CN111700916A - 一种益生菌组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种益生菌组合物及其应用。该组合物包含乳双歧杆菌（Bifidobacteriumlactis）HN019和乳酸杆菌，所述乳酸杆菌包含植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）CECT 7481和短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CECT 7480。通过研究表明，三种菌株具有协同增效作用，制备得到的益生菌组合物能够在口腔定植，并且对口腔变异链球菌起到拮抗作用，抑制其在口腔定植，从而起到预防和降低变异链球菌引起的龋齿严重程度的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种益生菌组合物及其应用。
背景技术
乳酸菌（LAB）一直以来被公认为提供健康益处的益生菌，且乳酸菌（LAB）为常用食品补充剂。在过去的研究中，诸多实验已证实乳酸菌与肠道健康有关，并且大多数临床与实验数据集中于预防胃肠道感染范畴，关注口腔卫生保健方面之研究相对少见。近些年来，随着微生物技术的进步，人们逐渐认识到口腔微生态系统与口腔健康的存在着重要的关联。
口腔是作为一个开放的环境，存在着复杂的微生态系统，该系统微生物的动态平衡，与口腔健康，甚至消化道后端的各项功能都息息相关。研究显示，口腔微生物呈现丰富的生物多样性，以牙菌斑为例，其中所含微生物可达700种以上，其中数量最多的包含链球菌及乳酸菌等。常见的口腔问题，如口臭、龋齿、牙周炎、牙龈炎等都与口腔菌群的失衡（致病菌增加）有关。
龋齿是口腔常见疾病，龋洞中的微生物都是以牙菌斑生物膜的形式定植在龋洞中。革兰阳性球菌和杆菌在龋洞中的检出率很高，其中变异链球菌是龋的优势菌，另外也检出多种革兰阴性球菌和杆菌，甚至还有一定数量的真菌，其中白色念珠菌占优势，如在儿童，成年人及老年人的龋齿中白色念珠菌的检出率都很高。研究显示，变异链球菌Streptococcus mutans是龋齿的主要致病菌，其与口腔中的碳水化合物共同作用，形成的有机酸（主要是乳酸）不断地侵蚀包裹在牙齿外面的牙釉质，进而使牙齿硬组织发生去矿化作用而形成龋齿。
因此，研究开发一种预防龋齿作用的益生菌组合物具有重要的研究意义。
发明内容
鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种益生菌组合物，该组合物中各菌株协同增效，对口腔变异链球菌起到拮抗作用，抑制其在口腔定植，调节口腔微生物环境，从而达到预防和缓解龋齿的效果。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包含乳双歧杆菌HN019（Bifidobacteriumlactis）和乳酸杆菌，所述乳酸杆菌包含植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）CECT 7481和短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CECT 7480。
本发明所述的乳双歧杆菌HN019、植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480均来源于市购。
作为进一步的优选，所述乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌的CFU数比例为（1-10）:1，
更优选为（2-5）:1。
作为进一步的优选，所述乳酸杆菌中植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的
CFU数比例为1:（0.1-10），更优选为1：（0.5-3）。
本发明还提供了上述的益生菌组合物在制备预防龋齿的食品、保健食品或药物中的应用，本发明制备得到的益生菌组合物能够在口腔定植，并且对口腔变异链球菌起到拮抗作用，抑制其在口腔定植，从而起到预防和降低变异链球菌引起的龋齿严重程度的作用。
作为一种具体实施方式，本发明还提供了一种食品，包含有效量的上述益生菌组合物和食品学上可接受的辅料。作为优选，所述食品学上可接受的辅料包含但不限于：麦芽糊精、抗性糊精、乳糖、淀粉、膳食纤维、微晶纤维素、糖醇（如甘露糖醇）、助流剂（如硬脂酸镁）、甜味剂、香精、色素等。
作为另一种具体实施方式，本发明还提供了一种药物制剂，包含有效量的上述的益生菌组合物和药学上可接受的辅料。作为优选，所述药物制剂的剂型为粉剂、片剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂、胶囊剂或液体剂。
作为另一种具体实施方式，本发明还提供了一种口腔健康护理制品，包含有效量的上述食品，所述食品，包含有效量的益生菌组合物和食品学上可接受的辅料，所述益生菌组合物包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，所述乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480。
作为另一种具体实施方式，本发明还提供了一种口腔健康护理制品，包含有效量的药物制剂，所述药物制剂包含有效量的益生菌组合物和药学上可接受的辅料，所述益生菌组合物包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，所述乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480。
作为优选，所述口腔健康护理制品为口香糖、牙膏、口腔喷雾剂、锭剂或口腔分散片。
本发明所述的食品、药物制剂、口腔健康护理制品以本领域常规方法制备成常规形式进行包装使用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供一种益生菌组合物，该组合物包含乳双歧杆菌HN019、植物乳杆菌CECT7481和短乳杆菌CECT 7480。通过研究表明，三种菌株具有协同增效作用，制备得到的益生菌组合物能够在口腔定植，并且对口腔变异链球菌起到拮抗作用，抑制其在口腔定植，从而起到预防和降低变异链球菌引起的龋齿严重程度的作用。
附图说明
图1为体视显微镜下各组大鼠磨牙观察图；
图2为3D重建大鼠牙体组织扫描示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
乳双歧杆菌HN019，植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480均由市场购买取得。
实施例1：
一种益生菌组合物，包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌的CFU数比例为3:1，其中，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的CFU数比例为1:1。
实施例2：
一种益生菌组合物，包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌的CFU数比例为6:1，其中，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的CFU数比例为1:2。
实施例3：
一种益生菌组合物，包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌的CFU数比例为1:1，其中，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480，乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的CFU数比例为1:5。
预防龋齿效果试验
1. 实验动物与分组
实验动物：SPF级Wistar雄性大鼠，3周龄，体重40~50 g，共60只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号SCXK（京）2012-0001）。
根据体重将大鼠随机分为6组（n=10）（表1），空白对照组（CF组）实验过程中正常饮食，模型组（C组）和预防组（P1、P2、P3、P4）均喂食致龋饲料Diet2000（购自于南通特洛菲饲料科技有限公司），并饮用添加有5%蔗糖的蒸馏水。其中致龋饲料Diet 2000的主要成分如下：全麦粉6%，蔗糖56%，精炼奶粉28%，苜蓿叶粉3%，脱水全干粉1%，酵母4%，盐2%；预防组P2为单独的乳双歧杆菌HN019；预防组P3为植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的混合物，二者CFU数比例为1:1；预防组P4为实施例1益生菌组合物。
表1大鼠实验分组情况
2.实验方法
大鼠随机分组，喂养普通饲料和含氨苄西林（1 g/L）的水3天，第4天换用蒸馏水以洗脱抗生素残留，从第5天开始给模型组和预防组喂养致龋饲料和蔗糖水，空白组（CF组）喂养普通饲料和蒸馏水，直至实验结束。第5天从大鼠口腔中取样检验大鼠口腔原始菌群情况。
模型组（C组）在第6~10 天一共经历连续5天的白色念珠菌和变异链球菌混合菌的侵染。用棉签蘸取109 CFU的菌液（白色念珠菌和变异链球菌混合菌），涂抹于大鼠牙面，作用15 s。侵染结束后立即做口腔定植检测，之后每2周重复定植检测。
对于干预组，在第6~10 天，P1组连续涂抹0.02%的洗必泰、P2、P3、P4组分别连续涂抹益生菌菌液（参照表1），菌液浓度为109 CFU/ml。涂抹结束后，做益生菌定植检测。确定益生菌定植之后，4个预防组连续5天的白色念珠菌和变异链球菌混合菌的侵染。用棉签蘸取109 CFU的菌液（白色念珠菌和变异链球菌混合菌），涂抹于大鼠牙面，作用15 s。侵染结束后立即做口腔乳酸杆菌、双歧杆菌、变异链球菌和白色念珠菌的数量进行计数，之后每2周重复定植检测。
大鼠口腔菌群计数：
菌落计数使用3种固体平板，分别为TYCSB培养基加200 U/L的杆菌肽对变异链球菌进行计数；添加50 mg/L莫匹罗星和添加500 mg/L的半胱氨酸盐酸盐的改良MRS固体培养基对大鼠口腔中的乳双歧杆菌进行计数；普通MRS固体培养基对大鼠口腔中的乳双歧杆菌和植物乳杆菌组合进行总菌数计数；BIGGY固体培养基对白色念珠菌计数。
大鼠体重：
每两星期对大鼠进行称重，比较各组大鼠生长情况。
大鼠龋齿得分：
体式显微镜观察龋齿结果：剥离牙齿颌骨上的软组织，超声清洗颌骨20 min，洗掉牙缝里的残留渣滓，将上下颌骨泡于10%多聚甲醛中24 h，结束后洗净晾干。配制0.4%紫脲酸铵染液，将上下颌骨泡于染液中12 h，取出后清水漂洗干净，晾干后用金刚砂片沿大鼠的上下和磨牙牙面近远中向矢状半切，在体视显微镜下观察、评估大鼠磨牙龋损情况。
评分标准为：染色后的大鼠磨牙的龋损部位呈现出红色，而正常的未龋损部位几乎没有染色或者颜色很浅。
Micro-CT观察: 用手术刀剥离大鼠下颌骨，剔除所有软组织，下颌骨样本用活体micro-CT影像系统进行X射线扫描成像。以固定阈值将牙釉质与下颌骨分离并计算牙釉质的体积。
实验结果
3.1大鼠体重
每隔两个星期对大鼠进行称重，各组大鼠的生长情况良好，体重稳步上升，空白组与各预防组之间的体重增量都无显著性差别（P > 0.05）。表明本发明的益生菌组合物对大鼠生长无影响。
大鼠口腔菌群计数
大鼠口腔原始菌群检测未发现有变异链球菌和白色念珠菌。致病菌侵染后，模型组变异链球菌的定植为105cfu/mL，白色念珠菌定植到103cfu/mL，说明成功定植致病菌至动物口腔。对于预防组，先用益生菌进行处理，益生菌计数结果分别为P2>104cfu/mL，P3>104cfu/mL, P4>105cfu/mL，可判断已定植。P4组的定植数量显著高于P2和P3组（P> 0.05），说明乳双歧杆菌和乳酸杆菌的组合可获得更好的益生菌定植数量 (表2)。
表2益生菌在口腔定植情况计数结果
注：表中数字为各组口腔益生菌计数平均值，不同小写字母表示不同实验组间显著差异（p<0.05），相同字母表示差异不显著（p>0.05）。
由表2可以看出，益生菌定植后，再用致病菌侵染，口腔中益生菌仍然可以保持较高的数量(P2 >103cfu/mL，P3 >103cfu/mL，P4 >104cfu/mL)，说明定植于口腔的益生菌，可持续在口腔发挥作用。
对于变异链球菌的计数结果表明（表3），相对于模型组，P1、P2、P3、P4组干预后，治病菌侵染期间，都能显著抑制变异链球菌在口腔的定植（P＜0.01），而其中P4组的抑制效果优于P2和P3。随着时间推移，致病菌侵染14天后，P1组的变异链球菌数略有上升，与模型组差异不显著，说明洗必泰无法发挥长效保护作用。而P2、P3和P4组的变变异链球菌数量持续下降，与模型组有显著性差异（P＜0.01）。致病菌侵染28天后，P2、P3和P4组的变变异链球菌数量仍然持续下降，与模型组有显著性差异（P＜0.05）。P4组的抑制效果持续优于P2和P3（P<0.05）, 说明本发明所述的乳双歧杆菌和乳酸杆菌的组合具有更好的长效保护作用。
表3各组口腔变异链球菌的计数结果
注：表中数字为各组口腔益生菌计数平均值，不同小写字母表示不同实验组间显著差异（p<0.05），相同字母表示差异不显著（p>0.05）。
对于白色念珠菌的计数，对几次取样的结果进行组间比较，发现P1、P2、P3、P4组的最终白念计数结果与模型组之间无统计学差别，说明干预物对白色念珠菌无显著抑制。
大鼠磨牙龋损情况
染色结果显示(图1)，模型组（C组）的红色最明显，龋损最严重，说明利用变异链球菌和白色念珠菌联合造模成功；空白对照组（CF组）几乎没有被染上颜色，说明没有龋损。P4组无龋损，说明乳双歧杆菌HN019、植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的组合物对龋齿具有有效的预防效果。
显微断层扫描技术（Micro computer tomography, micro-CT）可提供高分辨率图像以及对牙齿进行定性和定量分析，是评估牙齿硬组织和矿密度的可靠方法。完整的3D重建的牙体硬组织显示，模型组的龋损部位以及剥离的釉质的缺失情况，而空白对照组无龋损，釉质完整，符合预期（图2）。洗必泰预防组（P1）出现的一定的龋损部位，与模型组无显著差异。而预防组P2和预防组P3，有轻微牙釉质减少，但显著优于模型组和P1组。P4组无明显龋损，牙釉质完整，更优于P2和P3组，牙釉质体积接近于空白组（分别为2.8 mm3和2.9mm3）。说明该发明的益生菌组合物相较于各菌株单独使用，有更好的预防效果（表4）。
表4大鼠牙釉质体积
以上结果显示，本发明选用乳双歧杆菌（Bifidobacteriumlactis）HN019、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）CECT 7481和短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CECT 7480制备的益生菌组合物显示出良好的保护口腔健康的功效，尤其是在预防龋齿的发生上。本发明显示，所选乳双歧杆菌和乳酸杆菌组合使用，能发挥协同作用，在预防龋齿功能上优于其单独使用。
Claims (10)
1.一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包含乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌，所述乳酸杆菌包含植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480。
2.根据权利要求1所述的一种益生菌组合物，其特征在于，所述乳双歧杆菌HN019和乳酸杆菌的CFU数比例为（1-10）:1，优选为（2-5）:1。
3.根据权利要求1所述的一种益生菌组合物，其特征在于，所述乳酸杆菌中植物乳杆菌CECT 7481和短乳杆菌CECT 7480的CFU数比例为1:（0.1-10），优选为1:（0.5-3）。
4.根据权利要求1～3任一项所述的益生菌组合物在制备预防龋齿的食品、保健食品或药物中的应用。
5.一种食品，包含有效量的权利要求1～3任一项所述的益生菌组合物和食品学上可接受的辅料。
6.一种药物制剂，包含有效量的权利要求1～3任一项所述的益生菌组合物和药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为粉剂、片剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂、胶囊剂或液体剂。
8.一种口腔健康护理制品，包含有效量的权利要求5所述的食品。
9.一种口腔健康护理制品，包含有效量的权利要求6所述的药物制剂。
10.根据权利要求8或9所述的口腔健康护理制品，其特征在于，所述口腔健康护理制品为口香糖、牙膏、口腔喷雾剂、锭剂或口腔分散片。
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