CN113144002A

CN113144002A - 一种维持口腔健康的益生菌组合物及其应用

Info

Publication number: CN113144002A
Application number: CN202110276171.7A
Authority: CN
Inventors: 刘成; 彭浩
Original assignee: Beijing Yikangbeier Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Yikangbeier Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-15
Also published as: CN113144002B

Abstract

本发明公开了一种维持口腔健康的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：益生菌粉剂和植物粉剂，其中，所述益生菌粉剂包括嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、长双歧杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌，所述植物粉剂包括西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物。本发明的益生菌组合物能够有效防治牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡和口臭等疾病，并具有预防龋齿、护理牙龈、坚固牙齿的作用，还可以达到清新口气的作用，所述组合物可以制成漱口水、牙膏、牙齿凝胶、牙粉、泡沫、口腔喷雾剂等形式的制剂。

Description

一种维持口腔健康的益生菌组合物及其应用

技术领域

本发明属于日化用品领域，特别是涉及一种维持口腔健康的益生菌组合物及其应用。

背景技术

口腔是消化道的开始，人类口腔是一个完整而复杂的生态系统，适宜的温度、湿度、pH值和营养供应，为口腔各种微生物的生长、定居、繁殖提供了良好的环境条件。口腔中微生物种类繁多，多达700余种，除了包括各种细菌、真菌，还有病毒和支原体等。它们寄生在口腔粘膜、牙齿、舌头上以及唾液中，正常情况下，口腔菌群以错综复杂的共栖方式保持着各菌落间的相对平衡，微生物与宿主的机体之间也保持着一种动态平衡。这种平衡维持着人体口腔的健康状态。一旦由于外在因素或者机体内部因素打破该平衡，口腔内各菌群失调，就会影响口腔健康，甚至会诱发各种口腔疾病，如龋齿、牙周炎、牙龈炎、口臭和口腔溃疡等。

牙周病的病因是特定的革兰氏阴性厌氧菌感染引起口腔内菌群失调，导致菌群与宿主机体免疫系统不协调。龋齿病发病率高、分布广，被世界微生组织列为仅次于肿瘤和心血管疾病的重点防治疾病。变形链球菌是目前被公认的主要致龋菌，该菌能在牙齿表面形成牙菌斑生物膜，为致病菌的聚集和生长提供微生态环境，增强致病菌本身的致病力，还能增强其对宿主免疫系统和抗生素治疗的抵抗作用。定殖于牙齿表面、牙周袋内以及舌背部的口腔细菌，特别是口腔厌氧菌代谢唾液、血液、龈沟液、衰亡的中性粒细胞、脱落的上皮细胞以及口腔内食物残留中的蛋白质类、多肽类及黏蛋白等产生挥发性硫化物是引起口臭的主要原因。有研究指出90％的口臭来源于口腔，也有部分来自消化道，而益生菌能够同时解决口腔和肠道问题。

过去，益生菌的研究主要集中在胃肠道领域，近几年来，益生菌开始应用于各种口腔疾病的防治，成为口腔疾病防治技术研究的新兴领域。目前，已知的益生菌有近20种，可大致分为五类：乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母菌属、链球菌属以及其它细菌。其中乳杆菌属和双歧杆菌属是最早被发现并研究的口腔益生菌。唾液链球菌也是一种很好的口腔益生菌，在防治咽炎、口臭、口腔念珠菌等口腔疾病中发挥着重要作用。经过人们不懈的努力，利用益生菌在防治牙周炎、牙龈炎、口臭等方面已经取得了一定的成效。

发明内容

本发明的目的是针对口腔中的牙龈炎、牙周炎、口臭和口腔溃疡等口腔疾病提供一种维持口腔健康的益生菌组合物及其应用。

本发明的上述目的是通过如下方案实现的：

第一方面，本发明提供一种维持口腔健康的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括益生菌粉剂和植物粉剂；

所述益生菌粉剂包括嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、长双歧杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌；

所述植物粉剂包括西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物。

在一些实施方案中，本发明的益生菌组合物中益生菌粉剂和植物粉剂的重量比为1:(0.1～1)，优选重量比为1:(0.1～0.6)，更优选重量比为1:(0.5～0.6)。

在一些实施方案中，所述益生菌粉剂包含如下重量份的组分：有效活菌数为1×10¹⁰cfu的嗜酸乳杆菌10～30份，有效活菌数为1×10¹⁰cfu的乳酸乳球菌10～30份，有效活菌数为1×10¹⁰cfu的长双歧杆菌20～40份，有效活菌数为1×10¹⁰cfu的唾液链球菌20～40份，有效活菌数为1×10¹⁰cfu的嗜热链球菌10～30份。

在一些实施方案中，所述植物粉剂中西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物的重量比为(0.4～0.8):(1～1.2):(1～1.2)，优选的重量比为(0.4～0.8):1:1，更优选的重量比为0.5:1:1。

本发明中所述的薄荷提取物的植物来源为唇形科植物蒲荷(Mentha haplocalyxBriq.)的地上部分，经过溶剂提取、过滤、纯化、浓缩、干燥，得到薄荷提取物，主要含挥发油，油中主要为薄荷醇、薄荷酮及薄荷酯类等。本发明的薄荷提取物可以自制，也可商购获得。

本发明中所述的茉莉花提取物的植物来源为木犀科植物茉莉(Jasminum sambac(L.)Ait)的花。本发明的茉莉花提取物可以自制，也可商购获得。

在一些实施方案中，所述益生菌组合物为冻干粉剂；

优选地，所述冻干粉剂的粒径为200～300μm。

第二方面，本发明提供所述益生菌组合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

将嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、长双歧杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌按重量份混合，得到益生菌粉剂；将西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物按重量比例混合，得到植物粉剂；将益生菌粉剂与植物粉剂按重量比例混合，得到所述益生菌组合物。

第三方面，本发明提供一种益生菌制剂，所述益生菌制剂包括本发明所述的益生菌组合物。

在一些实施方案中，所述益生菌制剂为漱口水、牙膏、牙齿凝胶、牙粉、泡沫或口腔喷雾剂的形式。

在一些实施方案中，每克所述益生菌制剂中，总的有效活菌数为1～10×10¹⁰cfu，优选为3～5×10¹⁰cfu。

第四方面，本发明还提供所述益生菌组合物或所述益生菌制剂在制备用于维持口腔健康的药品和/或保健品中的应用。

在一些实施方案中，所述维持口腔健康包括防治牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡、口臭，预防龋齿，护理牙龈，坚固牙齿，以及清新口气。

本发明的有益效果体现在以下方面：

本发明提供的益生菌组合物可用于维持口腔健康，能够有效防治牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡和口臭等疾病，并具有预防龋齿、护理牙龈、坚固牙齿的作用，还可以达到清新口气的作用。

本发明提供的益生菌组合物可以根据不同的需要制成各种制剂，包括漱口水、牙膏、牙齿凝胶、牙粉、泡沫、口腔喷雾剂等，应用方式灵活。

附图说明

图1为不同益生菌口腔制剂对口源性大鼠口臭模型的影响。

图2为不同益生菌口腔制剂对大鼠IL-6水平的影响。

图3为不同益生菌口腔制剂对大鼠TNF-α水平的影响。

图4为不同益生菌口腔制剂对牙龈指数、菌斑指数和探诊出血指数的影响。

图5为大鼠血液中IL-6和TNF-α含量。

具体实施方式

本发明提供一种维持口腔健康的益生菌组合物及其应用。本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语与本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下对发明技术方案进行详细描述，以使其更容易理解和掌握。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明实施例中采用的原料来源如下：

嗜酸乳杆菌：仙农生物科技(上海)有限公司；

乳酸乳球菌：仙农生物科技(上海)有限公司，乳酸乳球菌乳酸亚种；

长双歧杆菌：信阳市沐凡生物科技有限公司，产品编号：MF-008550；

唾液链球菌：美国ATCC的唾液链球菌K12；

嗜热链球菌：山东中科嘉亿生物工程有限公司，产品编号：A0010；

薄荷提取物：陕西慧科植物开发有限公司；

茉莉花提取物：陕西博林生物技术有限公司；

西瓜霜：按照《全国中草药汇编》中的记载进行西瓜霜制备，一般农历八月节后，用未成熟的西瓜皮与皮硝加工制成，将较生的西瓜切开一小口，挖出部分瓜瓤，皮硝放入，然后将瓜皮盖好，用绳吊在南边朝北的方向风干，待皮硝往西瓜外面渗出时，刮下此霜即成西瓜霜。

实施例1本发明益生菌组合物1

本实施例提供了一种维持口腔健康的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括益生菌粉剂和植物粉剂；

所述益生菌粉剂包括：嗜酸乳杆菌10份，乳酸乳球菌10份，长双歧杆菌20份，唾液链球菌20份，嗜热链球菌10份；

所述植物粉剂包括：西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物，三种植物粉末按重量比0.5:1:1混合；

所述益生菌粉剂与植物粉剂的重量比例为1:0.1。

实施例2本发明益生菌组合物2

所述益生菌粉剂包括：嗜酸乳杆菌20份，乳酸乳球菌20份，长双歧杆菌30份，唾液链球菌30份，嗜热链球菌20份；

所述益生菌粉剂与植物粉剂的重量比例为1:0.5。

实施例3本发明益生菌组合物3

所述益生菌粉剂包括：嗜酸乳杆菌30份，乳酸乳球菌30份，长双歧杆菌40份，唾液链球菌40份，嗜热链球菌30份；

所述益生菌粉剂与植物粉剂的重量比例为1:1。

实施例4本发明益生菌组合物4

所述益生菌粉剂与植物粉剂的重量比例为1:0.6。

实施例5缺少其中某种益生菌的益生菌组合物

本实施例提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括益生菌粉剂和植物粉剂；

所述益生菌粉剂包括：嗜酸乳杆菌30份，乳酸乳球菌30份，长双歧杆菌40份，嗜热链球菌30份；

所述益生菌粉剂与植物粉剂的重量比例为1:0.5。

实施例6配方比例发生改变的益生菌组合物

所述益生菌粉剂包括：嗜酸乳杆菌5份，乳酸乳球菌40份，长双歧杆菌10份，唾液链球菌50份，嗜热链球菌5份；

所述植物粉剂包括：西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物，三种植物粉末0.5:1:1混合，所述益生菌粉剂于植物粉剂的重量比例为1:0.5。

实施例7本发明益生菌组合物的各种形式制剂

1.制备成牙膏

取本发明益生菌组合物5～10份，添加牙膏基本成分黄原胶0.1～0.5份，山梨醇15～30份，椰油酰胺丙基甜菜碱1～5份，甘油5～10份，苯甲酸钠0.3～0.8份，碳酸钙30～40份，二氧化硅5～10份。

按照常规牙膏制备方式，采用制膏锅经投料、制胶、膏体捏合、研磨、真空脱气、陈化等步骤制备成益生菌牙膏。

其中，每克益生菌牙膏中，活菌数为306亿cfu。

2.制备成漱口水

取本发明益生菌组合物5～10份，添加5～10份乙醇，甘油1～5份，柠檬酸0.05～0.1份，甜菊糖0.05～0.1份，去离子水溶解制备成益生菌漱口水。

其中，每克益生菌漱口水中，活菌数为315亿cfu。

3.制备成牙粉

取本发明益生菌组合物5～10份，添加碳酸镁10～15份，碳酸钙20～30份，上述物质混匀后溶于少许酒精，装袋制备成益生菌牙粉。

其中，每克益生菌牙粉中，活菌数为302亿cfu。

4.制备成牙齿凝胶

取本发明益生菌组合物5～10份，添加PEG-400 10～15份，卡波尔树脂EDT2020 1～2份，BHT 0.01～0.02份，三乙醇胺0.1～0.4份，RH-60 0.05～0.08份，甘油30～40份，过氧化脲20～30份，Noverite 7s 0.05～0.1份，上述物质按照常规牙齿凝胶制备方法制备成益生菌牙齿凝胶。

其中，每克益生菌牙齿凝胶中，活菌数为310亿cfu。

实施例7的上述制剂中益生菌活菌数均可达到300亿cfu以上，符合本发明益生菌活菌数的要求，因此，本发明益生菌组合物可以制备成牙膏、漱口水、牙粉、牙齿凝胶等形式的制剂。

实验例1.本发明益生菌组合物对口臭的治疗作用

1.实验材料：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重200g左右，大鼠体健活动良好，食欲良好，无龋齿，无牙周病，购自北京维通利华公司；菌种(ATCC33277、ATCC25611、ATCC49256)来自美国模式培养物保藏所；小鼠血清IL-6和TNF-α表达水平的ELISA检测试剂盒，购自武汉新启迪生物科技有限公司。

2.口臭模型动物建立

以易致口臭的菌种(3×10⁶CFU/mL)涂抹于大鼠牙根，每天1vi，连续4周，每周检测大鼠的口臭指数、口气中气味物质(硫化物、有机酸、酯和芳香族化合物等)的含量、牙龈指数和菌斑指数。

牙龈指数：使用WHO推荐的CPI牙周探针，检查每个牙的近中颊、颊侧、远中颊及舌面4点，分别记分，4个分值的总和除以4，即为该牙的分值。0表示牙龈健康；1表示牙龈轻度炎症：牙龈颜色有轻度改变并有轻度水肿，探诊不出血；2表示牙龈中等炎症：牙龈色红，水肿光亮，探诊出血；3表示牙龈中毒炎症：牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。平均值在0～1定义为轻度炎症，1～2为中度炎症，2～3为重度炎症。

菌斑指数：检查每个牙的近中颊、颊侧、远中颊及舌面4点，分别记分，4个分值的总和除以4，即为该牙的分值。0表示近龈缘区无菌斑；1表示近龈缘区有薄的菌斑，肉眼不可见用探针尖的侧面可刮出菌斑；2表示龈缘或邻面有中等量菌斑；3表示在龈沟内或龈缘及邻面有大量软垢。

3.动物实验分组

选择建模成功的口臭模型动物40只分为8组，试验1～6组，分别每组每天用棉签蘸取相应实施例制备的制剂以0.2ml/g的量涂抹于大鼠口腔，连续处理4周，试验7组为无处理组，试验8组为阳性对照组，每天以10％碘液同样处理大鼠口腔，另外设置无口臭空白对照组。

4.各实施例益生菌制剂对大鼠口臭的功效评价

每周用鼻闻法检测口臭指数，用不连续的分级记录臭味程度，检测牙龈指数和菌斑指数。

动物模型心脏取血，离心取上清，采用ELISA试剂盒检测不同组别大鼠血清中的IL-6和TNF-α的含量，并进行比较分析。

5.不同益生菌口腔制剂对大鼠口腔指数的影响

口臭模型动物建模成功后，给药不同剂量的益生菌口腔制剂，设置口臭不给药组和空白对照组，分别用鼻闻法检测口臭指数，用不连续的分级记录臭味程度，检测牙龈指数、菌斑指数和口臭指数。

从图1中可以看出，给药4周后，实施例1-4制备的益生菌口腔制剂可以明显降低牙龈指数、菌斑指数和口臭指数，而实施例5减少益生菌种类或实施例6改变益生菌配比的益生菌口腔制剂均不能达到治疗口臭和改善牙龈的效果。这表明本发明益生菌组合物能够有效缓解口腔厌氧致病菌引起的口腔健康指数的升高，并且组合物中植物粉剂能够使口气清新，更有益于改善口臭。

6.不同益生菌口腔制剂对IL-6和TNF-α含量的影响

IL-6和TNF-α是血液中的促炎因子，常用于作用机制的研究，口腔厌氧致病菌的感染可导致血液中的促炎症应答，IL-6和TNF-α的降低可使免疫应答逆转为抗炎反应。从图2和图3中可以看出，在试验7组可见血液中炎症因子的异常升高，给药4周后，实施例1-4益生菌口腔制剂治疗组的IL-6和TNF-α水平明显低于试验7组无处理组，而实施例5和实施例6益生菌口腔制剂的IL-6和TNF-α水平与试验7组无差异，即未起到任何作用。这表明，本发明益生菌组合物能够有效缓解口腔厌氧致病菌引起的炎症应答。

实验例2.本发明益生菌组合物对牙龈炎、牙周炎的治疗作用

2.菌液制备

菌种(ATCC33277、ATCC25611、ATCC49256)接种于营养肉汤培养基中，在37℃厌氧条件下培养2～5d，挑取平板上单个菌落用无菌PBS(50mmol/L，pH7.4)配制菌悬液5mL，并调节为0.5麦氏比浊浓度(即1×10⁸CFU/mL)，然后加入羧甲基纤维素，用0.22μm孔径的滤膜过滤，配制成2％羧甲基纤维素的新鲜菌液。

3.口臭模型动物建立

SPF级Sprague Dawley大鼠腹腔注射3％戊巴比妥1mg/kg麻醉后，选择双侧上颌第二磨牙用5-0医用丝线结扎于牙颈部，结扎丝线尽量放入龈沟内，遇结扎线脱落需重新结扎。结扎后用10％糖水代替饮水喂养，每隔一天接种一次制备好的菌液0.1ml。28d后，观察大鼠牙龈指数，菌斑指数和牙龈探诊出血指数，随机取两只大鼠处死，测定血液中IL-6浓度和TNF-α浓度，取上颌，在X射线观察牙槽骨吸收情况。

4.动物实验分组

利用随机书目表将建模成功的42只大鼠随机分成7组，每组各6只。第1-6组为试验1-6组，分别使用实施例1-6制备的益生菌口腔制剂，每天给药1次，采用一次性注射器口腔内涂抹0.2mL；第7组为对照组，使用0.9％生理盐水每日涂抹一次。

5.不同益生菌口腔制剂对大鼠牙周炎、牙龈炎的功效评价

给药第0、7、14、21、28天采用探针检测并记录牙龈指数，菌斑指数和探诊出血指数，采用ELISA试剂盒测定血液中IL-6和TNF-α的含量。

建模28d，肉眼观察42只大鼠，可见牙龈有明显的红肿，第二磨牙有软垢附着并伴有自动出血症状，大鼠的平均牙龈指数为3，菌斑指数为3，探诊出血指数为3，建模成功。从图4中可以看出，采用实施例1-6制备的益生菌口腔制剂给药4周后，试验1-4组的牙龈指数、菌斑指数和探诊出血指数，但是试验5组和6组的牙龈指数、菌斑指数和探诊出血指数与对照组差别不大，由此可以判定本发明益生菌组合物可以有效防治大鼠牙周炎和牙龈炎，而减少益生菌种类或改变益生菌配比均不能达到防治牙周炎和牙龈炎的效果。

6.不同益生菌口腔制剂对IL-6和TNF-α含量的影响

ELISA检测结果显示(图5)，对照组血液中的IL-6和TNF-α含量较高，实施例1-4给药组的IL-6和TNF-α含量明显减少，但实施例5和实施例6给药组的IL-6和TNF-α含量与对照组相比没有太大差异，这表明，本发明益生菌组合物能够有效缓解口腔厌氧致病菌引起的牙周炎炎症应答。

实验例3.本发明益生菌组合物对龋齿的治疗作用

1.实验材料：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，大鼠体健活动良好，食欲良好，无龋齿，无牙周病，购自北京维通利华公司。IL-2、IL-4、IL-6、IL-8ELISA检测试剂盒购自上海将来实业股份有限公司。变异链球菌NCTC 10449由首都医科大学口腔医学院提供。

2.大鼠龋齿模型的建立

取21d大鼠唾液培养液，检测大鼠口腔内固有细菌的定殖情况，并于21～23d鼠龄期间喂以含有抗生素的饮用水(青霉素200mg/L，链霉素1500mg/L)。于24d鼠龄时取唾液培养，检测大鼠口腔内细菌的抑制状况，培养结果为阴性后停药。于25～27d鼠龄期间，以体积分数10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(3mL/kg)，每日清晨1次，连续3d给大鼠口腔内每颗磨牙各面接种1×10¹¹CFU/L的变异链球菌100μL，处理后30min内禁食禁水。并喂以致龋饲料(蔗糖56％，全麦粉6％，精炼奶粉28％，苜蓿粉3％，脱水全肝粉1％，酵母4％，盐2％)，同时将变异链球菌菌液和饮用水按1:100体积比混合，给大鼠饮用。于28d鼠龄时采集大鼠口腔刺激性唾液(每只100μL)进行培养，通过平板菌落计数确认大鼠口腔内变异链球菌定植成功(＞10¹¹CFU/L)，用于后续试验。

3.动物分组于处理

将建模成功的56只大鼠随机分为7组，每组8只，试验1-6组分别使用实施例1-6制备的益生菌口腔制剂，每天给药1次，采用一次性注射器口腔内涂抹0.2mL；第7组为对照组，使用0.9％生理盐水每日涂抹一次。另设健康对照组。

试验周期维持10周，试验期间，每两星期给大鼠称重，观察比较大鼠生长情况。试验结束后，处死大鼠，并对大鼠牙齿做如下处理：处死大鼠后，取其头骨置高压蒸汽锅中在121℃、15min的条件下高压高温处理。之后取出大鼠头骨，借用手术刀剥离大鼠牙齿颌骨周围附着的软组织，清洗颌骨，室温干燥。将在室温下干燥后的颌骨放置于0.4％的紫脲酸铵染液中过夜浸泡12h，取出后用清水漂洗干净，晾干后用金刚砂片沿大鼠的上下颌磨牙牙合面近远中向矢状半切，在体式显微镜下观察、评估大鼠磨牙龋损情况，并通过点对臼齿的龋齿诊断进行龋齿打分。

4.不同益生菌口腔制剂对大鼠龋齿的防治作用

4.1对大鼠体重的影响

大鼠试验前后体重测定结果如表1所示。大鼠试验期间，试验1-4组与健康对照组之间大鼠体重增量无显著差异，但试验5组和6组与阴性对照组之间的大鼠体重增量无显著差异，说明本发明益生菌组合物能够有效防治大鼠龋齿，而无论是减少益生菌种类或更改益生菌配比都不能起到防治龋齿的作用。

表1大鼠试验前后体重测定结果

4.2大鼠龋齿得分情况

给大鼠臼齿过夜染色、清水漂洗并自然干燥后，在体式显微镜下观察各组大鼠臼齿龋损情况，利用Keyes龋齿计分法给大鼠牙齿进行龋齿打分。可以看到染色后大鼠臼齿的龋损部位呈现出粉红色，而正常的未龋损部位几乎未着色或者着色很浅。根据Keyes经典评估龋齿的方法，将牙齿龋损破坏程度分为四个等级：E级龋，龋坏仅累计牙釉质；Ds级龋，牙釉质龋坏及龋损累及范围不超过1/4的牙本质外层；Dm级龋，龋损累及范围处于1/4～3/4的牙本质厚度；Dx级龋，龋损累及范围超过3/4的牙本质厚度。根据大鼠牙齿的龋损破坏深度范围可以把大鼠磨牙的颊面、舌面、邻面及胎面窝沟分成若干个牙面单位，如表2所示。

表2大鼠磨牙牙面单位总数分布

注：①1^st 2^nd 3^rd分别表示大鼠第一、二、三磨牙

②大鼠第二磨牙包含一个近中邻面和一个远中邻面

在体式显微镜下对处理过的各组大鼠牙齿进行观察拍照，根据龋齿破坏范围对照表2判断各大鼠磨牙颊、舌、邻面及胎面窝沟龋牙面单位，进行相应的龋齿打分，得分结果如表3所示。

表3大鼠龋齿得分情况

从表3的结果可以看到，实施例1-4制备的益生菌口腔制剂均能有效减轻大鼠磨牙釉质龋(E)和牙本质浅龋(Ds)的发生，而牙本质中龋(Dm)仅发生在试验组5和6以及阴性对照组。在试验组1-4组中均未出现。这表明本发明益生菌组合物能够有效防治龋齿，而减少益生菌种类或改变益生菌配比均不能达到防治龋齿的效果。

实验例4.本发明益生菌组合物对口腔溃疡的治疗作用

1.实验材料：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重200g左右，大鼠体健活动良好，食欲良好，无龋齿，无牙周病，购自北京维通利华公司。IL-2、IL-4、IL-6、IL-8ELISA检测试剂盒购自上海将来实业股份有限公司。

2.口腔溃疡动物模型的制备

采用石炭酸烧灼法制备模型，具体步骤如下：①将小棉球置于玻璃管的一端(直径为2mm)并保持与管口平齐；②向管内滴入90％的石炭酸至小棉球浸湿；③与口腔粘膜接触30s可发现白色损伤。造模成功标准：大鼠流出大口口水并伴有口角边潮湿，粘膜红肿。

3.动物实验分组

利用随机书目表将建模成功的42只大鼠随机分成7组，每组各6只。第1-6组为试验1-6组，分别使用实施例1-6制备的益生菌口腔制剂，每天给药1次，采用一次性注射器口腔内涂抹患处0.2mL；第7组为对照组，使用0.9％生理盐水每日涂抹一次；另外设第8组为健康对照组。

4.不同益生菌口腔制剂对大鼠口腔溃疡的功效评价

根据口腔溃疡症状将治疗效果分为显效、有效、无效三种情况。显效：溃疡愈合且红肿症状消失；有效：溃疡面积缩小且仍可见红肿；无效：溃疡面积缩小或者增大。此外，统计大鼠的每天进食量、体重、红肿消失时间、溃疡消失时间。同时，采用ELISA试剂盒测定血浆中IL-2、IL-4、IL-6和IL-8水平。

不同益生菌口腔制剂的治疗有效率见表4，具体的治疗情况见表5。从表4和表5中的数据，我们可以看出实施例1-4的益生菌口腔制剂能够有效缓解口腔溃疡症状，而实施例5和6的益生菌口腔制剂则对口腔溃疡无效。口腔溃疡可导致血浆中IL-2降低，IL-4、IL-6、IL-8升高，而经过实施例1-4的益生菌口腔制剂处理后，IL-2、IL-4、IL-6、IL-8的数值基本恢复正常，见表6，这也充分说明了本发明益生菌组合物能够有效缓解口腔溃疡症状。

表4不同益生菌口腔制剂的治疗有效率

表5不同益生菌口腔制剂的具体治疗情况

注：进食量的统计为每100g体重每天的量

表6不同益生菌口腔制剂处理后的炎性因子情况(pg/mL)

综上，本发明的益生菌组合物能够有效实现防治牙龈炎、牙周炎和口腔溃疡的作用，并具有缓解口臭、清新口气的作用。本发明益生菌组合物可以制备成牙膏、漱口水、牙粉、牙齿凝胶、泡沫、口腔喷雾剂等多种口腔益生菌制剂，用于维持口腔健康环境。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种维持口腔健康的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物包括益生菌粉剂和植物粉剂；

所述植物粉剂包括西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物。

2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中益生菌粉剂和植物粉剂的重量比为1:(0.1～1)。

3.根据权利要求1或2所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌粉剂包含如下重量份的组分：有效活菌数为1×10¹⁰cfu的嗜酸乳杆菌10～30份、有效活菌数为1×10¹⁰cfu的乳酸乳球菌10～30份、有效活菌数为1×10¹⁰cfu的长双歧杆菌20～40份、有效活菌数为1×10¹⁰cfu的唾液链球菌20～40份、有效活菌数为1×10¹⁰cfu的嗜热链球菌10～30份。

4.根据权利要求1或2所述的益生菌组合物，其特征在于，所述植物粉剂中西瓜霜粉、薄荷提取物、茉莉花提取物的重量比为(0.4～0.8):(1～1.2):(1～1.2)。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物为冻干粉剂；

优选地，所述冻干粉剂的粒径为200～300μm。

6.权利要求1～5任意一项所述益生菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂包括权利要求1～5任意一项所述益生菌组合物或者权利要求6的方法制备而成的益生菌组合物，

优选地，所述益生菌制剂为漱口水、牙膏、牙齿凝胶、牙粉、泡沫或口腔喷雾剂的形式。

8.根据权利要求7所述的益生菌制剂，其特征在于，每克所述益生菌制剂中，总的有效活菌数为1～10×10¹⁰cfu，优选为3～5×10¹⁰cfu。

9.权利要求1～5任意一项所述益生菌组合物或者权利要求6的方法制备而成的益生菌组合物或者权利要求7或8的益生菌制剂在制备用于维持口腔健康的药品和/或保健品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述维持口腔健康包括防治牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡、口臭，预防龋齿，护理牙龈，坚固牙齿，以及清新口气。