CN116904341A - 一株可改善口腔健康的鼠李糖乳杆菌及其益生菌组合物 - Google Patents

一株可改善口腔健康的鼠李糖乳杆菌及其益生菌组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株可改善口腔健康的鼠李糖乳杆菌及其益生菌组合物，属于生物医药技术领域。本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci‑109，所述鼠李糖乳杆菌ProSci‑109的保藏编号为CGMCC No.25449；实验证明，所述鼠李糖乳杆菌ProSci‑109能够有效抑制包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和福塞类杆菌在内的口腔病原菌，并且，能够有效治疗口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题，因此，所述鼠李糖乳杆菌ProSci‑109在制备能够改善口腔健康和/或抑制口腔病原菌的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。

Description

一株可改善口腔健康的鼠李糖乳杆菌及其益生菌组合物
技术领域
本发明涉及一株可改善口腔健康的鼠李糖乳杆菌及其益生菌组合物，属于生物医药技术领域。
背景技术
口腔作为呼吸道及胃肠道的起点，是保卫人体健康的第一道屏障。人类口腔中定植了大约700种不同的微生物，包括细菌、病毒、真菌、支原体等，多以细菌为主，是人体微生物定植生存的重要生态位。有研究表明，口腔菌群失衡是导致如口腔溃疡、口臭和牙周炎等口腔问题的重要原因。
其中，口腔溃疡是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症。研究表明，口腔溃疡的发生与口腔菌群失衡有着及其紧密的联系。口腔内菌群的变化会影响口腔内环境的稳定，进而导致口腔溃疡的发生。目前，主要采用口腔溃疡散和复方呋喃西林等口腔喷雾剂对口腔溃疡进行治疗和预防，虽有一定的疗效，但其含有的抗生素成分会引起诸多不良反应，如肠胃功能紊乱、肠道菌群失衡等，限制了其应用范围。
牙周病的病因主要是感染了特定的革兰氏阴性厌氧菌，从而引起口腔菌群的失调，进而导致菌群与宿主机体免疫系统的不协调。引起牙周疾病形成和进展的主要口腔病原菌是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。牙周病发生的外在表现形式主要为牙菌斑、牙结石、牙周脓肿、牙龈萎缩和牙龈出血。目前，牙周病的常用治疗方法有基础治疗、药物治疗和新技术(激光、光动力、高压氧)治疗。基础治疗主要通过手工刮治和超声洁治将口腔内的菌斑和牙石去除，但常有器械达不到的地方，影响治疗效果。药物治疗也对牙周病具有一定的防治效果，但其具有很大的副作用及药物毒性，例如，牙周脓肿使用的抗生素类药物易破坏口腔微生物生态平衡，抑制菌斑沉积使用的碘酚腐蚀性较强，有强大的杀菌力，容易灼伤牙周黏膜。新技术则需使用成本极高的设备，达不到临床大范围推广应用。
口臭又称为口腔异味，是指从口腔里呼出的气体较难闻。食物残渣附着在舌的后部，口腔中的微生物分解实物残渣中的蛋白质、血液以及粘蛋白等成分，如果口腔微生态正常，则分解产物无异常气体，但是，如果口腔菌群失衡，则分解产生挥发性硫化物(VolatileSulfur Compounds,VSCs)，进而产生口臭。产生VSCs的口腔病原菌主要是具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间普氏菌(Prevotella intermedia)和齿密螺旋体(Treponema denticola)等。目前，治疗口臭的方法有化学疗法和中药疗法。化学疗法主要使用含有精油及其他香味的漱口水产品来减轻口臭，但此方法温和性和安全性欠佳，而且不能从本质上降低VSCs的浓度。使用清胃散、黄连清胃丸、黄连上清片、龙胆泻肝丸等进行中药治疗起效慢且效果一般。
因此，亟需找到效果好、安全性佳且成本低的能够改善口腔健康的方法或产品，以治疗口腔溃疡、口臭和牙周炎等口腔问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci-109，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25449，保藏日期为2022年08月01日。
所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109来源于香格里拉地区的自然发酵牦牛乳样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌。
本发明还提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含上述鼠李糖乳杆菌和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109、保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602或上述益生菌组合物在制备产品中的应用，所述产品具有如下任一所示的功能：
(a)改善口腔健康；
和/或，(b)抑制口腔病原菌。
本发明的一种实施方式中，所述改善口腔健康包括预防和/或治疗口腔溃疡、口臭和/或牙周病；所述牙周病包括牙菌斑、牙龈炎和/或牙结石。
本发明的一种实施方式中，所述口腔病原菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和/或福塞类杆菌。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，和/或，保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1～2:2～1。
本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或日化用品。
本发明的一种实施方式中，所述药品还含有药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包括羧甲基纤维素钠、淀粉和/或麦芽糊精。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂；所述片剂为口含片。
本发明的一种实施方式中，所述食品还含有食品添加剂。
本发明的一种实施方式中，所述食品添加剂包括果胶、卡拉胶和/或木糖醇。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括乳制品或固体饮料。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵乳、发酵乳饮料、发酵奶油或冰淇淋。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品还含有日化用品添加剂。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品添加剂包括黄原胶、山梨醇和/或碳酸钙。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品包括牙膏、漱口水、口腔喷雾或牙粉。
本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109、保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602或上述益生菌组合物。
本发明的一种实施方式中，所述产品具有如下任一所示的功能：
(a)改善口腔健康；
和/或，(b)抑制口腔病原菌。
本发明的一种实施方式中，所述改善口腔健康包括预防和/或治疗口腔溃疡、口臭和/或牙周病；所述牙周病包括牙菌斑、牙龈炎和/或牙结石。
本发明的一种实施方式中，所述口腔病原菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和/或福塞类杆菌。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，和/或，保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌ProSci-109和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1～2:2～1。
本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或日化用品。
本发明的一种实施方式中，所述药品还含有药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包括羧甲基纤维素钠、淀粉和/或麦芽糊精。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂；所述片剂为口含片。
本发明的一种实施方式中，所述食品还含有食品添加剂。
本发明的一种实施方式中，所述食品添加剂包括果胶、卡拉胶和/或木糖醇。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括乳制品或固体饮料。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括发酵乳、发酵乳饮料、发酵奶油或冰淇淋。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品还含有日化用品添加剂。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品添加剂包括黄原胶、山梨醇和/或碳酸钙。
本发明的一种实施方式中，所述日化用品包括牙膏、漱口水、口腔喷雾或牙粉。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci-109，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109的保藏编号为CGMCC No.25449；实验证明，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109能够有效抑制包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和福塞类杆菌在内的口腔病原菌，并且，能够有效治疗口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题，因此，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109在制备能够改善口腔健康和/或抑制口腔病原菌的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。
同时，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109属于肠道有益菌，并且，在可用于食品的菌种名单目录中，因此，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109以及有效成分为所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109的产品具有安全性佳这一优势。
另外，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109只需使用培养基进行微生物培养即可获得，因此，所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109以及有效成分为所述鼠李糖乳杆菌ProSci-109的产品具有成本低这一优势。
2、本发明提供了发酵乳杆菌ProSci-602在制备能够改善口腔健康和/或抑制口腔病原菌的产品中的应用；实验证明，所述发酵乳杆菌ProSci-602能够有效抑制包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和福塞类杆菌在内的口腔病原菌，并且，能够有效治疗口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题，因此，所述发酵乳杆菌ProSci-602在制备能够改善口腔健康和/或抑制口腔病原菌的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。
同时，所述发酵乳杆菌ProSci-602属于肠道有益菌，并且，在可用于食品的菌种名单目录中，因此，所述发酵乳杆菌ProSci-602以及有效成分为所述发酵乳杆菌ProSci-602的产品具有安全性佳这一优势。
另外，所述发酵乳杆菌ProSci-602只需使用培养基进行微生物培养即可获得，因此，所述发酵乳杆菌ProSci-602以及有效成分为所述发酵乳杆菌ProSci-602的产品具有成本低这一优势。
3、本发明提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物的成分包含保藏编号为CGMCC No.25449的鼠李糖乳杆菌ProSci-109和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602；实验证明，与保藏编号为CGMCC No.25449的鼠李糖乳杆菌ProSci-109和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌ProSci-602单菌相比，所述益生菌组合物抑制包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和福塞类杆菌在内的口腔病原菌的作用更强，并且，治疗口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题的效果更佳，因此，所述益生菌组合物在制备能够改善口腔健康和/或抑制口腔病原菌的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。
同时，所述益生菌组合物中的鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602均属于肠道有益菌，并且，均在可用于食品的菌种名单目录中，因此，所述益生菌组合物以及有效成分为所述益生菌组合物的产品具有安全性佳这一优势。
另外，所述益生菌组合物中的鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602均只需使用培养基进行微生物培养即可获得，因此，所述益生菌组合物以及有效成分为所述益生菌组合物的产品具有成本低这一优势。
生物材料保藏
一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci-109，分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2022年08月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25449，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L，pH为6.8。
PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.15g/L、氯化钠8g/L，pH为7.2。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的上清液、菌悬液和菌粉的制备方法如下：
唾液链球菌菌悬液的制备方法：将菌液划线于MRS固体培养基上，37℃条件下厌氧培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h进行活化，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h，得到菌液；将菌液于4℃、8000×g离心10min，得到菌体和上清液；将菌体用PBS缓冲液洗涤三次后重悬于PBS缓冲液中至菌浓度为1×108CFU/mL，得到唾液链球菌菌悬液。
鼠李糖乳杆菌菌悬液的制备方法：将菌液划线于MRS固体培养基上，37℃条件下厌氧培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h进行活化，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h，得到菌液；将菌液于4℃、8000×g离心10min，得到菌体和上清液；将菌体用PBS缓冲液洗涤三次后重悬于PBS缓冲液中至菌浓度为1×108CFU/mL，得到鼠李糖乳杆菌菌悬液。
发酵乳杆菌菌悬液的制备方法：将菌液划线于MRS固体培养基上，37℃条件下厌氧培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h进行活化，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h，得到菌液；将菌液于4℃、8000×g离心10min，得到菌体和上清液；将菌体用PBS缓冲液洗涤三次后重悬于PBS缓冲液中至菌浓度为1×108CFU/mL，得到发酵乳杆菌菌悬液。
复合益生菌菌悬液的制备方法：取鼠李糖乳杆菌菌悬液和发酵乳杆菌菌悬液按照体积比1:1混合，得到复合益生菌菌悬液。
复合益生菌上清液的制备方法：取鼠李糖乳杆菌上清液和发酵乳杆菌上清液按照体积比1:1混合，得到复合益生菌上清液。
口腔病原菌菌悬液的制备方法：将菌液划线于BHI固体培养基(购自北京陆桥技术股份有限公司)上，37℃条件下厌氧培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于BHI液体培养基(购自北京陆桥技术股份有限公司)中，37℃条件下厌氧培养24h进行活化，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于BHI液体培养基中，37℃条件下厌氧培养24h，得到菌液；将菌液于4℃、8000×g离心10min，得到菌体和上清液；将菌体用PBS缓冲液洗涤三次后重悬于PBS缓冲液中至菌浓度为1×108CFU/mL，得到口腔病原菌菌悬液。
鼠李糖乳杆菌菌粉的制备方法：在鼠李糖乳杆菌菌悬液中加入冻干保护剂甘油至体积百分比浓度为25％，得到混合液；将混合液真空冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌菌粉。
发酵乳杆菌菌粉的制备方法：在发酵乳杆菌菌悬液中加入冻干保护剂甘油至体积百分比浓度为25％，得到混合液；将混合液真空冷冻干燥，得到发酵乳杆菌菌粉。
复合益生菌菌粉的制备方法：取鼠李糖乳杆菌菌粉和发酵乳杆菌菌粉分别用麦芽糊精稀释至活菌数为1×1010CFU/g后，按照活菌比1:1混合，得到复合益生菌菌粉。
实验例1：鼠李糖乳杆菌ProSci-109的获取
具体步骤如下：
以来源于香格里拉地区的自然发酵牦牛乳为样本，吸取0.5mL样本添加至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养24h进行富集，得到富集后的样品；吸取0.5mL富集后的样品添加至4.5mL无菌生理盐水中获得10-1稀释液，然后吸取0.5mL 10-1稀释液于4.5mL生理盐水中，得到10-2稀释液，按此操作，依次得到10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；吸取100μL梯度稀释液涂布于MRS固体培养基上，10-4、10-5、10-6每个梯度1个板，37℃培养48h，得到菌落；根据菌落形状、大小、边缘、透明度等选择MRS固体培养基上具有鼠李糖乳杆菌典型特征的菌落，用接种环挑取菌落在MRS固体培养基上进行划线，37℃培养48h，得到纯化的单菌落；挑取纯化的单菌落分别接种至5mL的MRS液体培养基中，37℃培养24h，得到菌液；将各菌液所对应的各菌株编号后，参照教科书《微生物学》(沈萍，陈向东主编)中所记载的步骤进行革兰氏染色、菌种鉴定、生理生化实验和基因组鉴定分析，选取具有鼠李糖乳杆菌典型特征的菌株，得到菌株ProSci-109；
其中，菌株鉴定过程如下：
取菌株ProSci-109菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取菌株ProSci-109的基因组，使用序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的27F/1492R引物对(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：CTACGGCTACCTTGTTACGA)，以提取得到的菌株ProSci-109的基因组为模板进行扩增，得到菌株ProSci-109的16S rRNA(菌株ProSci-109的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)；将菌株ProSci-109的16S rDNA在NCBI的Blastn程序进行核酸序列比对，结果显示此菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci-109。将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ProSci-109保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25449。
实验例2：鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对口腔溃疡患者的影响实验
具体步骤如下：
招募有口腔溃疡的志愿者，随机分为四组，对照组19人，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组21人，发酵乳杆菌ProSci-602组21人，益生菌组合物组26人。志愿者要求为：年龄在20～55岁，口腔溃疡直径在30～100mm，新发溃疡均有“黄、红、凹、痛”的典型口腔溃疡的特点，症状符合《口腔黏膜病学》中相关标准。实验过程为：对照组志愿者给予常规口腔溃疡治疗方案，进行单一干扰素喷雾(西瓜霜喷雾剂，购自江西水滴药业有限公司)治疗，口腔内及溃疡面进行喷药，3喷/次，2次/d，喷涂后30min禁止饮水、进食，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组志愿者、发酵乳杆菌ProSci-602组志愿者和益生菌组合物组志愿者在对照组常规治疗的基础上，分别口服鼠李糖乳杆菌ProSci-109菌粉、发酵乳杆菌ProSci-602(购自北京科拓恒通生物技术有限公司，保藏编号为CGMCC NO.25451)菌粉和复合益生菌菌粉(鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1:1)，2g/次，每日两次，每组均连续治疗5日。治疗结束后，对比每组志愿者在治疗前后的口腔溃疡情况，对比结果见表1。
口腔溃疡情况的评判标准为：根据口腔溃疡症状将治疗效果分为显效、有效和无效三种情况。显效：患者口腔溃疡愈合，且红肿消失，黏膜恢复正常；有效：口腔溃疡面积减少50％以上，且仍可见红肿；无效：口腔溃疡面积减少未达50％或增大。
由表1可知，连续治疗5日后，对照组总有效率为84.21％，分别补充鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602后的总有效率均为90.48％，其中，补充发酵乳杆菌ProSci-602后的显效的要多一人，补充复合益生菌粉的总有效率为96.15％。因此，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602可明显改善口腔溃疡情况，并且，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602同时使用时效果更佳。
表1每组志愿者在治疗前后的口腔溃疡情况比较
实验例3：鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对口腔病原菌的拮抗能力实验
实验一(抑菌实验)：
具体步骤如下：
将灭菌后的素琼脂(含15g/L琼脂的水)倒入一次性平板，静置30min等待凝固，得到刚倒的平板；将灭过菌的牛津杯间隔3cm放置在刚倒的平板上后，将具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，购自北纳生物有限公司，编号为BNCC 311817)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，购自北纳生物有限公司，编号为BNCC 353909)、中间普氏菌(Prevotella intermedia，购自北纳生物有限公司，编号为BNCC 352061)、齿密螺旋体(Treponema denticola，购自美国典型培养物保藏中心，编号为ATCC 35405)、福塞类杆菌(Bacteroides forsythus，购自美国典型培养物保藏中心，编号为ATCC 43037)、鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602的菌悬液按照1％(v/v)的接种量分别接种于15mL BHI液体培养基(购自北京陆桥技术股份有限公司)和MRS液体培养基中(具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和福塞类杆菌使用BHI液体培养基，鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌使用MRS液体培养基)，混匀后倒入刚倒的平板，使混合物均匀覆盖平板表面无气泡，静置30min等待凝固后用镊子将牛津杯取出，分别吸取100μL鼠李糖乳杆菌ProSci-109菌悬液、发酵乳杆菌ProSci-602菌悬液、复合益生菌菌悬液(鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1:1)和唾液链球菌K12(购自上海保藏生物技术中心，编号为SHBCC D24663)菌悬液分别添加至牛津杯造成的圆孔中，将平板放置于三气培养箱中37℃静置培养48h，测量抑菌圈(mm)的大小，测量结果见表2。
从表2可以看出，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602均具有对口腔病原菌的广泛抑制谱，且抑制活性远高于商业益生菌唾液链球菌K12(此处需尤其关注鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对牙龈卟啉单胞菌的抑制效果，因为罕有乳酸菌对此口腔病原菌具有抑制活性)。同时，从表2可以看出，与鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602单独的抑制活性相比，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602复配使用对能够引起口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题的口腔病原菌显示出了更高的抑制活性，且彼此之间基本无抑制。
表2不同菌株对口腔病原菌的生长抑制能力测定
实验二(交互凝集实验)：
具体步骤如下：
凝集能力通过监测过夜培养物在600nm处光密度的减少来评价。所述减少因凝集产生聚集物和沉淀所致。使用无菌水将鼠李糖乳杆菌ProSci-109菌悬液和发酵乳杆菌ProSci-602菌悬液分别稀释至OD600nm＝0.5±0.05，得到鼠李糖乳杆菌ProSci-109稀释液和发酵乳杆菌ProSci-602稀释液；使用无菌水将唾液链球菌K12菌悬液稀释至OD600nm＝0.5±0.05，得到唾液链球菌K12稀释液；使用无菌水将牙龈卟啉单胞菌菌悬液和福塞类杆菌菌悬液分别稀释至OD600nm＝0.5±0.05，得到牙龈卟啉单胞菌稀释液和福塞类杆菌稀释液；使用无菌水将复合益生菌菌悬液稀释至OD600nm＝0.5±0.05，得到复合益生菌稀释液(鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1:1)；将鼠李糖乳杆菌ProSci-109稀释液、发酵乳杆菌ProSci-602稀释液、复合益生菌稀释液和唾液链球菌K12稀释液分别与牙龈卟啉单胞菌稀释液和福塞类杆菌稀释液等体积混合于灭菌的1.5mL离心管中后，先振荡5min，再室温(25℃)静置培养，分别在静置培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、24h和48h后吸取上层液体，测试600nm处的吸光值，并根据吸光值计算交互凝集率(％)，计算结果见表3～4；交互凝集率的计算公式如下：
交互凝集率(％)＝{[(Ax+Ay)-2×Amin]/(Ax+Ay)}×100％；
式中，Ax为交互凝集前在600nm处复合菌株的吸光值；Ay为交互凝集前病原菌在600nm处的吸光值；Amin为静置t小时后混合菌液的吸光值。
与能够引起口腔溃疡、牙周病和口臭等口腔问题的口腔病原菌的交互凝集能力即形成聚集物的能力对具有口腔健康应用的菌株而言尤为重要，因为其使所述菌株能够通过干扰口腔病原菌生物膜形成来抑制或减少牙菌斑。牙龈卟啉单胞菌和福塞类杆菌是证据充分的牙周致病菌。表3～4的结果显示，随着静置时间的延长，鼠李糖乳杆菌ProSci-109、发酵乳杆菌ProSci-602及两者的组合对牙龈卟啉单胞菌和福塞类杆菌表现出高凝集，尤其是两者的组合具有更高的凝集能力，静置24h后，对牙龈卟啉单胞菌和福塞类杆菌交互凝集率分别达到66.58％和89.0％。其中，鼠李糖乳杆菌ProSci-109、发酵乳杆菌ProSci-602及两者的组合对福塞类杆菌凝集能力较强，可有效减少福塞类杆菌的黏附定植，并显著高于商业菌株唾液链球菌K12。
表3不同菌株与牙龈卟啉单胞菌交互凝集能力测定结果
表4不同菌株与与福塞类杆菌交互凝集能力测定结果
实验例4：鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对恶臭挥发性化合物的产生能力实验
具体步骤如下：
将鼠李糖乳杆菌ProSci-109菌悬液、发酵乳杆菌ProSci-602菌悬液、复合益生菌菌悬液(鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602的活菌比为1:1)和唾液链球菌K12菌悬液按2％(v/v)的接种量接种至由5g/L葡萄糖、5g/L果糖、1g/L酵母提取物、1g/L肉浸膏、200个/mL白假丝酵母菌(Candida albicans，购自宁波明舟生物科技有限公司，编号为BMZ134172)和5g/L果胶组成的培养基中，于37℃厌氧培养48h后，通过感官评价方法，由专业口臭鼻测医师通过鼻测法进行感官评价，按照1～5的计分标准来衡量恶臭值的程度，以衡量生长在类似于人饮食的培养基中的鼠李糖乳杆菌ProSci-109、发酵乳杆菌ProSci-602、益生菌组合物和唾液链球菌K12的恶臭挥发性化合物的产生，评价结果见表5；
其中，恶臭值的评价标准为：1为无气味，2为有轻微异味，3为异味明显，4为有轻微不良气味，5为非常不良的气味。
作为口腔益生菌，自身不应产生一些恶臭化合物才可以进行应用。表5的结果显示，当生长在类似于人饮食的培养基中时，鼠李糖乳杆菌ProSci-109、发酵乳杆菌ProSci-602、益生菌组合物和唾液链球菌K12自身未产生不良气味。
表5不同菌株产生的恶臭值
实验例5：鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对挥发性硫化物的抑制能力实验
具体步骤如下：
使用无菌生理盐水将具核梭杆菌菌悬液稀释至浓度为1×107CFU/mL，得到具核梭杆菌稀释液；取1.7mL具核梭杆菌稀释液分别与0.3mL MRS液体培养基(对照组)、鼠李糖乳杆菌ProSci-109上清液和发酵乳杆菌ProSci-602上清液和复合益生菌上清液(鼠李糖乳杆菌ProSci-109上清液和发酵乳杆菌ProSci-602上清液的质量比为1:1)混合后，加至亨盖特试管中，于37℃厌氧培养9h；培养结束后，用2个50mL注射器针头插入亨盖特试管中，一头连接Halimeter口臭仪，一头平衡气压，振荡混匀后吸取1mL气体，加入一管空的亨盖特试管中，边振荡边测量气体中的挥发性硫化物，根据测量结果计算鼠李糖乳杆菌ProSci-109、发酵乳杆菌ProSci-602和益生菌组合物对具核梭杆菌产生挥发性硫化物的抑制率，计算结果见表6；抑制率的计算公式如下：
抑制率(％)＝(1-抑制前含量/抑制后含量)×100％；
式中，抑制前含量为未经鼠李糖乳杆菌ProSci-109和/或发酵乳杆菌ProSci-602抑制前所测得的挥发性硫化物的含量，抑制后含量是指经过鼠李糖乳杆菌ProSci-109和/或发酵乳杆菌ProSci-602抑制后所测得的挥发性硫化物的含量。发性硫化物的含量抑制率越高，说明抑制后物质含量越低，抑制作用越明显。
表6的结果显示，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602均对具核梭杆菌产生挥发性硫化物具有抑制作用，并且，与鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602单独的抑制活性相比，鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602复配使用对具核梭杆菌产生挥发性硫化物的抑制作用更强，抑制率高达93.18％。
表6不同菌株对具核梭杆菌产生挥发性硫化物的影响
实验例6：鼠李糖乳杆菌ProSci-109和发酵乳杆菌ProSci-602对口臭和牙周病患者的影响实验
具体步骤如下：
招募有口臭和牙周病的受试者，随机分为四组，安慰剂组18人，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组18人，发酵乳杆菌ProSci-602组18人，益生菌组合物组24人。志愿者要求为：不包括处于孕期及抽烟人士，Halimeter口臭仪检测值＞200ppb，且30天内未服用抗生素类药物。实验过程为：安慰剂组受试者餐后30分钟使用安慰剂氟化钠含漱液，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组志愿者、发酵乳杆菌ProSci-602组志愿者和益生菌组合物组受试者餐后30分钟分别服用口服鼠李糖乳杆菌ProSci-109菌粉、发酵乳杆菌ProSci-602菌粉和复合益生菌菌粉，2g/餐，每日三餐，连续服用安慰剂和益生菌28天作为治疗期，治疗期结束后，停止服用安慰剂和益生菌7天作为洗脱期。实验期间，分别于实验开始前一天(基线期)和实验的第1、7、14、28和35天使用Halimeter口臭仪检测每组受试者的口气值，对比每组受试者在治疗前后的口臭情况，对比结果见表7，分别于实验开始前一天(基线期)和实验的第28天由医生对受试者进行口腔健康的检查，包括牙结石指数(CI)、菌斑指数(PLI)、牙周脓肿指数(PAI)、牙龈出血指数(GBI)、牙龈萎缩指数(GAI)，检测结果见表8。
口臭情况的检测方法为：口臭仪检测时要求受试者检查前2h禁食禁水，受试者闭口3min，将吸管的末端插入患者口中，深度为2.5cm，嘴唇应几乎闭合并与吸管间允许有一点空隙，且不能压在吸管上。采样过程中，应通过鼻子呼吸。当仪器显示板数值升至最高值稳定后开始下降时，记录最高值，检测三次取平均值。
口腔健康检查由专业的医师进行诊断，评判标准如下：
牙结石指数：0＝无软垢及牙结石；1＝少许软垢或牙结石，但未超过牙表面的1/3；2＝有牙结石，但未超过冠面的1/3，有少量的龈下结石；3＝牙结石不超过冠面的2/3，有较多的龈下结石。
菌斑指数：0＝牙龈边缘区无菌斑；1＝牙龈边缘区牙面有薄的菌斑，但视诊不可见，若用探诊尖的侧面可刮出菌斑；2＝在龈缘或邻面可见中等量菌斑；3＝龈沟内或龈缘区及邻面有大量软垢。
牙周脓肿指数：0＝牙龈健康，无水肿现象；1＝牙龈颜色轻度改变，并轻度水肿，探诊不出血；2＝牙龈发红，水肿表面光亮，探诊出血；3＝牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血或破溃排脓情况。
牙龈出血指数：0＝牙龈健康，无炎症和出血；1＝牙龈颜色有炎症改变，探诊后不出血；2＝探诊后有点状出血；3＝探诊后出血沿牙龈缘呈线状；4＝出血溢满并溢出龈沟；5＝自动出血。
牙龈萎缩指数：0＝牙龈健康，无牙龈退缩现象；1＝牙龈退缩不超过膜龈联合，邻牙间隙没有骨及软组织的丧失；2＝牙龈退缩超过膜龈联合，邻牙间隙没有骨及软组织的缺损；3＝牙龈退缩不超过膜龈联合，邻牙间隙有牙周组织的丧失；4＝牙龈退缩超过膜龈联合、邻牙间隙有牙周组织的丧失。
由表7可知，基线期，安慰剂组和益生菌组合物组的口气值没有显著区别；服用菌粉7天后，益生菌组合物组的口气值有了显著的下降(p<0.01)，下降了45.55％，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组降低了38.17％，发酵乳杆菌ProSci-602组降低了41.10％，而安慰剂组变化不显著；服用菌粉14天后，益生菌组合物组口气值下降极显著(p<0.001)，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组和发酵乳杆菌ProSci-602组也有显著的降低(p<0.01)，而安慰剂组虽有显著降低(p<0.05)，但当洗脱期结束时，便基本有恢复到了初期值；服用菌粉28天后，益生菌组合物组口气值下降了61.07％，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组是42.09％，发酵乳杆菌ProSci-602组是43.98％。总体而言，服用益生菌后，受试者口气值整体呈下降的趋势，不服用益生菌后，口气值略有回升，但效果依然很显著(p<0.001)，并且，鼠李糖乳杆菌ProSci-109组和发酵乳杆菌ProSci-602两菌同用的效果优于单菌。
由表8可知，益生菌组合物组、鼠李糖乳杆菌ProSci-109组和发酵乳杆菌ProSci-602组受试者的口腔健康状态，整体有了良好的改变，尤其是牙周脓肿指数得到了显著改善(p<0.05)并且，益生菌组合物组的改善效果优于鼠李糖乳杆菌ProSci-109组和发酵乳杆菌ProSci-602组；而安慰剂组口腔状态改善不显著，远低于益生菌组合物组、鼠李糖乳杆菌ProSci-109组和发酵乳杆菌ProSci-602组。
表7受试者服用菌粉前后口气值的变化(ppb)
注：*益生菌组与基线期相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#安慰剂与基线期相比，p<0.05。
表8受试者口腔健康检查变化
注：*益生菌组与基线期相比，p<0.05。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25449。
2.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物的成分包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌、保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌或权利要求2所述的益生菌组合物在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品具有如下任一所示的功能：
(a)改善口腔健康；
和/或，(b)抑制口腔病原菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改善口腔健康包括预防和/或治疗口腔溃疡、口臭和/或牙周病；所述牙周病包括牙菌斑、牙龈炎和/或牙结石。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述口腔病原菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和/或福塞类杆菌。
6.如权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品中，权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，和/或，保藏编号为CGMCCNO.25451的发酵乳杆菌的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
7.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌、保藏编号为CGMCC NO.25451的发酵乳杆菌或权利要求2所述的益生菌组合物。
8.如权利要求7所述的一种产品，其特征在于，所述产品具有如下任一所示的功能：
(a)改善口腔健康；
和/或，(b)抑制口腔病原菌。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述改善口腔健康包括预防和/或治疗口腔溃疡、口臭和/或牙周病；所述牙周病包括牙菌斑、牙龈炎和/或牙结石。
10.如权利要求8或9所述的产品，其特征在于，所述口腔病原菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿密螺旋体和/或福塞类杆菌。
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