CN114350578B - 一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌lp1z及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌LP1Z及其应用。植物乳杆菌LP1Z，其于2022年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62256。（1）本发明中所涉及的益生菌能够产生有机酸、溶菌酶等多种活性抗菌物质，能够有效抑制胃部幽门螺杆菌的生长；（2）在胃部存活率高，能够在胃部定植，体内能够与致病菌竞争结合位点，有效降低胃部幽门螺杆菌的感染率；（3）能够改善胃部病理状态，缓解炎症。因此，植物乳杆菌LP1Z在制备预防或治疗Hp尤其是多药耐药Hp感染的产品（如药品）中，具有巨大的应用前景。

Description

一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌 LP1Z及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，具体涉及一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌LP1Z及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种革兰氏阴性、微需氧螺旋状细菌，其感染会引起多种胃肠道疾病，是导致胃炎、胃溃疡甚至胃癌的关键因素之一。1994年，Hp被世界卫生组织确定为第Ι类致癌因子，因此开展预防和治疗幽门螺杆菌的研究具有极大的应用价值。

全球学者在2011年发布的马斯特里赫特/佛罗伦萨共识中指出，所有确诊Hp感染的患者均需要进行根除治疗。指南同时指出，HP的主要治疗手段是采用抗生素联合质子泵抑制剂、铋剂治疗。虽然目前市场上不断涌现各类型新型抗生素，但目前只有六种抗生素被证明在体内有效，分别是阿莫西林（Amoxicillin，AMX）、克拉霉素（Clarithromycin，CLR）、左氧氟沙星（Levofloxacin ，LVX）、甲硝唑（Metronidazole，MTZ）、四环素和利福平。然而由于安全性、副作用及治疗费用的问题，四环素和利福平在临床实践中的使用受到了限制。另一方面，目前Hp对于多种抗生素的耐药性也在逐步增高，导致了Hp的预防和治疗面临更大的挑战。因此，寻找一种新的抗Hp感染方案，应对目前Hp广泛流行及多药耐药的问题，具有重要意义。

近年来越来越多的报道指出，益生菌制剂能够抑制Hp，具有良好的预防和治疗Hp感染的功能。

乳酸菌是一类具有长久安全食用历史的公认安全（Generally recognized assafe， GRAS）的食品级微生物，可广泛应用于食品、药品的制造，适用人群极广。如干酪乳杆菌能明显减少Hp阳性患者体内菌量，格氏乳杆菌具有抑制Hp生长的作用。进一步的机制研究指出，益生菌通过多种机制拮抗Hp感染：（1）分泌乳酸、短链脂肪酸、过氧化氢以及细菌素等代谢物质抑制Hp生长；（2）抑制Hp尿素酶活性从而降低其在胃部的存活率；（3）增加胃粘膜黏液层厚度、促进粘膜表面粘蛋白及前列腺素E2的分泌等，保护胃肠粘膜；（4）通过调节机体对病原菌的免疫反应，增强免疫细胞对Hp的清除作用。

但是，目前暂无研究明确指出益生菌能解决目前多药耐药Hp的感染问题。本专利就目前全球广泛流行的Hp多重耐药问题，开发了一株可分泌新型抗菌物质、在体内外均具有良好抗Hp尤其是多药耐药Hp的益生微生物，具有广阔的应用前景和深远的社会价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1Z及其在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染产品中的应用。植物乳杆菌LP1Z可通过拮抗多药耐药幽门螺杆菌的生长，有效预防和治疗幽门螺杆菌感染导致的胃部炎症。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明的第一个目的是提供一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1Z，其于2022年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62256。

本发明的第二个目的是提供上述植物乳杆菌LP1Z在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌尤其是多药耐药幽门螺杆菌感染产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗幽门螺杆菌尤其是多药耐药幽门螺杆菌感染产品。

包括利用植物乳杆菌LP1Z制备成幽门螺杆菌尤其是多药耐药幽门螺杆菌的抑制剂，或是制备成幽门螺杆菌尤其是多药耐药幽门螺杆菌感染的治疗药物或是预防药物。

本发明所述的植物乳杆菌LP1Z具有产溶菌酶并拮抗Hp标准菌株ATCC 43504的作用，还具有拮抗多药耐药幽门螺杆菌GZ6B5（GDMCC No：61571）的作用。

本发明所述的植物乳杆菌LP1Z在胃部存活率高，能够在胃部定植，体内能够与致病菌竞争结合位点，有效降低胃部幽门螺杆菌的感染率。

本发明所述的植物乳杆菌LP1Z能够改善胃部病理状态，缓解炎症。

本发明所述的植物乳杆菌LP1Z除了能够在胃部与幽门螺杆菌竞争胃上皮细胞的结合位点，其还能够产生活性抑菌物质溶菌酶抑制幽门螺杆菌的生长。

本发明的第四个目的是提供特异识别植物乳杆菌LP1Z的靶标核苷酸序列，其如SEQ ID No.2所示。该靶标的特征在于其按实施方案操作，能特异区分该菌株与其它乳杆菌分离株。

本发明的第五个目的是提供鉴别植物乳杆菌LP1Z的引物组，具体为：5’-GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’- CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’。

本发明的第六个目的是提供一种鉴别植物乳杆菌LP1Z的方法，是以上述引物组作为扩增引物对待测菌进行PCR反应扩增，如果扩增出615bp的产物，则为植物乳杆菌LP1Z，如果没有扩增出615bp的产物，则不是植物乳杆菌LP1Z。

本发明的第七个目的是提供上述植物乳杆菌LP1Z在产溶菌酶M1中的应用，溶菌酶M1具体序列为：

MTKRQHYRPVYAKTRWARWRYRLGWLLVLLVIIGSVWGGLAWLRWRSDAVVSGFDVRGVAVSQNDGYLDFAALQNDGLKFVYLHATQGASYTDDNFASNYERIVGTSLGVGVIHTFSFSSTAAAQAAYFEKTVGDSIGNLPIAIQVQYYGDYTDQTIAVRKSRAKLKALVTTLTQDYNRSCVVWSTPAVAKQIVKPALKDTDLWLDTAKTHQQGRRVMFMHYSDRAVYRQNGTRQEFAGILFNGSVTAYNKVVAQGLN，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明中的益生菌来源于中国广东省梅州市世界长寿之乡，为本土来源的优良菌株。

2、与传统抗幽门螺杆菌的抗生素相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。

3、本发明具有良好的抗幽门螺杆菌尤其是多药耐药幽门螺杆菌的作用，具体体现为：

（1）本发明中所涉及的益生菌能够产生有机酸、溶菌酶等多种活性抗菌物质，能够有效抑制胃部幽门螺杆菌的生长；

（2）在胃部存活率高，能够在胃部定植，体内能够与致病菌竞争结合位点，有效降低胃部幽门螺杆菌的感染率；

（3）能够改善胃部病理状态，缓解炎症。

因此，植物乳杆菌LP1Z在制备预防或治疗Hp尤其是多药耐药Hp感染的产品（如药品）中，具有巨大的应用前景。

Lactiplantibacillus plantarum LP1Z于2022年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62256。

附图说明:

图1是植物乳杆菌LP1Z与其它乳杆菌商品株对幽门螺杆菌标准菌株的抑制作用。

图2是植物乳杆菌LP1Z对多药耐药幽门螺杆菌的抑制作用。

图3是植物乳杆菌LP1Z在体内对幽门螺杆菌定植的抑制作用，图注：“←”表示幽门螺杆菌GZ6B5或SS1，“

”表示植物乳杆菌LP1Z。

图4是植物乳杆菌LP1Z与其它乳杆菌商品株对幽门螺杆菌相关毒素诱发的炎症因子失调的改善作用，图注：*表示和NC（阴性对照）组比p<0.05，**表示p<0.01，6B5为GZ6B5。

图5是植物乳杆菌LP1Z对胃部病理状态的缓解效果。

图6是植物乳杆菌LP1Z产生的溶菌酶M1的抗幽门螺杆菌效果。

图7是植物乳杆菌LP1Z的分子靶标验证，图注：M为DNA marker，1为植物乳杆菌LP1Z经分子靶标序列（SEQ ID NO.2）扩增后的PCR产物电泳图，2-94为其他乳杆菌经分子靶标序列扩增后的PCR产物电泳图。

图8是植物乳杆菌在小鼠胃部的定植情况，图注：1和2为control对照组，3和4为空白water，5和6为SS1+LP1Z组，7和8为植物乳杆菌LP1Z组。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下

MRS琼脂平板（g/L）：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0ml/L、K₂PO₄·3H₂0 2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO₄·7H₂0 0.2g/L、MnSO₄·4H₂0 0.05g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

MRS肉汤培养基（g/L）：酪蛋白酶消化物10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、MgSO₄·7H₂0 0.2g/L、MnSO₄·4H₂0 0.05g/L、K₂PO₄·3H₂0 2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0g/L，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

幽门螺杆菌琼脂培养基基础（g/L）：酵母浸粉3.0g/L、酪蛋白胨12.0g/L、动物组织消化物5.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L、玉米淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂13.5g/L，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

幽门螺杆菌选择性添加剂（g/L）：万古霉素1g/L、两性霉素B 0.5g/L、甲氧苄氨嘧啶2g/L、头孢磺啶1g/L，溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。

幽门螺杆菌选择性培养基平板：幽门螺杆菌琼脂培养基基础100ml、无菌胎牛血清10ml或无菌脱纤维羊血7ml、幽门螺杆菌选择性添加剂1ml，其制备方法是先将幽门螺杆菌琼脂培养基基础混合均匀并灭菌，待冷却至50-55℃加入无菌胎牛血清或无菌脱纤维羊血以及幽门螺杆菌选择性添加剂制得。

实施例1 植物乳杆菌LP1Z的分离、鉴定

1.1、植物乳杆菌LP1Z的分离与保藏

采集世界长寿之乡——中国广东省梅州市蕉岭县健康百岁老人的粪便作为样本，在无菌环境下，取0.1g粪便加入10ml MRS液体培养基，震荡混匀后于37°C厌氧条件下富集培养24h，吸取0.5 ml菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10^-1至10^-8稀释梯度菌悬液，选取10^-6、10^-7、10^-8三个梯度菌悬液，分别吸取100μl至MRS琼脂培养基，使用涂布棒涂抹均匀，再于37°C厌氧条件下培养48h。挑取平板上形态典型的菌落至MRS琼脂培养基上进行划线纯化，纯化后挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，37°C厌氧培养48h，30%甘油保藏于-80°C超低温冰箱中。

1.2、植物乳杆菌LP1Z的鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒（Mabio，CHINA）进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix（Dongshengbio，CHINA）进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’； 下游引物序列为1492R：5’-CTAC GGCTAC CTT GTT ACG A-3’。PCR反应条件为：预变性95°C 5 min；95°C 30 s，56°C 30 s，72°C1min 30s共35个循环，72°C退火延伸10 min。对PCR产物进行切胶回收，后进行Sanger测序（由苏州金唯智生物科技有限公司完成）。获得的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。将该序列比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov），结果提示其与植物乳杆菌同源性最高，命名为植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum LP1Z，其于2022年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：62256。

实施例2 乳杆菌的培养及乳杆菌发酵液的制备

2.1、乳杆菌的培养

将植物乳杆菌LP1Z从甘油管中接种至MRS琼脂平板上，于37°C厌氧培养48h，观察其菌落形态。植物乳杆菌表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄。在显微镜下对其菌体进行观察，发现植物乳杆菌为革兰氏阳性，菌体呈现圆端短杆状。

挑取植物乳杆菌LP1Z单菌落接入MRS肉汤培养基中，于37°C厌氧培养48h，制作生长曲线。发现该菌在37°C培养12h达稳定期，其发酵方式为异型发酵，可从葡萄糖产酸产气。

2.2、植物乳杆菌LP1Z发酵液的制备

挑取植物乳杆菌LP1Z单菌落接入MRS肉汤培养基中，于37°C厌氧培养48h。采用10000 ×g 、4°C离心15min，获取发酵上清，即为植物乳杆菌LP1Z发酵上清液。采用0.22μm滤膜过滤，获得植物乳杆菌LP1Z发酵的无细胞上清液，冻存于-80°C待用。

实施例3 植物乳杆菌LP1Z体外抗幽门螺杆菌能力的评估

3.1、幽门螺杆菌的培养

幽门螺杆菌 ATCC 43504及GDMCC No：61571均购自广东省微生物菌种保藏中心，其中ATCC 43504分离自澳大利亚一位慢性胃炎患者；GDMCC No：61571（公开于专利申请CN202110612046.9中）分离自我国广东地区某慢性胃炎患者胃粘膜组织样本，对阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素五种抗生素耐药。

从保种管中活化，吸取100μL保种液于含有10%无菌胎牛血清的幽门螺杆菌选择性培养基平板上进行涂布，于37℃，微需氧环境中（5%O₂、10%CO₂、85%N₂）培养5-7天。挑取平板上形态典型的菌落至幽门螺杆菌选择性培养平板上进行划线纯化，纯化2次。将纯化过的幽门螺杆菌用接种环刮下来，重悬于生理盐水。

3.2、植物乳杆菌LP1Z发酵液体外抗幽门螺杆菌能力评估

调整幽门螺杆菌（ATCC 43504和GDMCC No：61571）的悬浊液使其达到细菌量为1×10⁸CFU/mL，吸取菌悬液100μL加入到含有10%无菌胎牛血清的幽门螺杆菌选择性培养基平板中进行涂布，平板上放置已灭菌的牛津杯，每个牛津杯中加入100μl的乳杆菌发酵上清液（其制备方法可以参照植物乳杆菌LP1Z发酵液）。冰箱中冷藏6h后，将培养平板转移到37℃、微需养环境中（5% O₂、10% CO₂、85% N₂）培养，72小时后观察并测量抑菌圈的大小。各益生菌对幽门螺杆菌（ATCC 43504和GDMCC 61571）的抑菌情况见表1。

对比Lactiplantibacillus plantarum LP1Z和市售商品株Lactobacillus Johnsonii MH-68和Lacticaseibacillus paracasei Shirota的发酵液在体外对幽门螺杆菌ATCC 43504的抑制作用，培养72小时后得出结果。如图1所示，Lactiplantibacillus plantarum LP1Z对于幽门螺杆菌ATCC 43504的抑制作用都高于两株市售商品株（Lactobacillus Johnsonii MH-68抑菌圈直径20.0±0.1mm、Lacticaseibacillus paracasei Shirota抑菌圈直径22.0±0.1mm），其对应Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的抑菌圈直径为26.0±0.1mm。

检测Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的发酵液在体外对幽门螺杆菌GDMCCNo：61571的抑制作用，于培养72小时后进行观察。如附图2所示，Lactiplantibacillus plantarum LP1Z对于GDMCC 61571有较好的抑制作用，其对应的抑菌圈直径为25.0±0.1mm；市售商品株Lacticaseibacillus paracasei Shirota对GDMCC 61571的抑菌直径为20.0±0.1mm，小于Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的抑菌作用；其他分离益生菌以及商品株Lactobacillus Johnsonii MH-68对GDMCC 61571没有抑菌效果。

实施例4 Lactiplantibacillus plantarum LP1Z动物体内抗幽门螺杆菌能力的评估

4.1实验动物和饲养条件

每组选用20只6-8周龄的C57BL/6小鼠进行实验。实验前动物在动物房环境适应性喂养5天。实验动物及实验动物房应符合国家相关规定，选用标准配合饲料，饮水不限制。

4.2实验分组

本实验一共设置8个分组，其中第一组为空白对照组（Normal Control，NC），第二组为单纯灌胃Lactiplantibacillus plantarum LP1Z组（LP1Z），第三组为感染幽门螺杆菌SS1组（SS1为ATCC 43504的动物驯化株，购自广东省微生物菌种保藏中心）（SS1），第四组为感染幽门螺杆菌GDMCC No：61571组（GZ6B5），第五组应用LP1Z预防SS1感染组（SS1+LP1Z），第六组应用LP1Z预防GDMCC No：61571感染组（GZ6B5+LP1Z），第七组应用Shirota预防SS1感染组（SS1+Shirota），第八组应用Shirota预防GDMCC No：61571感染组（GZ6B5+Shirota）。其中SS1+Shirota组和GZ6B5+Shirota组分别为SS1+LP1Z组和GZ6B5+LP1Z组的阳性对照组。

4.3实验步骤

实验正式开展前，对六组小鼠均进行抗生素（氨苄青霉素10mg/ml、庆大霉素1.2mg/ml、阿奇霉素10mg/ml，混合抗生素0.3ml/只，1次/天）连续灌胃3天。然后从第4天开始，每次灌胃菌悬液之前先施加质子泵抑制剂（奥美拉唑配成5mg/ml的溶液，按大鼠体质量30mg/kg每天灌胃一次），SS1组、GZ6B5组、SS1+LP1Z组、GZ6B5+LP1Z组、SS1+Shirota组和GZ6B5+Shirota组的每只小鼠采用浓度为1×10⁹CFU/ml幽门螺杆菌菌悬液500μL进行隔天灌胃。SS1+LP1Z组、GZ6B5+LP1Z组、SS1+Shirota组和GZ6B5+Shirota组在灌胃Hp之前，每天分别灌胃浓度为1×10⁹CFU/ml LP1Z或Shirota菌悬液500μL，SS1组和GZ6B5组采用同等剂量的生理盐水进行灌胃。NC组将Hp和乳杆菌的菌悬液都换成同等剂量的生理盐水进行灌胃，LP1Z组每天灌胃浓度为1×10⁹CFU/ml LP1Z菌悬液500μL，之后将Hp菌悬液换成同等剂量的生理盐水。

饲养结束后，断颈处死实验动物，采用无菌无酶的手术刀和手术剪进行解剖取胃。将胃组织分成两份，一份置于4%多聚甲醛固定，另一份迅速转移至-80℃冰箱，用于后续实验。

4.4 LP1Z对动物胃部幽门螺杆菌的抑制效果

4.4.1幽门螺杆菌特异性新检测靶标的定量检测方法

幽门螺杆菌进行定量检测的qPCR扩增反应引物见表1，具体操作如下：

①模板DNA制备：取小鼠胃组织0.1g，采用QIAamp® PowerFecal® Pro DNA Kit试剂盒进行胃粘膜微生物DNA提取，作为待检测模板；

②qPCR检测体系及扩增程序：

③qPCR结果读取：

利用Roche LightCycler®96荧光定量扩增仪对体系进行扩增检测，利用软件LightCycler®96 SW 1.1读取扩增结果。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有Hp；如果不产生荧光信号，则样品中不含有Hp。

应用生理盐水将浓度为1×10⁹CFU/mL的Hp ATCC 43504按照10倍梯度进行稀释，得浓度为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL的菌株纯培养物，对不同浓度的菌株纯培养物进行DNA提取，按上述qPCR方案进行样本Hp定量检测，每个浓度样品分别进行三次平行实验。

绘制标准曲线：以样品中不同稀释梯度的纯Hp菌落形成单位对数值（log CFU）为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为Hp定量检测的标准曲线。所述幽门螺杆菌的拟合标准曲线为y = -2.044x + 35.36，相关系数R²为0.9813。

结果提示，0.1g SS1组小鼠胃组织的平均Ct值为28.69，可知小鼠胃组织中SS1的定植量为10^3.3CFU/g；0.1g GZ6B5组小鼠胃组织的平均Ct值为29.28，可知小鼠胃组织中多药耐药株GZ6B5的定植量为10³CFU/g；0.1g SS1+LP1Z组小鼠胃组织未检测到阳性，可知植物乳杆菌LP1Z可完全清除Hp感染小鼠胃组织中定植的SS1；0.1g GZ6B5+LP1Z组小鼠胃组织的平均Ct值为30.715，可知该组胃内Hp定植量下降为10^2.3CFU/g，即植物乳杆菌LP1Z对感染多重耐药Hp小鼠胃组织中Hp具有较强的清除作用。

4.4.2 LP1Z在体内对幽门螺杆菌定植的抑制作用

4.4.2.1标本切片的制备

取在4%多聚甲醛中固定48小时以上的胃组织，用流水漂洗过夜，次日进行如下步骤的石蜡包埋：

70%乙醇1h→80%乙醇1h→90%乙醇1h→95%乙醇1h（Ⅰ）→95%乙醇1h（Ⅱ）→100%乙醇1h（Ⅰ）→100%乙醇1h（Ⅱ）→正丁醇1h→二甲苯30min→溶蜡1.5h（Ⅰ）→溶蜡2h（Ⅱ）→包埋。

常规胃组织石蜡切片，厚度5μm，将制好的切片于室温下晾干过夜，随后放入4°C冰箱密封保存，备用。

4.4.2.2革兰氏染色

将上述石蜡切片置于二甲苯中脱蜡 10min。迅速移入二甲苯与无水乙醇（1:1）混合液中 5min。 切片再依次经 100%、95%、85%、70%乙醇入蒸馏水，各级均为 3min。

用草酸铵结晶紫染1分钟，自来水冲洗。滴加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分。加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。蕃红染色液染2分钟后，自来水冲洗。干燥后，在切片表面滴加香柏油，进行镜检。革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

4.4.2.3结果

幽门螺杆菌是革兰氏阴性菌呈现红色，植物乳杆菌LP1Z是革兰氏阳性菌呈紫色。如附图3所示，SS1组和GZ6B5组的幽门螺杆菌均成功定植于胃部，且GZ6B5的定植能力比SS1强，同时，GZ6B5的细菌细胞更加完整，活性更好。GZ6B5+LP1Z组和SS1+LP1Z组的幽门螺杆菌定植量均减少，植物乳杆菌LP1Z在胃部具有较强的定植能力，这种定植能力能够与幽门螺杆菌竞争胃粘膜的结合位点，减少幽门螺杆菌的定植量。

4.4.3 乳杆菌对Hp相关毒素诱发的炎症因子失调的改善作用

采用HiPure Total RNA Mini Kit试剂盒提取胃组织总RNA，并采用Evo M-MLV反转录试剂预混液逆转录成 cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II进行qPCR，对小鼠胃组织中促炎因子TNF-α、IL-8的表达进行分析，所用引物见表3。

10μL反应体系中含有5μLSYBR Premix Ex Taq II（2x），0.5μL正向引物和反向引物，1μL cDNA，其余用无菌无酶的水补至10μL。反应程序为：95℃预变性1min，95℃变性5s，60℃延伸1min，40个循环。分析结果得出各组内参基因和目的基因Ct值，运用公式2^-△△Ct计算TNF-α和IL-8的相对表达量。

结果如图4所示，与NC组相比， SS1组及GZ6B5组小鼠胃部促炎因子TNF-α和IL-8均明显升高（p<0.05），在灌胃LP1Z菌悬液之后，胃部促炎因子TNF-α和IL-8恢复至正常水平，与SS1组和GZ6B5组相比呈现明显下调的趋势。采用Shirota进行灌胃的组别，促炎因子同样下调至正常水平，但是LP1Z的调节效果更好。

4.5 LP1Z对Hp相关性胃炎的缓解效果

4.5.1 H&E染色

将实施例4.4.2.1中的石蜡切片进行脱蜡，方法同上。转入苏木精染液染色 8min。以蒸馏水洗去多余染液 1%盐酸酒精（70%乙醇配制）分色约 25s（镜检监控，以细胞核与核内染色质清晰为度）。立即流水冲洗约 15%，至细胞核呈蓝色。双蒸水短暂冲洗。随即用 1%伊红染液着色 2min。再依次经 70%、85%、95%、100%乙醇逐级脱水，各级均需 3min。切片经二甲苯透明（2次）后，拭净多余二甲苯，滴加适量中性树胶，迅速加盖玻片封固，于光镜下观察并摄片记录。

4.5.3结果

如图5所示，NC组和LP1Z组胃黏膜上皮细胞排列整齐、丰盈完整、无脱落，粘膜下层形态正常；SS1模型组和GZ6B5组粘膜薄，腺体萎缩，部分粘膜脱落，出现刷状缘的情况，胃固有层可见炎性细胞浸润，且GZ6B5组的病变情况明显比SS1模型组严重；SS1+LP1Z组和GZ6B5组的小鼠胃组织没有明显的炎症反应，炎性细胞浸润的情况以及病变形态得到缓和。

实施例5 LP1Z拮抗幽门螺旋杆菌的活性物质

5.1有机酸排除实验

将Lactiplantibacillus plantarum LP1Z、Lacticaseibacillus paracasei Shirota的发酵上清液和对照的MRS肉汤调整至pH=4、pH=4.5、pH=5、pH=5.5、pH=6、pH=7，分别进行牛津杯抑菌试验。在pH=5时，参考菌株Lacticaseibacillus paracasei Shirota的发酵上清液和MRS肉汤均没有抑菌活性，只有Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的发酵上清液有抑菌活性（图6），因此可以表明LP1Z发酵液中除了有机酸还存在其他抑菌活性物质。

5.2过氧化氢作用排除实验

吸取Lactiplantibacillus plantarum LP1Z、Lacticaseibacillus paracasei Shirota的发酵上清液和对照的MRS肉汤5 mL加入 50 mg 的过氧化氢酶至完全溶解，并将pH 调为 7.0，置于 37℃水浴锅中水浴2 h，再将 pH 调为5，以未使用过氧化氢酶处理的排除酸干扰发酵液作为对照，用牛津杯法进行抑菌实验。Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的发酵上清液经过处理后仍然具有抑菌活性（图6）。

5.3蛋白酶敏感实验

Lactiplantibacillus plantarum LP1Z、Lacticaseibacillus paracasei Shirota的发酵上清液和对照的MRS肉汤各取3 份每份2.0 mL调整 pH值，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分别为 2.0、6.0 和 7.4 ，调整使其终浓度为 1.0 mg/mL的量加入各发酵液，在合适的温度下水浴 4 h 后调回原始 pH 值，测定酶处理前后的抑菌活性。

如附图6所示，植物乳杆菌LP1Z的发酵上清液在处理的过程中一直存在抑菌活性，其发酵上清液经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理后，抑菌活性有所下降，可知Lactiplantibacillus plantarum LP1Z发酵液中的抑菌物质对蛋白酶的处理较为敏感。因此 ，可以基本确定Lactiplantibacillus plantarum LP1Z能够产生蛋白质或肽类性质的抑菌物质。并且Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的抑菌效果优于Lacticaseibacillus paracasei Shirota。

5.4 LP1Z抗菌活性物质的基因组挖掘

采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对植物乳杆菌LP1Z进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina (CISTRO, CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit (Illumina,USA)试剂盒测序。三代测序采用Rapid Barcoding Sequencing Kit (Nanopore, UK)建库，后采用R9.4.1芯片(Nanopore, UK)测序。下机数据分别采用Trimmomatic（v0.39）及Filtlong（v0.2.0）软件进行质控，后采用Unicycler（v0.4.8）软件进行组装。组装后Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的基因组采用Quast（v5.0.2）软件进行基因组质控评估。

测序发现植物乳杆菌LP1Z基因组数据中含有溶菌酶M1（Lysozyme M1）的完整基因序列。Lysozyme M1的分子量（Mw）为28983.96Da，等电点为9.77。

实施例6 LP1Z基因组及表型的安全性评价

6.1 LP1Z的基因组特征及安全性评估

采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对Lactiplantibacillus plantarum LP1Z进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法和测序方法同实施例5.4，采用Abricate（v0.8.13）软件查找并注释毒力基因及耐药基因。

经测序可知Lactiplantibacillus plantarum LP1Z基因组大小为3.62Mb，GC比为44.22%，其基因组含3546个CDS、0个重复区、71个tRNA和15个rRNA，不含质粒。采用prokka软件注释发现Lactiplantibacillus plantarum LP1Z基因组中含有2474个有功能的编码基因以及1072个假想蛋白。

采用Abricate软件比对VFDB（Virulence Factor Database）、ARG-Annot（Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation）、CARD（the Comprehensive AntibioticResearch Database）、Resfinder数据库，均未发现该菌含有毒力基因或耐药基因。

6.2 LP1Z对抗生素的敏感性

根据欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）标准，使用微量肉汤稀释法检测植物乳杆菌LP1Z对8种抗生素的敏感性。该8种抗生素为：氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。将生长至对数生长期的乳杆菌悬液调整至1.5×10⁸CFU/mL，后加入不同浓度的抗生素稀释剂（浓度从0.5-64μg/ml），37°C厌氧培养48小时。48小时后读取菌株对每种抗生素的最小抑菌浓度（minimal inhibitconcentration，MIC），根据EFSA提供的细菌耐药性标准判定菌株对该抗生素为敏感（sensitive，S）、中介（intermediated，I）、耐药（resistant，R）。

如表4所示，Lactiplantibacillus plantarum LP1Z对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的MIC依次为：0.5μg/ml、2μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、16μg/ml、0.5μg/ml、4μg/ml、4μg/ml，即该菌对EFSA规定的8种抗生素菌敏感。

6.3 LP1Z的溶血试验

在无菌环境下，用接种环接种目标乳杆菌于血平板上，37°C厌氧培养48h，观察溶血现象。48h后观察Lactiplantibacillus plantarum LP1Z菌落周围未出现溶血现象，而阳性对照金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌落周围出现透明溶血环，提示Lactiplantibacillus plantarum LP1Z不具有溶血风险。

6.4 LP1Z对小鼠的安全性评价

对小鼠进行LP1Z灌胃，方法同实施例4。研究发现，灌胃1周后小鼠未出现死亡、体重减轻、腹泻等不良症状。解剖胃部进行病理检测，未见明显炎症细胞浸润，qPCR检测未发现胃部组织炎症因子升高，提示LP1Z在小鼠体内应用安全。

实施例7 LP1Z的特异分子靶标识别

7.1 LP1Z的特异分子靶标挖掘

采用Prokka（v1.11）、Roary（v3.11.2）软件对Lactiplantibacillus plantarum LP1Z和NCBI数据库内其他73株发酵乳杆菌及其它1400株乳杆菌的全基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins（v2.4.1）识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的Lactiplantibacillus plantarum LP1Z有别于其它乳杆菌的特异序列。采用Oligo（v7）软件针对特异序列进行引物设计，获得识别该菌的特异性分子靶标序列SEQ ID No.2。

7.2.乳杆菌特异分子识别靶标有效性验证

采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及琼脂糖电泳验证Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法同前。扩增引物为：5’- GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’-CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’。

PCR结束后取5-10μl PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳。若Lactiplantibacillus plantarum LP1Z能在615bp处形成单一特异条带，而其他乳杆菌不能形成615bp的单一条带，则说明该对靶标具有良好识别Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的效能。

如附图7和表5所示，除Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的DNA经5’-GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’- CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’扩增后形成615bp的特异性扩增产物外，其余乳杆菌分离株均未见特异扩增产物形成。结果提示分子靶标序列5’-GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’- CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’能特异的鉴别Lactiplantibacillus plantarum LP1Z与其它乳杆菌。

实施例8 乳杆菌益生性能评价

8.1 乳杆菌的耐受人工胃液实验

将PBS（pH7.4）缓冲液用0.1mol/L HCl 调节pH值等于3.0，分别加入胃蛋白酶（3.0g/L），溶解后用0.22μm的无菌滤膜过滤，现用现配。将制备好的菌液以2%接种量接种于10mL MRS液体培养基中，37℃无氧条件下静置培养18-24h后，4000×g，10min离心收集菌体，PBS（pH7.4）洗涤菌体3次，用PBS调整菌液浓度到10⁸-10⁹CFU/mL（参考OD₆₀₀为0.4-1.0）之间。取1mL PBS重悬的乳杆菌菌液加入到5mL的模拟胃液中，同时加入1.5mL 0.5%（w/v）NaCl混匀，迅速放入37℃培养箱，培养0h和3h后，以无菌生理盐水按1:10梯度稀释，吸取100μL稀释液用一次性涂布棒均匀涂布于MRS固体培养基中，37℃无氧条件下培养48h，进行乳杆菌活菌计数，按照公式计算LP1Z在pH 3.0情况下3h的存活率。存活率（%）=3h乳杆菌的存活数/0h乳杆菌的存活数×100%。经计算，Lactiplantibacillus plantarum LP1Z在模拟胃液中3h的存活率为77.73%。

8.2 LP1Z的粘附定植能力测定

8.2.1 LP1Z体外细胞黏附量测定

采用人胃黏膜上皮GES-1细胞与细菌共培养进行该菌的黏附定植能力评估。

收集Lactiplantibacillus plantarum LP1Z的菌体，PBS洗涤2次后，用生理盐水重悬菌体。GES-1细胞提前铺满6孔板，共设置2个取样时间点，分别为0h和3h，每种细菌在不同的取样时间点设置3个生物学平行。将孔内的培养液吸出并废弃，用PBS洗涤两次，向孔中加入Lactiplantibacillus plantarum LP1Z菌悬液，调整细胞和细菌的比例为1:10，细胞培养体系为2ml，置于37°C、5%CO₂培养箱中培养，每个时间点取，6孔板进行测定。

在不同取样时间点，吸弃相应孔中的培养液，用PBS洗涤2次，每个孔中加入1ml胰酶消化4分钟，消化完成后，加入1ml生理盐水。每个孔中的混合液，进行梯度稀释，稀释到合适的浓度后，吸取100μl 在MRS平板中进行涂布，培养于37℃厌氧环境中，48h后进行平板菌落计数。黏附率（%）=3h乳杆菌的活菌数/0h乳杆菌的活菌数×100%。实验发现，Lactiplantibacillus plantarum LP1Z在3h后的黏附率为65.79%。

8.2.2 LP1Z在小鼠胃部定植能力测定

取NC组、SS1+LP1Z组和LP1Z组小鼠胃组织0.1g，采用QIAamp^® PowerFecal^® ProDNA Kit试剂盒进行微生物DNA提取。DNA模板进行PCR（water组用于排除气溶胶污染，用无菌无酶的ddH₂O代替DNA模板进行PCR），反应体系和反应条件同实施例7.2，每组设置2个生物学重复。PCR结束后取5-10μl PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳，若在615bp处形成单一特异条带，说明该分组小鼠胃组织中含有Lactiplantibacillus plantarum LP1Z。如图8，SS1+LP1Z组和LP1Z组形成单一特异条带，说明Lactiplantibacillus plantarum LP1Z成功定植于这两组小鼠胃部。

实验以循环阈值（Cycle threshold, Ct）为横坐标和不同稀释梯度的纯菌菌落形成单位对数值（log CFU）为纵坐标建立标准曲线进行定量，具体实验方法同实施例4.4.1。标准曲线为y= -0.2973x + 15.139，R² =0.7578。

LP1Z的qPCR引物为其特异性的分子靶标引物，引物序列为5’-GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’- CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’。结果提示，0.1g LP1Z组小鼠胃组织的平均Ct值为29.83，因此可知小鼠胃组织中LP1Z的定植量为10⁷CFU/g。而在SS1+LP1Z组，0.1g LP1Z组小鼠胃组织的平均Ct值为32.76，计算可知小鼠胃组织中LP1Z的定植量为2.5×10⁶CFU/g。

上述结果提示Lactiplantibacillus plantarum LP1Z无论在正常体内还是在Hp感染模型中均有较好的胃部定植潜能，因此具有较好的应用前景。

虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

广东环凯生物科技有限公司

广东科环生物科技有限公司

<120> 一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌LP1Z及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌LP1Z(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 1

aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60

aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc 120

atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga ttagcttact 180

ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240

ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcacc 300

agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc atgtccccga 420

agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480

tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540

tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct gcagcactga 600

agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg gtatggacta ccagggtatc 660

taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca gttacagacc agacagccgc 720

cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat ggagttccac 780

tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac ttcttcggtt gagccgaagg 840

ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa atccggacaa 900

cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960

aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt cttctttaac aacagagttt 1020

tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttt cgtccattgt 1080

ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg 1140

ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg tgagccgtta ccccaccatc 1200

tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccga agccatcttt caaactcgga 1260

ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaggtgtta tcccccgctt 1320

ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact cactcaaatg taaatcatga 1380

tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgactgca 1418

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌LP1Z(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 2

atgaatagta gtcaaaaatt tttagacgaa atagaaggaa aaaacataga ttttttaatt 60

ggtgctggcg caagttcaga gtatataagt accctttcta ttggagaaag gggaaatgaa 120

catagcattg aagacctttt aactgactat aattctcaag aagatgcaca agcttttttg 180

aaactgttat tttttgattc atcagtcaaa aggggattag ttagtactga cgacattcca 240

gaaggagcaa aaaatactct ggaatcttat aaaaaactaa ttgagaatat gcttactctt 300

tcccgtcaca atggatttga aaggcctaaa aggaccaata tcttcactac aaattatgat 360

actttttttg aagctgcttt cgatgatatt gctctcgatc atcctttagc tgtttttaat 420

gatggttcaa gagggttctt tacacgtgaa gttagttatg aaaactatta ttttaatgtt 480

actcacagtg gttcaattga tacttttcgt agggaaatcc catcagttaa tctttataaa 540

ttacatggtt cactttcatg gtcgaaaagg gaattaaagg ataaggaaat tatcacatca 600

agtctaaaaa ataagttgct tatggaaata acccaagaat cagatagttg ttgtagtacg 660

ttggggctag gagaagaaac caaaataaac agtaaagaag atattcaaaa ataccttaaa 720

cttatagatg aaaatagtat tttaaagcaa agtcttcaaa aatttgaaag tatgtattca 780

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tgttttggct tttcctttaa ggatgaacac attttggatt tattaaaaag atctatttct 960

aatccatctt tacagatatt cattattcca tatagtaagt cagatattga atatattaat 1020

tctgtgttaa agggatatac tgatgtgacc tttttaaggt caccaaagag tgaacatggg 1080

aatttcagtg tgctaaataa gtttttagaa ggagtttatg atattgaaac cagataa 1137

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 1. 植物乳杆菌LP1Z(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 3

Met Thr Lys Arg Gln His Tyr Arg Pro Val Tyr Ala Lys Thr Arg Trp

1 5 10 15

Ala Arg Trp Arg Tyr Arg Leu Gly Trp Leu Leu Val Leu Leu Val Ile

20 25 30

Ile Gly Ser Val Trp Gly Gly Leu Ala Trp Leu Arg Trp Arg Ser Asp

35 40 45

Ala Val Val Ser Gly Phe Asp Val Arg Gly Val Ala Val Ser Gln Asn

50 55 60

Asp Gly Tyr Leu Asp Phe Ala Ala Leu Gln Asn Asp Gly Leu Lys Phe

65 70 75 80

Val Tyr Leu His Ala Thr Gln Gly Ala Ser Tyr Thr Asp Asp Asn Phe

85 90 95

Ala Ser Asn Tyr Glu Arg Ile Val Gly Thr Ser Leu Gly Val Gly Val

100 105 110

Ile His Thr Phe Ser Phe Ser Ser Thr Ala Ala Ala Gln Ala Ala Tyr

115 120 125

Phe Glu Lys Thr Val Gly Asp Ser Ile Gly Asn Leu Pro Ile Ala Ile

130 135 140

Gln Val Gln Tyr Tyr Gly Asp Tyr Thr Asp Gln Thr Ile Ala Val Arg

145 150 155 160

Lys Ser Arg Ala Lys Leu Lys Ala Leu Val Thr Thr Leu Thr Gln Asp

165 170 175

Tyr Asn Arg Ser Cys Val Val Trp Ser Thr Pro Ala Val Ala Lys Gln

180 185 190

Ile Val Lys Pro Ala Leu Lys Asp Thr Asp Leu Trp Leu Asp Thr Ala

195 200 205

Lys Thr His Gln Gln Gly Arg Arg Val Met Phe Met His Tyr Ser Asp

210 215 220

Arg Ala Val Tyr Arg Gln Asn Gly Thr Arg Gln Glu Phe Ala Gly Ile

225 230 235 240

Leu Phe Asn Gly Ser Val Thr Ala Tyr Asn Lys Val Val Ala Gln Gly

245 250 255

Leu Asn

Claims (9)

1.植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1Z，保藏编号为GDMCC No：62256。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染药品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的幽门螺杆菌是多药耐药幽门螺杆菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的多药耐药幽门螺杆菌是幽门螺杆菌GDMCC No：61571。

5.一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药品，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z作为活性成分。

6.一种特异识别权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z的靶标核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.一种鉴别权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z的引物组，其特征在于，为：5’-GCTGGCGCAAGTTCAGAGT -3’和5’- CTTCTCCTAGCCCCAACGTA -3’。

8.一种鉴别权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z的方法，其特征在于，是以权利要求7所述的引物组作为扩增引物对待测菌进行PCR反应扩增，如果扩增出615bp的产物，则为植物乳杆菌LP1Z，如果没有扩增出615bp的产物，则不是植物乳杆菌LP1Z。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌LP1Z在产溶菌酶M1中的应用，所述的溶菌酶M1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

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