 13.5 % твърди млечни съставки (не-мазнини), 0.3 % Емулстаб® SE 30 и 0.3 % пяна Емулстаб® (Grindsted, Дания), след което тя беше пастьоризирана при 105°С за 20 s, хомогенизирана при 75°С и 300 bar, охладена до 38°С и инокулирана с предкултури на среда MRS, предкултурите са взети в експоненциалната фаза на растеж, в количество 10 - 10 cfu/ml от поне един от щамовете млечни бактерии CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 или LMG Р18997. Сметаната след това беше оставена да ферментира при 38°С за 10 часа до pH около 4.5. В края на ферментацията, беше добавен захарозен и глюкозен сироп. Съставът на сметаната е представен в Таблица 4 по - долу.

След това сместта беше разбита, охладена до 4°С, съхранявана при 4°С, замразена до степента на разширение по отношение на обема от-95°С.

Таблица 4.

Съставки	Състав (kg)	Мазнини (%)	Твърди вещества немазнини (%)	Захароза (%)	Съдържание на твърдо вещество (%)
Сметана (35 %)	30.83	10.79	1.54		12.33
Прахообразно обезмаслено мляко	12.45		11.95		11.95
Емулстаб® SE 30	0.41				0.37
Емулстаб® пяна	0.41				0.36
Вода	55.91
Общо:сметанова база	100.00	10.79	13.49	_β	25.01
Сметанова база	74.14	8.00	10.00		18.54
Захароза	22.06			15.00	15.00
Глюкозен сироп	3.80				3.00
Ферментирай сладолед	100.00	8.00	10.00	15.00	36.54

Пример 7: КИСЕЛО МЛЯКО

1 хранителна среда MRS беше стерилизирана при 121°С за 15 min и след това инокулирана с 5 % по отношение на обема активна култура от поне един от щамовете S. thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 или LMG Р-18997, съдържаща приблизително 10⁹ cfu/ml. След инкубиране за 8 h при 41°С, беше получен инокулат, съдържащ 4.5.10⁸cfu/ml.

1 разтворено обезмаслено мляко, притежаващо съдържание на сухо вещество 10 %, към което е прибавен 0.1 % дрождев екстракт беше стерилизирано при 121°С за 15 min и инокулирано с 2 % от р активната култура на търговски уплътнен препарат Streptococcus thermophilus съдържащ приблизително 10⁹ клетки/ml. След инкубиране при 41°С за 4 h, беше получена стартерна култура, съдържаща 4.8.10⁸клетки/ml.

Една партида от пълномаслено мляко, съдържащо 3.7 % мазнина подсилено с 2.5 % обезмаслено мляко и след това пастьоризирано за 30 min при 90°С беше инокулирано с 2 % по отношение на обема стартерна култура на поне един от щамовете CNCM 1-1984, CNCM I1985 или LMG Р-18997 и 3 % по отношение на обема със стартерна култура на уплътняващия Streptococcus thermophilus. Инокулираното мляко беше разбъркано, излято в кофички и инкубилано за 4 h при © 41°С.

Полученото кисело мляко притежава добра здравина и гладка консистенция и е предназначено за използуване като здравословно за устата кисело мляко.

Пример 8: ДЪВКА

Може да бъде приготвена дъвка за предотвратяване или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака или периодонтална инфекция, чрез

Mi прибавяне на активна култура от поне един щам Streptococcus thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 или LMG P-18997 така че да се съдържат приблизително 10⁴ до 10⁹ cfu/g, към следните типични съставки:

Ксилитол	67.5 %
База за дъвки	20%
Калциев карбонат	5%
Глицерин	3%
ПлуроникМ27	2%
Целулозна маса	1%
Баластни вещества	0.5 %
Ароматизатор	1%

Пример 9: ХРАНИТЕЛЕН ПРЕПАРАТ ЗА ДОМАШНИ ЛЮБИМЦИ

Получена е здравословна за устата храна за домашни любимци чрез приготвяне на хранителна смес за животни, съдържаща царевица, царевичен глутен, пилешка и рибна храна, соли, витамини и минерали. Хранителната смеска е поставена в предкондиционер и навлажнена. Навлажнената храна, излизайки от предкондиционера е поставена в екструдер - смесител и желатинирана. Желатинираната маса е екструдирана в матрица. Полученият екструдат е нарязан на парчета подходящи за храна на кучета, изсушена при около 110°С за около 20 min и охладена до образуването на пелети, които притежават водна активност от около 0.6.

Пелетите са напръскани с 3 покриващи смеси. Всяка покриваща смес съдържа активна култура от поне един щам Streptococcus thermophilus CNCM 1-1984, CNCM 1-1985 или LMG P-18997, като една обвиваща смес съдържа хидрогенирана соева мазнина като покриваща субстанция, една обвиваща смес съдържа вода като покриваща субстанция, една обвиваща смес съдържа белтъчен хидролизат като покриваща субстанция. Пелетите съдържат приблизително 10⁴ до 10⁹cfu/g от въпросните щамове.

WO 00/09080

PCT/EP99/05473

ДОГОВОР ОТ БУДАПЕЩА ЗА МЕЖДУНАРОДНО

ПРИЗНАВАНЕ НА ДЕПОЗИРАНИ МИКРООРГАНИЗМИ

ЗА ЦЕЛИТЕ НА ПАТЕНТНИ ПРОЦЕДУРА

МЕЖДУНАРОДЕН ФОРМУЛЯР

ПОЛУЧАТЕЛ

SOCEETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Патентен отдел

Avenue Nestle 55

CH-1800 VEVEV

ДОКУМЕНТ ЗА ПЪРВОНАЧАЛНО ДЕПОЗИРАНЕ издадена в съгласие с наредба 7.1 от

ВЛАСТИТЕ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ посочени по-долу на тази страница

ИМЕ И АДРЕС НА ДЕПОЗИРАЩИЯ

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА МИКРООРГАНИЗМА Идентификационна справка, дадена от 'ДЕПОЗИРАЩИЯ

NCC 1529

Номер по ред, определен от

ВЛАСТИТЕ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ

1-1984

II. НАУЧНО ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕНО ТАКСОНОМИЧНО ОТНАСЯНЕ Микроорганизмът, обозначен в графа I е придружен:

CD Or научно описание

LD Or предложение за таксономично отнасяне (вярното се подчертава)______________________________________________________________________________________

III. ПОЛУЧАВАНЕ И ПРИЕМАНЕ_______________________________________________________

Представените власти за международно депозиране приемат микроорганизма, обозначен под номер в I. , който е получен на 03 МАРТ 1998 (дата на първоначално депозиране)________________________________________

IV. ПРИЕМАНЕ НА ИСКАНЕ (ИСК) ЗА ПРОМЯНА_________________________________________

Тук представените власти за международно депозиране са получили микроорганизмът посочен в I...........

(дата на първоначалното депозиране) и са получили иск за промяна на първоначалното депозиране в депозиране в съгласие договора от Будапеща (дата на получаване на иска за промяна)

kV. ВЛАСТИ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ
*Име: CNCM Национална Колекция за Култури Микроорганизми Адрес: ИНСТИТУТ ПАСТЬОР 28, Rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15	Подпис на компетентните лица, които представят властите за международно депозиране или упълномощените служители: Г-жа И. Сернсиер Административен Директор на CNCM (подпис) Дата: Париж, 02 Април 1998

В случай на прилагане на член 6.4.d), тази дата е датата, на която е получен статута от властите за международно депозиране

Формуляр ВР/4 (единствена страница)

WO 00/09080

PCT/EP99/05473

ДОГОВОР ОТ БУДАПЕЩА ЗА МЕЖДУНАРОДНО

ПРИЗНАВАНЕ НА ДЕПОЗИРАНИ МИКРООРГАНИЗМИ

ЗА ЦЕЛИТЕ НА ПАТЕНТНИ ПРОЦЕДУРА

МЕЖДУНАРОДЕН ФОРМУЛЯР

ПОЛУЧАТЕЛ

SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Патентен отдел

Avenue Nestle 55

CH-1800 VEVEV

ИМЕ И АДРЕС НА ДЕПОЗИРАЩИЯ

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА МИКРООРГАНИЗМА
^Идентификационна справка, дадена от Депозиращия NCC 1561	Номер по ред, определен от ВЛАСТИТЕ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ 1-1985
II. НАУЧНО ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕНО ТАКСОНОМИЧНО ОТНАСЯНЕ
Микроорганизми, обозначен в графа I е придружен: □ От научно описание □ От предложение за таксономично отнасяне (вярното се подчертава)
III. ПОЛУЧАВАНЕ И ПРИЕМАНЕ
Представените власти за международно депозиране приемат микроорганизма, обозначен под номер в I. , който е получен на 03 МАРТ 1998 (дата на първоначално депозиране)
IV. ПРИЕМАНЕ НА ИСКАНЕ (ИСК) ЗА ПРОМЯНА
Тук представените власти за международно депозиране са получили микроорганизми посочен в I........... (дата на първоначалното депозиране) и са получили иск за промяна на първоначалното депозиране в депозиране в съгласие договора от Будапеща (дата на получаване на иска за промяна)
kV. ВЛАСТИ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ
*Йме: CNCM Национална Колекция за Култури Микроорганизми Адрес: ИНСТИТУТ ПАСТЬОР 28, Rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15	Подпис на компетентните лица, които представят властите за международно депозиране или упълномощените служители: Г-жа И. Серисиер Административен Директор на CNCM (подпис) Дата: Париж, 02 Април 1998

Формуляр ВР/4 (единствена страница)

WO 00/09080

PCT/EP99/05473

ДОГОВОР Ch d УДАПЕЩА ЗА МЕЖДУНАРОДНО

ПРИЗНАВАНЕ НА ДЕПОЗИРАНИ МИКРООРГАНИЗМИ

ЗА ЦЕЛИТЕ НА ПАТЕНТНИ ПРОЦЕДУРА

МЕЖДУНАРОДЕН ФОРМУЛЯР

ПОЛУЧАТЕЛ

SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Патентен отдел

Avenue Nestle 55

CH-1800 VEVEV

ИМЕ И АДРЕС НА ДЕПОЗИРАЩИЯ

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА МИКРООРГАНИЗМА

Идентификационна справка, ДЕПОЗИРАЩИЯ

NCC 2211 дадена от

Номер по ред, определен от

ВЛАСТИТЕ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ

1-1986

L·! Ог научно описание □ Ог предложение за таксономично отнасяне (вярното се подчертава)__

Представените власти за международно депозиране приемат микроорганизма, обозначен под номер в I. , които е получен на 03 МАРТ 1998 (дата на първоначално депозиране)________________________________________

V. ВЛАСТИ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ
Име: CNCM ' Национална Колекция за Култури Микроорганизми Адрес: ИНСТИТУТ ПАСТЬОР 28, Rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15	Подпис на компетентните лица, които представят властите за международно депозиране или упълномощените служители: Г-жа И. Серисиер Административен Директор на CNCM (подпис) Дата: Париж, 02 Април 1998

Формуляр ВР/4 (единствена страница)

WO 00/09080

РСТ/ЕР99/05473

ДОГОВОР ОТ БУДАПЕЩА ЗА МЕЖДУНАРОДНО ПРИЗНАВАНЕ НА ДЕПОЗИРАНИ МИКРООРГАНИЗМИ ЗА ЦЕЛИТЕ НА ПАТЕНТНИ ПРОЦЕДУРА

МЕЖДУНАРОДЕН ФОРМУЛЯР

ПОЛУЧАТЕЛ

SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Патентен отдел

Avenue Nestle 55

CH-1800 VEVEV

ИМЕ И АДРЕС НА ДЕПОЗИРАЩИЯ

I. ИД ЕНТИФИКАЦИЯ НА МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационна ДЕПОЗИРАЩИЯ	справка, NCC 222S	дадена	от	Номер по ред, определен от ВЛАСТИТЕ ЗА МЕЖД УНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ 1-1987

От научно описание

Ог предложение за таксономично отнасяне (вярното се подчертава)_______________________________________________________________________________

IV, ПРИЕМАНЕ НА ИСКАНЕ (ИСК) ЗА ПРОМЯНА_________________________________________

V. ВЛАСТИ ЗА МЕЖДУНАРОДНО ДЕПОЗИРАНЕ
)Име: CNCM Национална Колекция за Култури Микроорганизми Адрес: ИНСТИТУТ ПАСТЬОР 28, Rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15	Подпис на компетентните лица, които представят властите за международно депозиране или упълномощените служители: Г-жа И. Серисиер Административен Директор на CNCM (подпис) Дата: Париж, 02 Април 1998

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използуване на млечни бактерии, които не са част от постоянната микрофлора на устата и които са слабо подкисляващи и притежават способност да се прикрепват директно към пеликулата на зъбите, за получаването на препарат предназначен за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция.

(1) млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата, която притежава способност да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите и допринася за pH на устната кухина j около 5.5-7;

2. Използуване съгласно патентна претенция 1, при което млечната бактерия е подбрана от група, състояща се от:

• подкисляваща млечна бактерия, която се прикрепва към пеликулата на зъбите и, която е генетично променена, така че да е слабо подкисляваща;

• неприкрепваща се млечна бактерия, която е слабо подкисляваща и, която е генетично променена така, че да се прикрепва към пеликулата на зъбите;

• неприкрепваща се, подкисляваща млечна бактерия, която е генетично променена, така че да се прикрепва към пеликулата на зъбите и е генетично променена, така че да е слабо подкисляваща.

(2) каквато и да е форма на казеино-гликомакропептид, мицеларен казеин, флуориран мицеларен казеин или подсирено мляко.

2. Използуване съгласно патентна претенция 1, характеризиращо се с това, че препаратът е предназначен за заместване на патогени от устата или за предотвратяване тяхното прикрепване.

3. Използуване съгласно патентни претенции 1 или 2, характеризиращо се с това, че препаратът е предназначен за заместване на патогени в устата или за предотвратяване тяхното прикрепване.

3. Използуване съгласно патентни претенции 1 или 2, характеризиращо се с това, че млечните бактерии са по - слабо подкисляващи отколкото патогенните щамове, допринасящи за pH на устната кухина от около 5.5-7.

4. Използуване съгласно патентни претенции 1 - 3, характеризиращо се с това, че млечните бактерии са по - слабо подкисляващи отколкото патогенните щамове, и допринасящи за pH на устната кухина от около 5.5-7.

4. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечните бактерии са с произход млечни продукти.

5. Използуване, съгласно патентни претенции 1-4, характеризиращо се с това, че млечните бактерии са с произход млечни продукти.

5. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че поне една млечна бактерия е подбрана от група състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis.

6. Използуване, съгласно патентни претенции 1-5, характеризиращо се с това, че поне една млечна бактерия е подбрана от група състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis.

6. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че поне една млечна бактерия е подбрана от група, състояща се от щамовете CNCM 1-1984, CNCM I1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 или LMG Р-18997.

7. Използуване, съгласно патентни претенции 1-6, характеризиращо се с това, че поне една млечна бактерия е подбрана от група, състояща се от щамовете CNCM 1-1984, CNCM 1-1985, CNCM I1986, CNCM 1-1987 или LMG P-18997.

7. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечната бактерия се прикрепва към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори.

8. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечната бактерия се прикрепва към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори.

8. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е генетично модифицирана за увеличаване прикрепването към пеликулата на зъбите и / или е генетично модифицирана за да бъде по слабо подкисляваща.

9. Използуване, съгласно патентни претенции 1-8, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е генетично модифицирана за увеличаване прикрепването към пеликулата на зъбите и / или е генетично модифицирана за да бъде по - слабо подкисляваща.

9. Използуване на млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата, за получаването на препарат предназначен за профилактика или лечение на зъбни кариеси, зъбна плака и периодонтална инфекция, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е подбрана от група състояща се от:

10. Използуване, съгласно патентни претенции 1-9, характеризиращо се с това, че препаратът е ядлив препарат, съдържащ ефективно количество млечна бактерия за профилактика или лечение на зъбен кариес, зъбна плака и периодонтална инфекция.

10. Използуване, съгласно патентни претенции 8 и 9, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е генетично променена така че тя да се прекрепва към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори и допринася за pH на устната кухина от около 5.57.

11. Използуване, съгласно патентна претенция 10, характеризиращо се с това, че препаратът съдържа млечна бактерия в количество поне 10⁴ - 10⁹ cfu/g.

11. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че препаратът е ядлив препарат, съдържащ ефективно количество млечна бактерия за профилактика или лечение на зъбен кариес, зъбна плака и периодонтална инфекция.

12. Използуване, съгласно патентни претенции 1 - 11, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е комбинирана с мляко, ферментирано мляко, млечни производни или бактериоцин.

12. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че препаратът съдържа млечна бактерия в количество поне 10⁴ - 10⁹ cfii/g.

13. Използуване, съгласно патентна претенция 12, характеризиращо се с това, че млечните производни са подбрани от: каквато и да е форма на казеино-гликомакропептид, мицеларен казеин, флуориран мицеларен казеин или подсирено мляко.

13. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечната бактерия е комбинирана с мляко, ферментирано мляко, млечни производни или бактериоцин.

14. Препарат за здравословност на устата, съдържащ млечна бактерия, която не е част от постоянната микрофлора на устата и която е слабо подкисляваща и притежава способност да се прикрепва директно към пеликулата на зъбите.

14. Използуване, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращо се с това, че млечните производни са подбрани от: каквато и да е форма на казеино-гликомакропептид, мицеларен казеин, флуориран мицеларен казеин или подсирено мляко.

15. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентна претенция 14, характеризиращ се с това, че млечната бактерия е генетично модифицирана за увеличаване прикрепването към пеликулата на зъбите и / или е генетично модифицирана за да бъде по слабо подкисляваща.

15. Препарат за здравословност на устата, съдържащ млечни бактерии, които не са част от постоянната микрофлора на устата и които са слабо подкисляващи и притежават способност да се прикрепват директно към пеликулата на зъбите.

16. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентни претенции 14 или 15, характеризиращ се с това, че млечната бактерия еа подбрана от група, състояща се от:

• неприкрепваща се млечна бактерия, която е слабо подкисляваща и, които е генетично променена така, че да се прикрепва към пеликулата на зъбите;

• неприкрепваща се, подкисляваща млечна бактерия, която е генетично променена, така че да се прикрепва към пеликулата на зъбите и е генетично променени, така че да е слабо подкисляваща.

16. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентна претенция 15, характеризиращ се с това, че млечната бактерия е генетично модифицирана за увеличаване прикрепването към пеликулата на зъбите и / или е генетично модифицирана за да бъде по слабо подкисляваща.

17. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от патентни претенции 14 - 16, характеризиращ се с това, че млечната бактериа е генетично променена така че тя да се прикрепва към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори и допринася за pH на устната кухина от около 5.5-7.

17. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентни претенции 15 или 16, характеризиращ се с това, че млечните бактерии са подбрани от група състояща се от:

18. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от патентни претенции 14 - 17, характеризиращ се с ефективно количество млечна бактерия за профилактика или лечение на зъбен кариес, зъбна плака и периодонтална инфекция.

18. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращ се с това, че млечната бактериа е генетично променена така че тя да се прикрепва към пеликулата на зъбите чрез адхезионни фактори и допринася за pH на устната кухина от около 5.5-7.

19. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентна претенция 18, характеризиращ се с това, че съдържа млечна бактерия в количество поне 10⁴ - 10⁹ cfu/g.

19. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращ се с ефективно количество млечна бактерия за профилактика или лечение на зъбен кариес, зъбна плака и периодонтална инфекция.

20. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от патентни претенции 14 - 19, характеризиращ се с поне един щам млечна бактерия, подбран от група, състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis.

20. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращ се с това, че съдържа млечна бактерия в количество поне 10⁴ - 10⁹ cfu/g.

21. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от патентни претенции 14 - 20, характеризиращ се с поне един щам млечна бактерия, подбран от група, състояща се от щамовете CNCM I1984, CNCM 1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 или LMG P-18997.

21. Препарат за здравословност на устата, характеризиращ се с:

22. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от патентни претенции 14-21, характеризиращ се с това, че млечната бактерия е комбинирана с мляко, ферментирано мляко, млечни производни или бактериоцин.

22. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращ се с поне един щам млечна бактерия, подбран от група, състояща се от Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид lactis biovar diacetylactis.

23. Препарат за здравословност на устата, съгласно която и да е от предходните патентни претенции, характеризиращ се с поне един щам млечна бактерия, подбран от група, състояща се от щамовете j CNCM1-1984, CNCM1-1985, CNCM 1-1986, CNCM 1-1987 или LMG Р; 18997.

I 24. Метод за скрининг на млечни бактерии, притежаващи способност да се прикрепват към зъбите, характеризиращ се с етапи на: φ (1) получаване на моноклонални антитела, разпознаващи специфични повърхностни белтъци на щам млечна бактерия, притежаваща способност да се прикрепва към зъбите, и

I | (2) скрининг на какъвто и да е щам млечна бактерия, чрез използуването на моноклонално антитяло на щам, притежаващ способност да се прикрепва към зъбите.

ПРОМЕНЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

23. Препарат за здравословност на устата, съгласно патентна претенция 22, характеризиращ се с това, че млечните производни са подбрани от: каквато и да е форма на казеино-гликомакропептид, мицеларен казеин, флуориран мицеларен казеин или подсирено мляко или бактериоцин.