KR20160030956A

KR20160030956A - 구강 조성물

Info

Publication number: KR20160030956A
Application number: KR1020167002501A
Authority: KR
Inventors: 나탈리아 유디나; 막심 다니엘 세페로비치
Original assignee: 인테그라 메디컬 인코포레이티드
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2016-03-21
Also published as: SG11201600034XA; US20160166501A1; US20210369600A1; EP3016667A1; RS63856B1; EA201690147A1; EP3016667A4; NZ715667A; KR102443570B1; JP2016531089A; PL3016667T3; JP2021107442A; AU2014286892A1; HK1221401A1; IL243434B; BR112016000072A2; ES2934687T3; CA2917268C; KR20220129671A; CA2917268A1

Abstract

본 발명에 따른 구강 위생용 조성물은 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주를 포함한다. 추가로 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주, 특별히 락토바실루스 플란타룸 SD5870을 함유하는 조성물이 특히 효과적이다. 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10과 락토바실루스 플란타룸 SD5870의 조합은 상승적으로 구강 위생을 증진한다. 조성물은 특히 치아우식증에 유용하다.

Description

구강 조성물{ORAL COMPOSITIONS}

관련 출원

본 원은 2013년 7월 5일자로 출원된 미국 가특허출원 USSN 61/843,158에 대하여 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 참고로 본 원에 포함되었다.

기술분야

본 발명은 구강 투여를 위한 생균제(probiotic) 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 건강, 특히 구강 건강을 증진하는 등의 유익한 효과를 갖는 생군제 조성물 및 상기 조성물의 투여방법에 관한 것이다.

구강, 예를 들어 입 안은 다양한 수많은 미생물군이 서식하고 있다. 균형이 손상되고 토착 박테리아 사이에서 불균형이 나타나면, 치아우식증(dental caries) 또는 치주염(periodontitis) 같은 병리가 발생할 수 있다. 생균제는 숙주에 건강상 이점을 제공할 수 있는 살아있는 미생물이다. 생균제 요법의 유익한 효과는 어느 정도 숙주와 관련된 기존 미생물군의 조절에 의해 얻어지고, 그 결과 균형잡힌 건강한 미생물-숙주 관계가 얻어진다. 구강과 관련하여, 생균제 조성물은 균형잡힌 박테리아 개체군의 회복을 도와서 구강 건강을 증진할 수 있다.

치아우식증은 전형적으로 아동기에 돌보는 사람을 통해 전파되는 아주 흔한 감염성 질환으로, 평생 또는 완전한 무치악(edentulism)이 될때까지 지속된다. 치아우식증은 대개 항미생물 작용으로 인해 매우 효과적인 플로싱(flossing) 또는 칫솔질 같은 항미생물 예방적 방법에 의해 관리된다. 최근 우식학(Cariology)의 발전은 충치 형성에 대한 광범위한 미세생태학적 상황의 보다 나은 이해를 유도하고 있고, 이는 충치 관리에서 적용될 새로운 미생물 기반 예방 치료 전략 및 방법의 기회를 제공하고 있다.

충치와 관련된 초기 병원성 박테리아의 감염은 뮤탄스 연쇄상구균(mutans streptococci) 그룹 박테리아, 특히 슈크로스로부터 자가생성된 불용성 엑소폴리사카라이드의 생체막(biofilm)으로 싸여 있는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)이다. 이러한 부착성 플라크가 생태학적 기생위치를 제공하고, 여기서 병원성 박테리아가 번식하여 점차적으로 치아 미네랄을 용해하는 다양한 유기산을 탄수화물로부터 생산한다. 충치 발병에 대한 보다 현대적인 이해는 이제 미생물, 생태학, 환경적 인자들의 상황을 포함하며, 여기서 미생물군 생태학의 변경 또는 불균형이 충치가 형성되게 한다. 이로 인하여, 생균제 요법이 에스. 뮤탄스(S. mutans) 및 구강 미생물군을 조절하는 효과적인 방법이 될 것이라는 가능성으로 제안되었고(Caglar 2005a; Saha 2012; Tagg 2003), 생균제로서 개별 균주의 사용 가능성에 대한 상당한 임상 연구 결과들이 제공되고 있다(Naese 2001; Taipale 2012; Keller 2011; Stecksen-Blicks 2009; Burton 2013; Caglar 2008; Caglar 2006; Caglar 2005b).

다양한 균주들이 치아우식증과 싸우는 표면적 메카니즘은 경우마다 다르다. 예를 들어, 일부 균주는 에스. 뮤탄스와 응집하여 항-에스. 뮤탄스 활성을 갖는 반면, 다른 균주들은 특정한 박테리오신(bacteriocins)을 분비하여 에스. 뮤탄스를 직접 사멸하거나 저해하고, 다른 균주들은 플라크에 이식되어 에스. 뮤탄스와 그의 생태적 기생위치에서 경쟁한다. 따라서 이러한 메카니즘들을 조합하는 것의 상보적인 상승효과에 대한 가능성이 존재한다. 또다른 예로, 2개의 생균제 균주는 서로 다른 박테리오신을 분비하고, 에스. 뮤탄스 내에서 다양한 생화학적 타겟으로 인해 단독으로 보다 더 강력한 조합된 에스. 뮤탄스 멸균 효과를 나타낼 수 있다.

생균제 조성물은 또한 특정 환경에서 프리바이오틱(prebiotic)을 조성물에 첨가하여 강화될 수 있다. 프리바이오틱은 유익한 박테리아 서브개체군을 증강하도록 미생물군에 "영양을 공급"하며; 생균제는 미생물군의 개체군에 유익한 배양을 부가한다. "신바이오틱(synbiotic)"이란 용어는 프리바이오틱과 생균제를 모두 포함하는 조성물, 예를 들어 프럭토올리고사카라이드(FOS)(프리바이오틱)와 비피도박테리아(생균제)를 포함하는 조성물을 말한다. 이 분야의 연구는 상보적 프리바이오틱 성분들의 존재에 의해 생균제의 생육과 생존이 증강될 수 있는 방법을 보다 잘 이해하기 위해 성분들 종류 간의 상승작용에 집중되었다.

수많은 생균제 조성물들이 알려져 있지만, 각각의 조성물은 고유한 특성과 특별한 건강상 이점이 있다. 구강 건강에 대한 이점을 갖는 생균제 조성물의 일 예가 2012년 7월 22일자로 공동 출원된 미국 가특허출원 USSN 61/674,390에 기술되어 있으며, 여기서는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) K12® (BLIS K12®)와 적어도 5종의 락토바실루스 박테리아를 포함하는 생균제 조합물이 기술되었다.

그러나, 생균제 조성물의 향상된 제제, 구체적으로 증진된 구강 건강, 증진된 구강 군체 형성, 향상된 효능, 개선된 저장 수명, 상이하고 특이적인 구강 질환에 대한 효능, 및 추가적인 개선 중 하나 이상을 얻는 제제 및, 이들의 투여 또는 사용방법은 여전히 필요하다.

본 발명의 일 측면에서, 구강 위생적으로 유효한 양의 생균제를 포함하는 구강 위생용 조성물을 제공하고, 여기서 생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주를 포함한다.

본 발명의 제2 측면에서, 구강 위생적으로 유효한 양의 생균제를 포함하는 구강 위생용 조성물을 제공하고, 여기서 생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주와 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 포함한다.

본 발명의 제3 측면에서, 구강 위생적으로 유효한 양의 생균제를 포함하는 구강 위생용 조성물을 제공하고, 여기서 생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) SD5846을 포함한다.

본 발명의 제4 측면에서, 치아우식증을 방지하는 유효량의 생균제를 포함하는, 치아우식증의 치료 또는 방지용 조성물을 제공하고, 여기서 생균제는 락토바실루스 플란타룸 SD5870을 포함한다.

본 발명의 제5 측면에서, 치아우식증을 방지하는 유효량의 생균제를 포함하는, 치아우식증의 치료 또는 방지용 조성물을 제공하고, 여기서 생균제는 비피도박테리움 롱검 SD5846을 포함한다.

본 발명의 제6 측면에서, 상기한 생균제의 구강 위생을 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 제7 측면에서, 상기한 생균제의 구강 위생용 의약의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 제8 측면에서, 대상에게 상기한 생균제를 경구 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 구강 상태 또는 질환을 치료 또는 방지하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제9 측면에서, 상기한 생균제와 구강 위생에서 이를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 상업적 포장을 제공한다.

생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주를 포함하거나 본질적으로 이 균주로 구성된다. 생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스 및, 하나 이상의 다른 생균성 박테리아, 바람직하게 락토바실리, 비피도박테리아 및/또는 스트렙토코시 속, 더욱 바람직하게 하나 이상의 다른 락토바실리, 보다 더 바람직하게 하나의 다른 락토바실러스를 포함하거나 또는 본질적으로 이 균주들로 구성될 수 있다. 생균제는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주 및 락토바실루스 플란타룸 균주, 특히 락토바실루스 플란타룸 SD5870 (상업적으로 락토바실루스 플란타룸 Lp-2001로 공지됨)를 포함하거나 본질적으로 이 균주들로 구성될 수 있다. 용어 "~본질적으로 구성된다"란 다른 생균성 박테리아가 존재하지 않거나 미미한 양으로 존재하는 것을 의미한다. 락토바실루스 헬베티쿠스 균주는 바람직하게 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10, 락토바실루스 헬베티쿠스 R0052 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 락토바실루스 헬베티쿠스 균주는 더욱 바람직하게 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10을 포함한다.

특히 치아우식증을 치료 또는 방지하기 위해, 생균제는 경우에 따라 락토바실루스 플란타룸 SD5870 또는 비피도박테리움 롱검 SD5846을 포함할 수 있다. 생균제는 바람직하게 락토바실루스 플란타룸 SD5870을 스트렙토코커스 살리바리우스 M18 및 스트렙토코커스 살리바리우스 K12 둘 다 또는 둘 중 하나와 조합하여 포함한다. 바람직하게, 생균제는 본질적으로 락토바실루스 플란타룸 SD5870으로 구성되거나, 본질적으로 락토바실루스 플란타룸 SD5870 및, 스트렙토코커스 살리바리우스 M18과 스트렙토코커스 살리바리우스 K12 둘 다 또는 둘 중 하나로, 다른 생균성 박테리아가 존재하지 않거나 미미한 양으로 존재하도록 구성된다.

구강 위생은 입 안의 상태 또는 질환의 방지 또는 치료를 포함한다. 이러한 상태 또는 질환은, 예를 들어 치아우식증(충치), 구취, 치은염, 구강 궤양, 예컨대 아프타성(aphthous) 구내염 (구내 궤양), 칸디다증 및 치주 질환을 포함한다. 본 발명의 일 측면에서, 스트렙토코커스 뮤탄스 개체군은 구강 내에서 억제되어, 양호한 구강 건강을 유도한다. 특히 바람직한 구체예에서, 치아우식증이 방지된다. 본 발명이 유용한 대상은, 예를 들어 포유동물을 포함한다. 대상은 영장류, 인간 또는 가축을 포함할 수 있다. 가축의 일부 예는 개, 고양이 및 말이다.

조성물은 약 0.0001 % 내지 약 100중량%의 생균제를 조성물의 전체 중량에 대해 포함할 수 있다. 경우에 따라, 생균제는 조성물의 약 0.001 % 내지 약 50중량%, 또는 약 0.001 % 내지 약 10중량%, 또는 약 0.001 % 내지 약 5중량%일 수 있다. 조성물 중에서 생균제의 구강 위생적 유효량은 대상의 연령, 생균성 박테리아 종류, 투여 빈도, 투약 형태, 투여방법 및 대상의 공생하는 구강 미생물군의 가변성에 따라 어느 정도 달라진다. 예를 들어, 일반적으로 약 10⁷ 내지 10¹¹ 균총형성단위(CFU) 범위의 생균제 용량이 적합하고; 특히 로젠지(lozenge)의 경우, 로젠지 당 약 10⁸ 내지 10¹⁰ CFU 범위의 생균제 용량이 바람직하고, 최적량은 조성물 내 생균제의 균주 또는 균주들 및 투여빈도에 따라 다르고, 1일 1 내지 4 로젠지로 변화가능하다. 생균제는 편리한 시간, 예를 들어 양치 중 또는 양치 후, 또는 식사 중 또는 식사 후에 투여할 수 있다.

조성물은 생균제를 포함하고 당 분야에서 일반적으로 알려진 다른 성분, 예를 들어 하나 이상의 재광화제(remineralization agent), 프리바이오틱, 담체, 희석제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 다른 성분들은 바람직하게 약학적으로 허용가능하거나 적어도 구강 내 사용에 허용가능하다.

에스. 뮤탄스는 무기물 칼슘과 인산염을 용해하는 산을 분비하여 치아 바탕질을 부식하는 작용을 한다. 수개월의 산 분비 후에 탈회(demineralization)가 에나멜, 결국에는 상아질까지 번지게 된다. 이 단계에서는 가역적이지만, 더 진행되면 충치 형성을 유발하여 치아 보철이 필요하게 된다. 타액은 문제가 되는 산에 대한 천연 완충제로서뿐만 아니라 치아의 재광화를 위한 칼슘과 인산염의 공급원으로서 중요한 역할을 하여, 병리를 자연적으로 중단하거나 심지어 반전한다. 이후, 치아우식증 형성은 병원성 박테리아에 의한 탈회와 재광화의 동적 평형이다. 중재 및 예방적 치료는 대개 약물을 이러한 효과에 첨가하여 균형을 재광화로 기울이는데 집중하고 있다. 재광화제는, 예를 들어 카제인 포스페이트 펩티드-무정형 칼슘 포스페이트(CPP-ACP), β-트리칼슘 포스페이트, 무정형 칼슘 포스페이트의 나노입자 (NACP), 하이드록시아파타이트, 칼슘 글리세로포스페이트 또는 칼슘과 포스페이트의 다른 변형물을 포함한다. 재광화제는 조성물의 1 내지 10 wt%, 바람직하게 1 내지 4 wt%의 양으로 첨가할 수 있다. 또한, 플루오라이드(fluoride)는 재광화의 효과적인 촉매이기 때문에 수많은 치과제품에 첨가되며, 결정질 구조로 결합하여 원래보다 더 견고한 치아 표면을 생성한다. 특히 카제인 포스페이트 펩티드-무정형 칼슘 포스페이트(CPP-ACP)(그 내용이 본 원에 참고로 포함된 미국 특허 7,491,694 참조)가 특별하게 효과적이며, 왜냐하면 우유 단백질에서 유래된 결합 단백질이 결합하여 칼슘 포스페이트를 용이하게 생체이용가능한 가용성 무정형으로 안정화하기 때문이다. 탈회를 방지하는 생균제 제제와 재광화제, 특히 CPP-ACP의 조합은 치아우식증의 예방적 치료에 상당한 효능을 가질 것으로 예상된다.

조성물 중에 프리바이오틱을 포함하는 것은 특정 환경에서 생균제 효능을 강화한다. 프리바이오틱은 주로 미생물군에 영양을 공급하는 작용을 한다. "신바이오틱"이란 용어는 프리바이오틱과 생균제를 모두 함유하는 조성물을 말한다. 본 발명에 유용할 수 있는 프리바이오틱의 일부 예는, 예를 들어 모노-, 디- 및 올리고-사카라이드, 예컨대 만노스 프럭탄, 프럭토올리고사카라이드 (FOS), 자일로올리고사카라이드 (XOS), 폴리덱스트로스 및 갈락토올리고사카라이드 (GOS), 락툴로스, 타가토스(tagatose), 이눌린, 말토덱스트린, 락티톨 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 사용된 프리바이오틱의 양은 생균제의 양보다 훨씬 더 많으며, 예를 들어 프리바이오틱의 그람 양이 생균제의 밀리그람 양에 사용될 수 있다.

구강 조성물용 담체, 희석제 및 부형제는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 흡수제, 산성화제, 알칼리화제, 바인더, 완충제, 코팅제, 착색제, 방출조절제, 방출조절 담체, 희석제, 붕해제, 발포제, 향미제, 유동화제, 윤활제, 가소제, 용해도 증진제, 습윤제, 계면활성제, 보존제, 감미제, 풍미제 등을 포함한다. 일부 특이적 예는 락토스, 덱스트로스, 프럭토스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스(예를 들어, 미정질 셀룰로스), 워터 시럽, 물, 물/에탄올, 물/글리콜, 물/폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 또는 지방 물질, 예컨대 경지 또는 적합한 이들의 혼합물을 포함한다.

특히 바람직한 부형제 종류는 당 대용물이며, 이것은 감미제로 작용하고 혈당 농도에서 감소 또는 무시할 정도의 효과를 갖는다. 바람직하게, 당 대용물은 비-충치원성(non-cariogenic)이다. 이러한 당 대용물은, 예를 들어 당 알코올 (예를 들어, 이소말트), 스테비아(stevia), 아스파탐, 슈크랄로스, 네오탐, 아세설팜 포타슘 및 사카린을 포함한다. 스테비아와 이소말트가 특히 주목된다. 스테비아는 스테비올 글리코시드에 기초하며 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana) 식물의 추출물을 포함한다. 이소말트는 2개의 디사카라이드의 등몰 혼합물로, 각각은 2종의 당, 글루코스와 만니톨(α-D-글루코피라노시도-1,6-만니톨) 및 또한 글루코스와 소르비톨(α-D-글루코피라노시도-1,6-소르비톨)로 구성된다. 이소말트는 특히 본 발명 조성물의 안정성을 증진한다. 특정한 당 대용물(예를 들어, 이소말트)은 또한 프리바이오틱인 것으로 간주될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 대상에게 경구로 구강 내 또는 국소 투여 형태로 투여할 수 있다. 적합한 투여 형태는, 예를 들어 정제(예를 들어, 발포성 정제 및/또는 다중 층 정제), 환제, 분말, 로젠지(다중층 로젠지 포함), 향낭, 카세제(cachet), 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 캡슐, 페이스트(예를 들어, 치약), 식품 및 과자(예를 들어, 껌)를 포함한다. 이러한 투여 형태의 제제화는 당 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 안정성이 우수하여 적어도 24개월, 심지어 적어도 30개월의 기간 동안 실온(20-25℃)에서 유효한 CFU 카운트의 생균성 균주를 유지한다. 저장 수명은 특정한 보관조건(예를 들어, 2-8℃의 냉장조건) 및/또는 다양한 전달 시스템, 예컨대 향낭/분말 스틱으로 36개월을 초과하여 연장가능하다.

조성물은 구강 위생용 조성물의 사용에 대한 설명서와 함께 상업적 포장의 형태로 시장에 공급할 수 있다. 상업적 포장은, 예를 들어 병, 단지, 블리스터 팩, 상자 등을 포함한다. 설명서는, 예를 들어 시각적 또는 청각적 형태, 예를 들어 서면, 그림, 사운드 및/또는 비디오 기록매체 또는 이들의 조합으로 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 특징들은 이하의 상세한 설명에서 기술되거나 명백해질 것이다.

이하, 본 발명을 보다 명확하게 이해할 수 있도록 본 발명의 구체예를 하기한 바와 같은 첨부된 도면을 참조로 하여 실시예에 의해 상세히 기술하였다.
도 1은 박테리아 도말(swabbing) 영역 및 저해 영역(ZOI)의 결정 방법을 나타낸 배양 플레이트의 구성도를 나타낸 것이다.
도 2는 에스. 뮤탄스 염색체의 종 특이적 DNA 세그먼트에 대한 PCR 증폭의 1.5% 아가로스 겔을 나타낸 것이다. 에스. 뮤탄스 25175 기준주를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 3은 에스. 뮤탄스 25175에 대한 생균제 개별 및 2종의 모든 가능한 조합의 지연된 길항작용 실험의 정량을 나타낸 그래프이다. 실험은 0.1% CaC0₃로 pH를 조절한 BHI 아가를 사용하여 적어도 4회 반복하였다.
도 4는 새로 단리된 에스. 뮤탄스 13에 대한 생균제 개별 및 2종의 모든 가능한 조합의 지연된 길항작용 실험의 정량을 나타낸 그래프이다. 실험은 0.1% CaC0₃로 pH를 조절한 BHI 아가를 사용하여 적어도 4회 반복하였다.
도 5는 새로 단리된 에스. 뮤탄스 14에 대한 생균제 개별 및 2종의 모든 가능한 조합의 지연된 길항작용 실험의 정량을 나타낸 그래프이다. 실험은 0.1% CaC0₃로 pH를 조절한 BHI 아가를 사용하여 적어도 4회 반복하였다.
도 6은 새로 단리된 에스. 뮤탄스 15에 대한 생균제 개별 및 2종의 모든 가능한 조합의 지연된 길항작용 실험의 정량을 나타낸 그래프이다. 실험은 0.1% CaC0₃로 pH를 조절한 BHI 아가를 사용하여 적어도 4회 반복하였다.
도 7은 항미생물 특성을 갖는 생균성 균주의 상이한 조합의 에스. 뮤탄스에 대한 상승적 길항작용을 나타낸 표이다. 적어도 4회 개별적으로 반복된 실험의 데이터로 일원배치 ANOVA에 의한 성분 균주 각각에 대해 비교하였다.
도 8은 생균성 균주의 상대적 과산화수소 생산 비교를 나타낸 표이다. +++: 24 시간 이내, ++: 48 시간 이내, +: 72 시간 이내, -: 생성 없음.
도 9는 다양한 생균성 균주, 및 에스. 뮤탄스 균주들의 인간 기관지 상피세포주 16HBE14o-에 대한 부착(adhesion)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 다양한 생균성 균주와 에스. 뮤탄스 25175의 응집을 비교한 그래프를 나타낸 것이다. Bonferroni post hoc 시험으로 일원배치 ANOVA에 의해 비교하였다(*p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001).

명세서 전체에서 속/종 명칭과 균주 표시에 대해 언급하였다. 종종 유기체의 분류가 달라지고 주어진 유기체가 상이한 명칭 및/또는 균주 표시로 지칭될 수 있다. 본 원에서 언급된 생균제 유기체는 유기체의 명칭 및/또는 균주 표시의 변화와 무관하게 동일하게 유지되는 특정한 게놈을 갖는다. 게놈으로부터, 당 업자라면 제공된 유기체가 어떠한 명칭 및/또는 균주 표시를 가지던지 본 명세서에 포함되는 지를 용이하게 결정할 수 있다.

실시예 1: 에스 . 뮤탄스 단리와 DNA 추출

플라크를 멸균 프로브를 사용하여 모으고 상이한 4 대상으로부터 유래한 mitis salivarius-bacitracin 에스. 뮤탄스 선택성 아가에 직접 도포한 다음, 48시간 동안 37℃에서 미호기성(microaerophilic) 조건으로 인큐베이션하였다. 이후, 각각의 콜로니를 BHYE 플레이트에 사분 도말한 다음, 다시 48시간 동안 37℃에서 미호기성 조건으로 인큐베이션하였다. 후속 유전자형 확정(genotyping)을 단리된 콜로니에 대해 수행하여 그의 종을 확인하였다. 박테리아 DNA를 InstaGene Matrix (BioRad)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 추출하였다. 요약하면, 단일 콜로니를 채취하여 1ml의 멸균 H₂O에 분산하였다. 이 혼합물을 1분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 펠릿에 200 μL의 IntaGene Matrix를 첨가하고 샘플을 신속하게 보텍싱하여 55℃에서 20분 동안 수조 중에서 인큐베이션하였다. 이후, 샘플을 꺼내어 가열 수조에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 다시 보텍싱한 다음 3분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 모으고 PCR에서 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

PCR 시약은 모두 Invitrogen에서 입수하였다. 추출 DNA 샘플에 대해 1X PCR 완충액, 15 mM MgCl₂, 200 mM dNTP 믹스, 10 μM MUT-F 프라이머, 10 μM MUT-R 프라이머, 5U의 Taq DNA 폴리머라제, 10 μL의 DNA 템플레이트, 및 ddH₂0를 함유하는 반응 혼합물 중에서 50 μL의 최종부피로 PCR을 수행하였다. 프라이머가 에스. 뮤탄스의 gtfB 세포외 글루코실트랜스퍼라제를 코딩하는 517-bp DNA 영역을 증폭하였다(Oho 2000).

MUT-F: 5' - ACT ACA CTT TCG GGT GGC TTG G - 3' (서열번호: 1)

MUT-R: 5' - CAG TAT AAG CGC CAG TTT CAT C - 3' (서열번호: 2)

95℃에서 1분 동안 초기 분해, 이어서 95℃에서 30초 동안 30 사이클의 분해, 59℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 1분 동안 연장을 열순환 조건으로 하였다. 72℃에서 5분 동안의 최종 연장단계를 포함하였다. 이후, PCR 생성물을 DNA 로딩 완충액과 혼합하고 1.5% 아가로스 겔과 0.05% EtBr을 사용하여 100V에서 45분 동안 분리하여 UV광 여기 하에 이미지화하였다.

실시예 2: 지연된 길항작용(Deferred Antagonism)

에스. 뮤탄스에 대한 생균제의 길항작용을 시험하기 위해 지연된 길항작용을 본질적으로 Tagg와 Bannister(Tagg 1979)가 이전에 수행한 바와 같이 실시하였다. 액체 배양물을 락토바실리 또는 비피도박테리아에 대한 MRS, 및 스트렙토코시에 대한 BHYE에 접종한 다음, 37℃에서 밤새 미호기성 조건으로 인큐베이션하였다. 도 1과 관련하여, 오버나잇 현탁액을 0.1 % (w/v) CaC0₃를 포함하는 BHI 또는 CB 플레이트에 측정된 1cm 폭의 횡선 내에 멸균 면봉을 사용하여 도말하였다. BHI 플레이트는 18.5 g 뇌심장 침출액(BHI, Difco), 7.5 g 아가 (Fisher) 및 1 g CaC0₃(Sigma)를 함유하였다. CB 플레이트는 22 g Columbia blood (Difco), 7.5 g 아가 (Fisher) 및 1 g CaC0₃(Sigma)를 함유하였다. 이후, 플레이트를 37℃에서 미호기성 조건으로 인큐베이션하였다. 48시간 후에 박테리아 생장을 현미경 유리 슬라이드로 긁어내고, 플레이트를 클로로포름 증기로 20분 동안 재멸균하였다. 이후, 기준주 에스. 뮤탄스 ATCC25175와 4개의 새로운 단리물의 오버나잇 현탁액을 수직교차하여 도말하고, 플레이트를 다시 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 저해영역(ZOI)을 생균제가 직접 플레이팅된 1 cm를 제외한, 박테리아 생장의 두 영역간 거리로 계산하였다. Prism 4 (GraphPad)를 사용하여 통계처리를 수행하였다. 일원배치 ANOVA를 사용하여 특정 생균제와 생균제 조합을 비교하였다. 상승작용은 개별 처리의 합을 조합된 처리로 나눈 상승적 지수로서 계산하였다. 1초과의 값이 조합의 상승작용을 나타낸다(Wang 2012).

치아우식증에서 생균제 가능성이 있는 균주를 결정하기 위해 에스. 뮤탄스 길항작용 스크리닝을 시판되는 다양한 생균제 균주에 대해 수행하였다. 먼저, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 병원균의 새로운 단리물을 에스. 뮤탄스 선택적 mitis salivarius-bacitracin 아가 플레이트에 4 개별 대상의 플라크 샘플을 플레이팅하여 얻었다. 콜로니들을 에스. 뮤탄스 특이적 마커 서열의 존재에 대해 유전자형 확정하였고, 기준주 에스. 뮤탄스 ATCC 25175와 비교하였다(도 2). 4개의 단리물이 선택되었다(대상 당 1).

4개 단리물과 에스. 뮤탄스 25175에 대한 지연된 길항작용 어세이를 2개 배지 타입에서 수행하여 길항작용을 갖는 생균성 균주를 신속하게 스크린하였다. 표 1은 임의의 복제물, 및 이 실험에서 어세이된 5 균주에 대한 저해영역(ZOI)의 존재 또는 부재를 나타낸 것이다. 균주, 스트렙토코커스 살리바리우스 K12, 스트렙토코커스 살리바리우스 M18, 락토바실루스 플란타룸 SD5870, 엘. 헬베티쿠스 R0052, 및 비피도박테리아 롱검 SD5846 (통상적으로 비피도박테리아 롱검 BI-05로 알려짐)이 양 아가 타입 모두에서 길항작용을 갖는 것으로 관찰된 반면, 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10의 경우 BHI 아가에서만 길항작용이 나타났다. 따라서, BHI 아가를 후속 정량적 지연 길항작용 실험에서 사용하였다. 길항작용을 정량하기 위해, 실험을 각 생균성 박테리아에 대해 적어도 4회 그리고 8회의 별도 실험으로 반복하였고, 저해영역을 특이적으로 측정하였다. 모든 생균성 박테리아 균주의 동등한 혼합물을 2개의 가능한 모든 조합으로 잠재적 상승작용 효과에 대한 시험에서 평가하였다. 5종의 병원성 균주의 ZOI를 측정하고 4번의 실험에 대해 평균하였다. 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.

일반적으로, 에스. 뮤탄스의 배양물 수집 균주는 새로운 단리물과 비교하여 생균제가 분비한 길항인자에 대해 훨씬 더 저항성이 있는 것으로 입증되었다(도 3). 예를 들어, 단일 생균제 실험에서, 에스. 뮤탄스 25175에 대해서는 길항작용이 전혀 관찰되지 않은 반면, 에스. 뮤탄스 13에 대해서는 비. 롱검 SD5846을 제외한 6개 생균제 모두 길항적이었다. 단일 균주로서 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 엘. 헬베티쿠스 R0052는 4개의 새로 단리된 에스. 뮤탄스 모두를 상쇄(antagonize)할 수 있는 반면, 에스. 살리바리우스 K12, 및 엘. 플란타룸 SD5870은 4개 중 3개를 상쇄하였다. 에스. 살리바리우스 M18은 4개의 병원성 단리물 중 2개를 상쇄하였고, 비. 롱검 SD5846은 하나만을 상쇄하였으며, 이들에 대한 평균 ZOI는 모든 경우에서 다른 생균제 균주보다 비교적 약했다.

평균 ZOI는 대부분의 경우에서 2개 균주를 동등한 양으로 함께 조합하고 특정한 박테리아가 다른 것들보다 더 잘 조합하는 것으로 보일 때 더 컸다. 예를 들어, 단리한 에스. 뮤탄스 15의 경우에(도 6), 2개 균주의 가능한 15종의 조합 중에서 7종이 가장 큰 저해를 나타낸 개별 생균제, 엘. 헬베티쿠스 R0052의 ZOI보다 더 컸다. 이러한 7종의 조합 중에서 6종이 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10 또는 엘. 플란타룸 SD5870을 함유하였다. 이것은 모든 병원성 균주; 에스. 뮤탄스 단리물 13, 14, 15, 및 17, 또는 에스. 뮤탄스 25175를 저해하는 각각의 경우에서 일치하였고, 4개의 가장 큰 ZOI는 항상 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10 또는 엘. 플란타룸 SD5870을 함유하는 조합이었다.

도 7은 길항작용의 계산된 상승작용과 함께 평균 저해영역(ZOI)을 나타낸 것이다. 성분 균주 각각과 비교하여 조합에 대한 일원배치 Anova로 계산된 ZOI의 유의차를 나타내었다. 상승몫(synergistic quotient)(SQ)은 생균제 조합의 ZOI를 개별적으로 측정된 조합 성분 ZOI의 합으로 나눈 상대적 상승작용을 나타낸다. 50%의 상승작용을 초과하는 조합(SQ >1.5)은 진하게 표시하였다. NA는 길항작용이 없음을 나타내고, US는 길항작용이 단지 조합에서만 관찰되므로, 측정되지 않는 상승작용을 나타낸다. 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 비. 롱검 SD5846의 조합 및 엘. 플란타룸 SD5870과 엘. 헬베티쿠스 R0052의 조합은 모두 각각의 성분들보다 에스. 뮤탄스 균주를 훨씬 더 상쇄하였다. 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 비. 롱검 SD5846의 조합은 에스. 뮤탄스 균주 25175, 13, 14, 15, 및 17 각각에 대해 시험했을 때 US, 1.8, 3.7, 2.4, 및 2.2로 매우 상승적으로 작용하였다. 엘. 플란타룸 SD5870과 엘. 헬베티쿠스 R0052의 조합 또한 상승적으로, 각각 NA, 3.3, 1.5, 1.8, 및 1.6의 SQ를 나타냈다.

그러나, 흥미롭게도 2개의 상승적 조합 각각의 성분 박테리아(엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 엘. 플란타룸 SD5870)는 특별히 강력한 활성과, 함께 조합했을 때 상승작용을 유발하였다. 조합된 두 균주의 ZOI는 에스. 뮤탄스의 5개 균주 모두에 대해 큰 폭의 가장 높은 길항작용이었다. 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 엘. 플란타룸 SD5870의 ZOI는 사실상 에스. 뮤탄스의 모든 균주에 대해 함께 첨가된 두 균주 각각에 대한 ZOI보다 더 높았고, 이는 일원배치 ANOVA에 의해 매우 유의한 것이 입증되었다. 에스. 뮤탄스 25175에 대해서 두 생균제 균주 각각에 의한 저해는 전혀 없었지만, 두 균주를 함께 조합했을 때 상당한 저해(약 20 mm)가 있었다. 이는 생균제 간의 상승작용적 활성의 강력한 암시이며, 실제로 상승작용적 몫은 에스. 뮤탄스 25175, 13, 14, 15, 및 17 각각의 균주에 대해 US, 3.4, 3.9, 4.2 및 4.2였다.

실시예 3: 과산화수소 생산

과산화수소 생산을 시험하기 위해 Kang 등(Kang 2011)이 최근 사용한 방법과 매우 유사한 일반적으로 사용되는 방법을 적용하였다. 본질적으로, 표준 아가 성장배지(락토바실리 또는 비피도박테리아의 경우 MRS, 스트렙토코시의 경우 BHYE)를 0.25 mg/mL 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.1 ng/mL 퍼옥시다제를 첨가하여 변형하였다. 요약하면, 0.125 g의 TMB와 5 mg의 퍼옥시다제를 1 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)와 물 각각에 용해하였다. 이 용액들을 0.2 μm 시린지 필터를 사용하여 멸균하고 오토클레이브 후 <50℃로 냉각한 다음, 0.5 L의 액체 아가 배지에 즉시 첨가하였다. 이후, 플레이트를 따랐다. 생균제의 개별 콜로니들을 스톡 플레이트에서 취하여 TMB/퍼옥시다제 아가와 표준 아가 대조용 플레이트에 접종 루프를 사용하여 직접 도말하였다. 이후, 플레이트를 37℃에서 미호기성 조건으로 72시간 동안 방치하였다. 콜로니와 주위 아가를 정상 MRS 또는 BHYE 도말 대조용 플레이트와 비교하여 24시간 마다 청색 또는 적색으로의 색상 변화를 평가하였다. 실험을 3회 반복하였다.

많은 락토바실리가 과산화수소를 주위 박테리아에 대한 길항작용제로 생산하기 때문에 균주의 과산화수소 생산을 평가하였다. 시험된 11개의 락토바실러스 균주 중 10개가 약간의 과산화수소를 생산한 것을 확인하였다. 에스. 살리바리우스는 생산하지 않았지만, 2개의 에스. 써모필루스와 5개의 비피도박테리아 모두 다양한 정도의 H₂0₂를 생산하였다(도 8). 에스. 뮤탄스 길항작용을 갖는 것으로 관찰된 모든 균주는 전부 H₂0₂를 생산하는 가장 빠른 것들 중에 있고, 에스. 써모필루스를 제외하고 플레이팅한 24시간 내에 H₂0₂를 생산하는 것이 관찰되었다.

실시예 4: 세포 표면 부착

세포 배양 시약은 달리 언급되지 않는 한 GIBCO로부터 입수하였다. 불멸화 인간 기관지 상피 세포주 16HBE14o-를 10% FBS와 2 mM L-글루타민이 보충된 MEM 배지에서 배양하고, 표준 세포 배양 방법을 사용하여 37℃, 5% C0₂에서 유지하였다. 세포를 조직배양 처리된 24-웰 플레이트의 웰에서 웰 당 약 1 x 10⁵ 세포의 농도로 접종하여 밀집되도록 배양하였다(약 48 시간, 웰 당 약 5 x 10⁵ 세포). 이후, 세포 배지를 흡인하고 100배 희석의 다양한 정지상 박테리아 세포 현탁액을 함유하는 500 μL의 새로운 배지로 대체하여, 이것을 MRS (락토바실리와 비피도박테리아) 또는 BHYE (스트렙토코시)에서 밤새 배양하였다. 이후, 플레이트를 37℃, 5% C0₂에서 인큐베이션하였다. 5시간 후에, 배양 배지를 흡인하고 단일층을 PBS로 3회 완전히 세척하여 느슨하지 않게 부착되어 있는 박테리아를 떼어냈다. Triton™ X-100을 0.1%의 최종 농도로 첨가하여 진핵세포를 분해하였다. 용균 현탁액에 함유된 남아있는 부착 CFU를 드롭(drop) 플레이트 방법으로 계산하였다. 10^-6까지의 연속 희석을 96웰 플레이트에서 10배 스텝으로 수행하고, 10 μL의 다양한 희석액을 3번 적절한 아가(락토바실리와 비피도박테리아의 경우 MRS, 스트렙토코시의 경우 BHYE)에 점적하였다. 아가 플레이트를 37℃, 미호기성 조건으로 24시간 동안 인큐베이션한 다음, CFU를 계산하였다. 부착은 16HBE14o- 세포의 박테리아가 없는 대조용 웰의 세포 계수로 측정된 웰 내의 기관지 세포수로 나눈 전체 CFU로 보고하였다.

그 효과를 전달하기 위해, 박테리아를 구강 내에서 에스. 뮤탄스와 동시 적용(localize)해야 할 수 있다. 생균제 박테리아의 구강 내 체류 능력을 시험하기 위해, 결합 친화도 어세이를 수행하였다(도 9). 이 어세이에서는 구강 상피세포와 세포 계통을 공유하고 표현형에서 이들과 유사한 16HBE14o- 인간 기관지 상피세포의 단일층에 대한 박테리아의 부착을 시험하였다. 박테리아를 MEM 배지에 접종하고 5시간 동안 배양한 다음, 자유 박테리아를 세척 제거하고, 남아있는 분해된 진핵 세포와 박테리아 세포 혼합물로 CFU를 계수하였다. 일반적으로, 에스. 뮤탄스 병원균은 세포에 잘 부착하지 않았고, 또한 시험된 락토바실리도 잘 부착하지 않는 것을 확인하였다(도 9). 그러나, 원래 인간 경부에서 단리한 에스. 살리바리우스는 그에 비해 매우 단단하게 부착되었다.

실시예 5: 에스 . 뮤탄스와의 공동응집

다양한 생균제 박테리아 또는 에스. 뮤탄스를 1 mL의, 락토바실리 또는 비피도박테리아용 액체 MRS, 또는 스트렙토코시용 BHYE에 접종한 다음, 37℃에서 미호기성 조건으로 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 튜브를 2000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상청액을 흡인한 다음, 1 mL의 PBS에 재현탁하였다. 이 단계를 3회 반복하였다. 현탁된 세포를 100 μL PBS로 128배까지 2배 연속 희석 단계로 96웰 플레이트에서 연속 희석하였다. 흡광도를 플레이트로부터 600 nm에서 EON 마이크로플레이트 리더(BioTek)를 사용하여 판독하였다. 얻어진 데이터로부터 흡광도 vs. 희석 곡선을 만들고, 흡광도 0.3에 대한 희석을 시험된 각 박테리아에 대해 외삽하였다. 200 μL의 현탁된 박테리아를 함유하는 트리플리케이트 웰을 96 웰 플레이트에서 외삽법에 따라 직접 희석하였다. 각각의 박테리아에 대해 100 μL의 동일한 희석액도 100 μL의 희석된 에스. 뮤탄스와 함께 첨가하였다. 혼합물을 다중채널 피펫으로 웰을 상하 피펫팅하여 균일하게 분산하였다. 이후, 플레이트를 멸균 투명 플라스틱 필름으로 밀봉하여 PBS 공액과 함께 37℃의 마이크로플레이트 리더에서 즉시 인큐베이션하였다. 6시간 후에 웰을 600 nm에서 판독하였다.

에스. 뮤탄스에 부착하여 직접적으로 상호작용하는 균주의 능력을 응집 어세이를 통해서도 평가하였다(도 10). 개별 균주, 및 에스. 뮤탄스와의 동등한 부분 혼합물도 37℃로 인큐베이션할 때 600 nm에서 흡광도 변화에 대해 어세이하였다. 상승된 흡광도는 각 균주와 개별적으로 비교했을 때 응집으로 인한 더 빠른 침강을 나타낸다. 실험에서는 에스. 뮤탄스가 생체막없이 자가 응집하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 엘. 헬베티쿠스 (LAFTI L10 또는 R0052) 균주를 첨가하므로써 단독 박테리아와 비교하여 흡광도가 상당히 증가하였다.

실시예 6: 시험관 내 효과에 대한 논의

특정한 박테리아 균주의 고유한 성질이 구강 건강의 개선과 에스. 뮤탄스로 인한 치아우식증 감소를 위한 구강 미생물군 환경을 변경하는 능력을 갖는 것이 입증되었다. 이러한 결론은 엘. 헬베티쿠스 (LAFTI L10 및 R0052)속의 균주가 시험된 모든 균주, 예를 들어 치아우식증의 치료에서 잘 알려진 균주인 에스. 살리바리우스 M18과 엘. 람노수스(L. rhamnosus) GG보다 더 양호하게 병원균 에스. 뮤탄스를 저해한다는 특별한 사실에 의해 뒷받침되었다.

다음으로, 엘. 플란타룸 SD5870과 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10 균주들 사이에는 매우 병원성인 에스. 뮤탄스 균주뿐만 아니라 새로 단리된 5종의 에스. 뮤탄스 균주를 저해하는 그의 조합 능력에 있어서 실질적이고 상당한 상승작용이 있다. 시험관 내에서 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10의 에스. 뮤탄스와의 공동응집은 또한 구강 내에 효과를 적용하고 전달하는 그의 강력한 잠재능을 분명하게 보여준다. 마지막으로, 생균제 조합은 치아우식증의 시험관 내 모델에서 함께 조합했을 때 상승적 에스. 뮤탄스 감소능을 갖는 것으로 나타났다. 이전에 2 이상의 상이한 생균제 조합은 일반적으로 하나의 생균제 단독보다 저해능이 낮은 것으로 관찰되었기 때문에 이러한 사실은 예기치 않은 것이다. 조합은 일반적으로 낮은 저해를 유발할 수 있는데, 왜냐하면 조합 내의 상이한 생균제가 서로를 저해할 뿐만 아니라 서로 경쟁할 수 있기 때문이다. 단일 생균제와 비교하여 동일한 수준의 저해를 유지하는 것도 예상하지 않은 것인데, 하물며 생균제 조합 사이의 상승작용을 발견하였다.

몇몇의 박테리아 균주는 다양한 메카니즘을 통해서 치아우식증 병원균에 영향을 주는 것으로 확실하게 입증되었다. 특히, 에스. 살리바리우스 M18은 시험관 내와 임상시험 모두에서 항-에스. 뮤탄스 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 생균성 락토바실러스 람노수스 GG가 단기 및 장기 시험에서 항-치아우식증 효과를 갖는 것을 입증하는 상당한 임상연구 결과도 있다. 본 발명에서는 생균성 박테리아 중 몇몇 균주가 그의 에스. 뮤탄스 길항작용에서 이러한 생균제를 초과하는 것을 증명하였다. 에스. 뮤탄스 균주의 길항작용이 엘. 람노수스 GG를 사용하여 관찰되지 않은 반면, 에스. 살리바리우스 M18을 사용하여 상당한 길항작용이 관찰되었다. 그러나, 엘. 플란타룸 SD5870, 비. 롱검 SD5846, 및 관련 균주 에스. 살리바리우스 K12를 포함하는 시험된 생균제의 몇몇 균주는 적어도 하나의 에스. 뮤탄스 균주에 대해 에스. 살리바리우스 M18보다 모두 더 큰 길항작용을 가지는 것으로 관찰된 반면, 시험된 2종의 엘. 헬베티쿠스 균주(LAFTI L10 및 R0052)는 사실 시험된 모든 균주에 대해 더 크거나 또는 동등한 길항작용을 갖는 것이 눈에 띈다.

가장 중요한 것은 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10 균주가 엘. 플란타룸 SD5870과 조합했을 때 강력한 항-에스. 뮤탄스 상승작용이 시험된 5종의 병원균 모두에서 관찰되었다는 것이다. 관찰된 길항작용은 다른 어떤 개별적인 생균성 균주 또는 시험된 조합보다 이 조합에서 더 강력하였고, 길항작용에 있어서 함께 첨가된 2종의 개별 생균제보다 5종의 에스. 뮤탄스 균주 모두에 대해 적어도 3배 더 효과적이었다.

어떤 대사 메카니즘이 이러한 상승작용의 기저를 이루는지 알려지지 않았지만, 일부 엘. 헬베티쿠스 균주가 헬베티신 J, 및 헬베티신 V-1829처럼 박테리오신을 분비하고, 또한 엘. 플라타룸의 균주는 다양한 벡테리오신과 핀 위치(pin locus)에서 코딩된 다른 항미생물 물질을 갖고, 그의 분비는 쿼럼(quorum) 메카니즘에 의해 조절된다고 알려져 있다. 엘. 플란타룸 SD5870이 어떤 항미생물 인자를 발현하는 지는 모르지만, 이들의 발현은 가변적이나 엘. 플란타룸 균주들 중에서 비교적 흔한 것으로 생각된다. 에스. 뮤탄스를 상쇄하는 항미생물 펩티드는 특히 두 생균제에 의해 분비될 때 상보적 치사율의 조합으로 효과적일 수 있다.

에스. 뮤탄스 길항작용을 갖는 4종의 비-스트렙토코시 균주가 모두 가장 강력한 H₂O₂ 생산체에 속하는 것은 흥미로운 일이다. 에스. 살리바리우스 K12와 M18이 특정한 박테리오신의 분비를 통해 항-에스. 뮤탄스 활성을 나타낼 수 있는 반면, 엘. 플란타룸 SD5870 및 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10은 H₂O₂의 분비를 통해 적어도 부분적으로 항-에스. 뮤탄스 활성을 나타내는 것으로 보인다. 에스. 뮤탄스는 과산화수소를 생산 및 분해할 수 있는 것으로 보고되었지만, 그럼에도 불구하고 또한 아마도 한계 농도에서 과산화수소에 쉽게 영향받을 수 있다. 생체 내에서 에스. 뮤탄스 주위에 편재된 과산화수소의 농도는 또한 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 에스. 뮤탄스에서 관찰된 직접 응집에 의해 증가하고, 그에 의해서 고도의 길항작용이 달성되는 추가인자로 작용한다.

이 사실은 여기서 엘. 헬베티쿠스가 에스. 뮤탄스에 대한 상당한 길항작용을 갖고, 또한 엘. 헬베티쿠스 LAFTI L10과 엘. 플란타룸 SD5870의 특이적 조합이 상승적으로 작용하여 구강 건강의 시험관 내 모델에서 에스. 뮤탄스의 성장을 상쇄 및 저해한다는 결론을 뒷받침한다. 이러한 사실은 치아우식증의 미생물학 기반 치료 전략에서 중요한 의미를 갖는다.

실시예 7: 생체 내 효과

생체 내 효과는 다음과 같이 측정할 수 있다. 그룹 당 30-40명을 대상으로 무작위, 이중맹검, 플라시보 조절 임상시험을 수행한다. 대상을 최소 10억 CFU의 엘. 헬베티쿠스 LAFTI l10 및 엘. 플란타룸 SD5870의 동일 투여량으로 1일 2회 생균제 로젠지로 양치질 후에 28-30일 동안 치료한다. 고도 민감성 주파수 영역 적외선 광열 방사선 측정과 변조 발광을 사용하여 측정했을 때 >20%의 불안정한 탈회 표면적 검출의 감소를 예상할 수 있다. 에스. 뮤탄스와 플라크 농도의 감소 또한 예상된다.

카제인 포스페이트 펩티드-무정형 칼슘 포스페이트(CPP-ACP) 또는 다른 재광화제를 첨가하면 다음과 같이 상당한 생체 내 효과를 나타내게 될 것으로 예상된다. 그룹 당 30-40명을 대상으로 무작위, 이중맹검, 플라시보 조절 임상시험을 수행한다. 시험은 다음과 같은 4개 그룹을 포함한다: 대상을 최소 10억 CFU의 엘. 헬베티쿠스 LAFTI l10 및 엘. 플란타룸 SD5870의 동일 투여량으로 치료한 제1 처리그룹; 대상을 10억 CFU의 엘. 헬베티쿠스 LAFTI l10과 엘. 플란타룸 SD5870의 조합 및 유효량의 CPP-ACP 또는 다른 재광화제로 치료한 제2 처리그룹; 대상을 유효량의 CPP-ACP 또는 다른 재광화제로 치료한 제3 처리그룹; 및 대상을 플라시보 대조군으로 처리한 제4 처리그룹. 시험은 1일 2회 생균제 로젠지의 투여로 양치질 후에 28-30일 동안 지속하였다. 고도 민감성 주파수 영역 적외선 광열 방사선 측정과 변조 발광을 사용하여 측정했을 때 >20%의 불안정한 탈회 표면적 검출의 감소를 예상할 수 있다. 에스. 뮤탄스와 플라크 농도의 감소 또한 예상된다.

실시예 8 - 로젠지 제제 및 안정성

7/16 인치의 둥근 모양 로젠지를 표 2에 따라 제제화하였다.

로젠지의 밀봉된 포장을 실온(20-25℃) 및 60-65%의 주위 습도로 보관하였다. 박테리아를 로젠지로부터 지정된 시점에 산업 표준 선택적 플레이트 도말방법에 따라 배양하였다. 따라서, 로젠지를 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해하고, 연속 희석하여 에스. 살리바리우스(CABK12)의 선택 아가와 락토바실리(Rogosa) 아가 플레이트에 3번 플레이팅하였다. 37℃에서 미호기성 조건으로 48시간 배양한 후 CFU를 계수하였다. 27개월 후에도 실질적으로 여전히 살아있는 생균제 균주는 로젠지 당 적어도 약 4x10⁸ CFU였다. 생균제 건강 이점을 제공하는 실질적이고 적절한 수의 살아있는 박테리아가 존재하였다.

실시예 9 - 기존 제품의 지연된 길항작용

상업적으로 입수가능한 생균제 제품을 상기한 지연된 길항작용 어세이로 시험하였다. 표 3은 각 제품에 대한 생균성 박테리아 조성을 나타낸 것이다.

요약하면, 각 제품의 로젠지 1정을 5 mL의 1X PBS에 2시간 동안 37℃에서 멸균 조건 하에 교반하여 용해하였다. 이후, 면봉으로 용해물을 BHI와 CaC0₃가 보충된 BHI 아가 플레이트의 직경을 가로지르는 1 cm 폭의 횡선 내에 도포하였다. 플레이트들을 48시간 동안 37℃에서 미호기성 조건으로 인큐베이션한 다음, 배양된 박테리아를 옮기고 아가를 멸균하였다. 이후, 상이한 에스. 뮤탄스 균주 5종(ATCC 균주 및 Integra 단리물 13, 14, 15 및 17)을 생균제 횡선에 수직하여 플레이트를 가로질러 면봉으로 도말한 다음, 다시 48시간 동안 배양하였다. 이 과정을 2회 반복하였고, 각각은 각 조건에 대해 3회 사용하였다. 본 발명의 조성물과 달리, 상업적으로 입수가능한 시험된 생균제 제품의 각 조건에서의 6개 복제물에 대해 어떠한 성장 저해도 관찰되지 않았다.

또한, 실시예 8에 기술된 본 발명의 로젠지를 27개월 동안 보관한 후 로젠지 당 약 4x10⁸ CFU의 생균제 박테리아 계수는 시험된 기존 제품과 비교하여 월등하고, 시험된 기존 제품의 절반 이상보다 상당히 더 우수하였다.

참고문헌: 각각의 전체 내용은 참고로 포함되었다.

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본 발명의 신규한 특징은 본 발명의 상세한 설명의 실험으로 당업자들에게 자명하게 될 것이다. 그러나, 청구항의 범위가 실시예에 열거된 바람직한 구체예들에 의해 제한되는 것이 아니라, 전체적으로 명세서와 일치하는 가장 광범위한 설명을 제공하는 것으로 이해되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Integra Medical Inc. Ioudina, Natalya Seferovic, Maxim <120> Oral Compositions <130> INT-0002-PCT <150> US 61/843,158 <151> 2013-07-05 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 actacacttt cgggtggctt gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cagtataagc gccagtttca tc 22

Claims

락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주를 포함하는 생균제(probiotic)의 구강 위생 유효량을 포함하는, 구강 위생용 조성물.
제1항에 있어서, 락토바실루스 헬베티쿠스 균주가 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10, 락토바실루스 헬베티쿠스 R0052 또는 그의 혼합물인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 락토바실루스 헬베티쿠스 균주가 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 다른 생균제 박테리아를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 하나 이상의 락토바실리(lactobacilli)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 락토바실루스 플란타룸 SD5870을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 헬베티쿠스 균주 및 락토바실루스 플란타룸 균주로 구성되는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 헬베티쿠스 균주 및 락토바실루스 플란타룸 SD5870으로 구성되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10 및 락토바실루스 플란타룸 SD5870으로 구성되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 헬베티쿠스 R0052 및 락토바실루스 플란타룸 SD5870으로 구성되는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 하나 이상의 비피도박테리아를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 헬베티쿠스 LAFTI L10 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) SD5846으로 구성되는 것인 조성물.
락토바실루스 플란타룸 SD5870을 포함하는 생균제의 치아우식증 방지 유효량을 포함하는, 치아우식증 치료 또는 방지용 조성물.
제14항에 있어서, 생균제가 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 생균제가 스트렙토코커스 살리바리우스 M18을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생균제가 스트렙토코커스 살리바리우스 K12를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제14항에 있어서, 생균제가 본질적으로 락토바실루스 플란타룸 SD5870 및 스트렙토코커스 살리바리우스 M18로 구성되는 것인 조성물.
비피도박테리움 롱검 SD5846을 포함하는 생균제의 치아우식증 방지 유효량을 포함하는, 치아우식증 치료 또는 방지용 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재광화제(remineralization agent)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제20항에 있어서, 재광화제가 카제인 포스페이트 펩티드-무정형 칼슘 포스페이트를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프리바이오틱(prebiotic)을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 담체, 희석제, 부형제 또는 그의 혼합물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에서 정의된 조성물을 대상에게 경구 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 구강 상태 또는 질환을 치료 또는 방지하는 방법.
제24항에 있어서, 대상이 인간, 개, 고양이 또는 말인 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 조성물이 정제, 환제, 분말, 로젠지, 향낭, 카세제(cachet), 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 캡슐, 페이스트, 식품 또는 과자로 제제화되는 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 조성물이 치약, 껌 또는 발포정으로 제제화되는 것인 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구강 상태 또는 질환이 치아우식증, 구취, 치은염, 구강 궤양, 아프타성(aphthous) 구내염, 칸디다증 및/또는 치주 질환을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치아우식증을 치료 또는 방지하는 것인 방법.
대상의 구강 위생을 위한 락토바실루스 헬베티쿠스 균주의 용도.
대상의 구강 위생을 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에서 정의된 조성물의 용도.
대상의 구강 위생용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에서 정의된 조성물의 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 조성물이 정제, 환제, 분말, 로젠지, 향낭, 카세제(cachet), 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 캡슐, 페이스트, 식품 또는 과자로 제제화되는 것인 용도.
제31항 또는 제32항에 있어서, 조성물이 치약, 껌 또는 발포정으로 제제화되는 것인 용도.
제30항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상이 인간, 개, 고양이 또는 말인 것인 용도.
제30항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구강 위생이 치아우식증, 구취, 치은염, 구강 궤양, 아프타성(aphthous) 구내염, 칸디다증 및/또는 치주 질환의 방지 또는 치료를 포함하는 것인 용도.
제30항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치아우식증을 치료 또는 방지하는 것인 용도.
락토바실루스 헬베티쿠스 균주와 대상의 구강 위생에서 그의 용도에 대한 설명서를 포함하는 상업적 포장.
제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에서 정의된 조성물과 대상의 구강 위생에서 그의 용도에 대한 설명서를 포함하는 상업적 포장.
제39항에 있어서, 조성물이 정제, 환제, 분말, 로젠지, 향낭, 카세제(cachet), 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 캡슐, 페이스트, 식품 또는 과자로 제제화되는 것인 상업적 포장.
제39항에 있어서, 조성물이 치약, 껌 또는 발포정으로 제제화되는 것인 상업적 포장.
제38항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상이 인간, 개, 고양이 또는 말인 것인 상업적 포장.
제38항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구강 위생이 치아우식증, 구취, 치은염, 구강 궤양, 아프타성(aphthous) 구내염, 칸디다증 및/또는 치주 질환의 방지 또는 치료를 포함하는 것인 상업적 포장.
제35항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구강 위생이 치아우식증의 치료 또는 방지를 포함하는 것인 상업적 포장.