JP6908998B2 - 口腔組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年7月5日に提出された米国仮特許出願USSN 61/843,158の利益を主張し、該文献の全内容は、本明細書に援用される。
本発明は、経口投与のためのプロバイオティクス組成物に関する。特に、本発明は、改善された健康、特に改善された口腔の健康、などの有益な効果を持つプロバイオティクス組成物に、そして該組成物を投与する方法に関する。
[1]口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactobacillus helveticus)株を含む、前記組成物。
[2]ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10、ラクトバチルス・ヘルベチクスR0052またはその混合物である、[1]に記載の組成物。
[3]ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10である、[1]に記載の組成物。
[4]プロバイオティクスが、別のプロバイオティクス細菌をさらに含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[5]プロバイオティクスが、1つのまたはそれより多いラクトバチルス属をさらに含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[6]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)株をさらに含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。
[7]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムSD5870をさらに含む、[1]〜[6]のいずれかに記載の組成物。
[8]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム株から本質的になる、[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[9]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、[1]〜[8]のいずれかに記載の組成物。
[10]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、[1]に記載の組成物。
[11]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスR0052およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、[1]に記載の組成物。
[12]プロバイオティクスが、1つのまたはそれより多いビフィドバクテリウム属をさらに含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[13]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10およびビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)SD5846から本質的になる、[1]に記載の組成物。
[14]齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕の予防に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・プランタルムSD5870を含む、前記組成物。
[15]プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)をさらに含む、[14]に記載の組成物。
[16]プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスM18をさらに含む、[14]または[15]に記載の組成物。
[17]プロバイオティクスが、ストレプトコッカス・サリバリウスK12をさらに含む、[14]から[16]のいずれかに記載の組成物。
[18]プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムSD5870およびストレプトコッカス・サリバリウスM18から本質的になる、[14]に記載の組成物。
[19]齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕を予防するために有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ロングムSD5846である、前記組成物。
[20]再ミネラル化剤をさらに含む、[1]〜[19]のいずれかに記載の組成物。
[21]再ミネラル化剤が、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウムを含む、[20]に記載の組成物。
[22]プレバイオティクスをさらに含む、[1]〜[21]のいずれかに記載の組成物。
[23]キャリアー、希釈剤、賦形剤またはそのいずれかの混合物をさらに含む、[1]〜[22]のいずれかに記載の組成物。
[24]対象において、口腔状態または疾患を治療するかまたは予防する方法であって、[1]〜[23]のいずれか一項に定義するような組成物を、対象に経口投与する工程を含む、前記方法。
[25]対象がヒト、イヌ、ネコまたはウマである、[24]に記載の方法。
[26]組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、[24]または[25]に記載の方法。
[27]組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、[24]または[25]に記載の方法。
[28]口腔状態または疾患が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および/または歯周病を含む、[24]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29]齲蝕を治療するかまたは予防するための[24]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[30]対象における口腔衛生のためのラクトバチルス・ヘルベチクス株の使用。
[31]対象における口腔衛生のための[1]〜[23]のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
[32]対象における口腔衛生用の薬剤調製のための、[1]〜[23]のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
[33]組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、[31]〜[32]のいずれかに記載の使用。
[34]組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、[31〜32のいずれかに記載の使用。
[35]対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、[30]〜[34]のいずれかに記載の使用。
[36]口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および/または歯周病を予防するかまたは治療することを含む、[30]〜[35]のいずれかに記載の使用。
[37]齲蝕を治療するかまたは予防するための、[30]〜[36]のいずれかに記載の使用。
[38]ラクトバチルス・ヘルベチクス株、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
[39][1]〜[23]のいずれか一項に定義するような組成物、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、商業的パッケージ。
[40]組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、[39]に記載の商業的パッケージ。
[41]組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、[39記載の商業的パッケージ。
[42]対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、[38]〜[41]のいずれかに記載の商業的パッケージ。
[43]口腔衛生が、齲蝕、口臭、歯肉炎、口腔内潰瘍、アフタ性口内炎、カンジダ症および/または歯周病を予防するかまたは治療する工程を含む、[38]〜[42]のいずれかに記載の商業的パッケージ。
[44]口腔衛生が、齲蝕を治療するかまたは予防する工程を含む、[35]〜[40]のいずれかに記載の商業的パッケージ。
本発明の1つの側面において、口腔衛生において使用するための組成物であって、口腔衛生に有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactobacillus helveticus)株を含む、前記組成物を提供する。
4人の異なる被験者から、無菌プローブを用いて歯垢を収集し、そしてミティス・サリバリウス−バシトラシンS.ミュータンス選択寒天上に直接スプレッドし、そして次いで微好気性条件下で、37℃で48時間インキュベーションした。次いで、個々のコロニーをBHYEプレート上に四分円でストリークし、そして次いで、微好気性条件下で、37℃で48時間、再びインキュベーションした。続いて、単離されたコロニーに対して遺伝子型決定を行い、種を確認した。InstaGeneマトリックス(BioRad)を用い、製造者の説明書と同様に、細菌DNAを抽出した。簡潔には、単一コロニーを摘み取り、そして1mLの無菌H2O中に分散させた。次いで、この混合物を10,000rpmで1分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。ペレットに、200μLのIntaGeneマトリックスを添加し、試料を迅速にボルテックスし、そして水槽中、55℃で20分間インキュベーションした。次いで、試料を取り除き、そして沸騰した水槽で30分間インキュベーションした。次いで、試料を再びボルテックスし、そして次いで、10,000rpmで3分間遠心分離した。上清を収集し、そしてPCRのために使用するまで、−20℃で保存した。
S.ミュータンスに対するプロバイオティクスのアンタゴニズムを試験するため、本質的にTaggおよびBannister(Tagg 1979)によって以前実行されたように、繰延アンタゴニズムを行った。液体培養物を、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属のいずれかに関してはMRSに、そしてストレプトコッカス属に関してはBHYEに接種し、そして次いで微好気性条件下で、37℃で一晩インキュベーションした。図1を参照すると、次いで、無菌コットンスワブを用いて、測定された1cm幅のストリークで、0.1%(w/v)CaCO3を含むBHIまたはCBプレート上に、一晩の懸濁物をスワブした。BHIプレートは、18.5μgのブレインハートインフュージョン(BHI、Difco)、7.5g寒天(Fisher)および1g CaCO3(Sigma)を含有した。CBプレートは、22gのコロンビア血液(Difco)、7.5g寒天(Fisher)および1g CaCO3(Sigma)を含有した。次いで、プレートを微好気性条件下、37℃でインキュベーションした。48時間後、細菌増殖物をガラス顕微鏡スライドで掻き取り、そしてプレートをクロロホルム蒸気で20分間再滅菌した。次いで、基準株S.ミュータンスATCC25175の一晩の懸濁物および4つの新鮮な単離体を垂直にストリークし、そしてプレートを再度インキュベーションした。48時間後、細菌増殖の2つの領域間の距離からプロバイオティクスを直接プレーティングした部分の1cmを減じたものとして、阻害ゾーン(ZOI)を計算した。Prism4(GraphPad)を用いて、統計を行った。一元配置ANOVAを用いて、特定のプロバイオティクスおよびプロバイオティクスの組み合わせの間を比較した。個々の処置の合計を組み合わせ処置で割った相乗指数として、相乗作用を計算した。>1の値は組み合わせの相乗作用を示す(Wang 2012)。
5つのS.ミュータンス株に対する繰延アンタゴニズムアッセイの定性的観察に基づく、ZOIの存在または非存在
過酸化水素産生を試験するため、Kangらによって最近用いられたもの(Kang 2011)と非常に類似の、一般的に用いられる方法論を使用した。本質的には、標準的寒天増殖培地(ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属のいずれかに関してはMRS、およびストレプトコッカス属に関してはBHYE)を、0.25mg/mL 3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)および0.1ng/mLペルオキシダーゼの添加によって改変した。簡潔には、0.125gのTMBおよび5mgのペルオキシダーゼを1mLのジメチルスルホキシド(DMSO)および水にそれぞれ溶解した。0.2μmシリンジフィルターを用いてこれらの溶液を滅菌し、そしてオートクレーブ後、冷却して<50℃になったら直ちに、0.5Lの液体寒天培地に添加した。次いで、プレートに注いだ。プロバイオティクスの個々のコロニーをストックプレートから摘み取り、そして接種ループを用いて、TMB/ペルオキシダーゼ寒天および標準的寒天対照プレート上に直接ストリークした。次いで、プレートを37℃で微好気性条件下に72時間放置した。正常MRSまたはBHYEストリーク対照プレートと比較することによって、24時間ごとに、青または赤いずれかへの色の任意の変化に関して、コロニーおよび周囲の寒天を評価した。実験を3回反復した。
別に述べない限り、細胞培養試薬をGIBCOから得た。不死化ヒト気管支上皮細胞株16HBE14o−を、10%FBSおよび2mM L−グルタミンを補充したMEM培地中で増殖させ、そして37℃および5%CO2で、標準細胞培養法を用いて維持した。細胞を、1×105細胞/ウェルの濃度で、組織培養処理24ウェルプレートのウェル中に植え付け、そして集密まで増殖を可能にした(約48時間、およそ5×105細胞/ウェル)。次いで、細胞培地を吸引し、そして多様な安定期細菌細胞懸濁物の100倍希釈を含有する500μLの新鮮な培地と交換し、これをMRS(ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属)またはBHYE(ストレプトコッカス属)中で一晩増殖させた。次いで、プレートを37℃および5%CO2でインキュベーションした。5時間後、培地を吸引し、そして単層をPBSで3回よく洗浄して、しっかり(non−loosely)接着している細菌を除去した。次いで、最終濃度0.1%までTritonTM X−100を添加することによって、真核細胞を破壊した。次いで、溶解懸濁物中に含有される残った接着CFUの計数を、ドロップ・プレート法によって行った。10−6までの連続希釈を10倍段階で96ウェルプレート中で行い、10μLの多様な希釈を次いで、3つ組で適切な寒天(ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に関してはMRS、そしてストレプトコッカス属に関してはBHYE)上にスポッティングした。寒天プレートを、微好気性条件下、37℃で24時間インキュベーションし、その後、CFUを計数した。16HBE14o−細胞の細菌不含対照ウェルの細胞カウントによって決定されるようなウェル中の気管支細胞数によって総CFUを割ったものとして、接着を報告した。
多様なプロバイオティクス細菌またはS.ミュータンスを、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属いずれかの場合は1mLの液体MRS、あるいはストレプトコッカス属の場合はBHYEに接種し、そして次いで、微好気性条件下で、37℃で一晩インキュベーションした。次いで、試験管を2000rpmで5分間遠心分離し、そして上清を吸引し、そして次いで、1mL PBS中で再懸濁した。この工程を3回反復した。次いで、懸濁した細胞を100μL PBS中に、2倍連続希釈工程で128倍まで、96ウェルプレート中で、連続希釈した。EONマイクロプレートリーダー(BioTek)を用いて、600nmでプレートから吸光度を読み取った。生じたデータから、希釈に対する吸光度の曲線を生成し、そして0.3の吸光度に関する希釈を、試験した各細菌に関して外挿した。200μLの懸濁細菌を含有する3つ組ウェルを、外挿にしたがって、96ウェルプレート中で直接希釈した。各細菌に関して、100μLの同じ希釈物をまた、100μLの希釈したS.ミュータンスと一緒に添加した。マルチチャネルピペットでウェルを上下にピペッティングすることによって、混合物を均一に分散させた。次いで、無菌透明プラスチックフィルムでプレートを密封し、そして次いで、PBSブランクとともに、マイクロプレートリーダー中で、直ちに37℃でインキュベーションした。6時間後、ウェルを600nmで読み取った。
細菌の特定の株のユニークな特性が、口腔健康状態の回復、および齲蝕を引き起こすS.ミュータンスの減少に向けて、口腔微生物フローラ環境を改変する潜在能力を有することが、本明細書で立証されてきている。この結論は、種、L.ヘルベチクス(LAFTI L10およびR0052)が、齲蝕の治療においてよく確立された株であるS.サリバリウスM18およびL.ラムノスス(L. rhamnosus)GGを含めて、試験したすべての株よりも、優れて病原体S.ミュータンスを阻害するという明確な知見によって補強される。
in vivo効果は以下のように決定可能である。群あたり30〜40人の被験者で、ランダム化二重盲検プラセボ対照臨床試験を行う。被験者を、28〜30日の期間、歯磨きの後に、最低10億CFUの等用量のL.ヘルベチクスLAFTI l10およびL.プランタルムSD5870で1日2回、プロバイオティクス・ロゼンジ剤で処置した。高感度周波数領域赤外線光熱放射測定(highly sensitive frequency−domain infrared photothermal radiometry)および調節された発光を用いて決定した際、>20%の齲蝕前(precarious)脱ミネラル化表面積の検出の減少が予期される可能性がある。S.ミュータンスおよび歯垢レベルの減少もまた予期される。
7/16インチ丸形のロゼンジ剤を、表2にしたがって処方する。
上述のような繰延アンタゴニズムアッセイで、商業的に入手可能なプロバイオティクス製品を試験した。表3は、各製品に関するプロバイオティクス細菌組成物を提供する。
Claims (33)
- ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)により生じる口腔状態または疾患の治療または予防において使用するための組成物であって、有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactobacillus helveticus)株を含み、口腔状態または疾患が、齲蝕、および歯周病から選択され、ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10、ラクトバチルス・ヘルベチクスR0052またはその混合物である、前記組成物。
- ラクトバチルス・ヘルベチクス株が、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10である、請求項1記載の組成物。
- プロバイオティクスが、別のプロバイオティクス細菌をさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、1つのまたはそれより多いラクトバチルス属をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)株をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・プランタルムSD5870をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルム株から本質的になる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクス株およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、請求項1に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスR0052およびラクトバチルス・プランタルムSD5870から本質的になる、請求項1に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、1つのまたはそれより多いビフィドバクテリウム属をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクスが、ラクトバチルス・ヘルベチクスLAFTI L10およびビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)SD5846から本質的になる、請求項1に記載の組成物。
- 齲蝕を治療するかまたは予防する際に使用するための組成物であって、齲蝕を予防するために有効な量のプロバイオティクスを含み、プロバイオティクスがビフィドバクテリウム・ロングムSD5846である、前記組成物。
- 再ミネラル化剤をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 再ミネラル化剤が、カゼインリン酸ペプチド−非結晶性リン酸カルシウムを含む、請求項14に記載の組成物。
- プレバイオティクスをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- キャリアー、希釈剤、賦形剤またはそのいずれかの混合物をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒト、イヌ、ネコまたはウマから選択される対象に投与する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項1〜18のいずれか一に項記載の組成物。
- 組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 齲蝕を治療するかまたは予防するための請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 対象における口腔衛生用の薬剤調製のための、請求項1〜17のいずれか一項に定義するような組成物の使用。
- 組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項22に記載の使用。
- 組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項22に記載の使用。
- 対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項22〜24のいずれか一項に記載の使用。
- 口腔衛生が、齲蝕、および/または歯周病を予防するかまたは治療することを含む、請求項22〜25のいずれか一項に記載の使用。
- 齲蝕を治療するかまたは予防するための、請求項22〜26のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項1〜21のいずれか一項に定義する組成物、および対象における口腔衛生においてそれを使用するための説明書を含む、ストレプトコッカス・ミュータンスにより生じる口腔状態または疾患の治療または予防において使用するための商業的パッケージであって、口腔状態または疾患が齲蝕、および歯周病から選択される、前記商業的パッケージ。
- 組成物が、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、カプセル、ペースト、食品または菓子として処方される、請求項28に記載の商業的パッケージ。
- 組成物が、歯磨き粉、チューインガムまたは発泡錠として処方される、請求項28に記載の商業的パッケージ。
- 対象が、ヒト、イヌ、ネコまたはウマである、請求項28〜30のいずれか一項に記載の商業的パッケージ。
- 口腔衛生が、齲蝕、および/または歯周病を予防するかまたは治療することを含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の商業的パッケージ。
- 口腔衛生が、齲蝕を治療するかまたは予防することを含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の商業的パッケージ。
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