CN115927102A - 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 - Google Patents
一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927102A CN115927102A CN202211552820.2A CN202211552820A CN115927102A CN 115927102 A CN115927102 A CN 115927102A CN 202211552820 A CN202211552820 A CN 202211552820A CN 115927102 A CN115927102 A CN 115927102A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- megaterium
- prisella
- 2203lbz02
- primesteria
- biological agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 title abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 208000012353 Contagious Pleuropneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 12
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 8
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 14
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 235000001484 Trigonella foenum graecum Nutrition 0.000 description 2
- 244000250129 Trigonella foenum graecum Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000001019 trigonella foenum-graecum Nutrition 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 2
- AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N (-)-Florfenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CF)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010227 cup method (microbiological evaluation) Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229960003760 florfenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N thiamphenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N 0.000 description 1
- 229960003053 thiamphenicol Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于微生物及生物制品技术领域，具体涉及一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。该巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCC No.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；依据该巨大普里斯特氏菌制备的生物菌剂不仅对APP具有极强的抑菌效果，也对多重耐药APP也具有极强的抑菌效果，且其制备方法简单，使用方便，无抗生素残留，高效安全。
Description
技术领域
本发明属于微生物及生物制品技术领域，具体涉及一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。
背景技术
猪接触传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，急性者病死率高，给规模化养猪场造成了巨大的经济损失。猪场发生胸膜肺炎后，可采取多种措施防治传染性胸膜肺炎，如抗生素疗法，灭活苗免疫接种，亚单位苗免疫接种等。但是如果长期用抗生素治疗，会加重放线杆菌耐药，出现多重耐药菌株和超级耐药菌株，如不及时进行有效防治，将会严重影响猪群的生长速度和造成更高的死亡率。
为了减少胸膜肺炎放线杆菌对猪群造成的影响，坚持自繁自养和引进无该病原的种猪是最简便、经济、有效的防治途径，加强种猪检疫，做好种猪带菌检测工作，从无病区引种，且在引种时杜绝带菌种猪混入合格种猪中。但受到种猪资源贵、检测方法有限等因素限制；最常用的、最快速、最直接的防治途径是抗生素防治，抗生素防治在一定程度上减少了胸膜肺炎病发生，但同时由过度、过频使用抗生素杀菌剂所带来的兽药残留、食品安全、耐药菌株、环境污染、生态平衡破坏和病原产生抗药性等问题，在很大程度上也限制着抗生素的使用。
基于上述情况，随着健康养殖的发展，人们对无污染、无公害绿色畜产品呼声日益提高，生物防治已经逐渐成为动物细菌性病害防治的研究热点，它在生产方式、兽药残留、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。
目前，生防菌作为生物防治的重要一环，也是动物细菌性病害生物防治研究的热点。因生防菌种类繁多，真菌、细菌、放线菌等类别生防菌均在生产上得到广泛的应用。但是药用植物内生微生物作为生防菌还未见报道。因此亟待开发新的药用植物内生微生物生防菌株，以期在动物细菌性病害、人和自然和谐共存、维护生态平衡和促进农业可持续发展进程中发挥重要的作用。
发明内容
针对目前生物菌防治在多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌防治效果不佳和防控困难的缺陷和问题，本发明提供一株巨大普里斯特氏菌2203LBZ02、菌剂及其在多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌上进行应用。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：一株巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（
Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCCNo.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述的巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌（
Priestia megaterium）2203LBZ02是从中药种子芦巴子中筛选得到。
本发明还提供一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂，包括所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02和/或所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的代谢产物。
本发明还提供一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白大豆琼脂固体培养基上，在28-32 ℃下培养24-48小时；
步骤二、取步骤一培养的菌种接入胰蛋白大豆液体培养基内，在28-32 ℃下培养12-24 h，得种子液；
步骤三、将种子液按照3-5%的接种量接种于发酵培养基中，在28-32℃、转速200-240rpm、pH 7.0-7.5条件下发酵培养24-72小时，收集发酵液，即得微生物菌剂。
上述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，该巨大普里斯特氏菌生物菌剂的活菌浓度为9-12×109cfu/mL。
本发明还提供了一株巨大普里斯特氏菌或依据其制备的生物菌剂在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。
上述的应用，是其在防治普通猪胸膜肺炎放线杆菌及多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。
本发明的有益效果：
本发明从芦巴子种子中分离筛选出的巨大普里斯特氏菌2203LBZ02及依据该巨大普里斯特氏菌制备的生物菌剂不仅对APP具有极强的抑菌效果，也对多重耐药APP也具有极强的抑菌效果。
本发明的生物菌剂制备方法简单，按照口服、伴料或饮水中的任一种方式使用对猪接触传染性胸膜肺炎均能达到很好的治疗效果，使用方便，无抗生素残留，高效安全。
附图说明
图1为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性。
图2为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性。
图3为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈法抑菌活性。
图4为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈法抑菌活性。
图5为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌落形态特征。
图6为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02革兰氏染色后显微镜下的菌体形态。
图7为采用16S rRNA进行PCR扩增的电泳图谱。
图8为采用23S rRNA进行PCR扩增的电泳图谱。
图9为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02系统进化树分析图。
图10为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的发酵上清液对多重耐药APP抑菌活性。
具体实施方式
为了详细说明本发明的具体内容，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。需要注意的是：在下述各实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和培养基如无特别说明，均为常规市售；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。试验所用的多重耐药APP为中国兽药杂志，2022，56（2）：70-77，《中草药提取物对多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌试验及抑菌效果研究》中所用多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌。
实施例1：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的分离和筛选
（1）巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的分离和纯化
将芦巴子种子（购自河南禹州中药材市场种子专卖店，种子呈扁平状）进行表面消毒和在显微镜下内外胚层的分离，然后接种至PDA和LB两种培养基上，30℃培养3-7 d，挑取不同形态的菌落在TSA培养基上纯化，然后通过菌落显微镜下形态特征，剔除相同的菌株。纯化后的菌株用10%的脱脂奶粉，-80 ℃保存。
（2）抑菌内生菌的筛选
挑取-80℃保存的内生菌接种至TSA（10%胎牛血清+10%NAD）培养平板中，用划线法进行抑菌活性强弱的检测。分别在两个TSA（10%胎牛血清+10% NAD）培养平板的中央各划一道线，接种内生菌；然后在两个培养平板划线内生菌的两侧分别划线接种APP和多重耐药APP（多重耐药APP的菌株信息见表1），放入30 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌对APP和多重耐药APP的抑菌情况，分别见图1和图2。
由图1和图2可以看出，提取的内生菌对APP和多重耐药APP均具有一定的抑菌效果。
为了进一步获取抑菌强弱的大小，用抑菌圈法测量抑菌圈的大小。挑取-80 ℃保存的内生菌分别接种至TSA（10%胎牛血清+10%NAD）平板的中央，然后分别将1×109APP菌液和1×109多重耐药APP菌液涂布在内生菌的周围，放入37 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌对APP的抑菌情况，并测量抑菌圈的大小。若内生菌周围有透明的抑菌圈，说明此株内生菌对APP有抑制效果。抑菌效果强弱以抑菌圈大小表示，抑菌圈直径＞20 mm表示抑菌效果较强；抑菌圈＜20 mm且＞10 mm表示抑菌效果中等；抑菌圈＜10 mm表示抑菌效果较弱；具体见图3和图4，其中图3中抑菌圈的大小为45 mm，图4中抑菌圈的大小为44 mm。
由图3和图4可以看出，获取的内生菌对APP和多重耐药APP的抑菌圈直径均＞20mm，说明获取的内生菌对APP和多重耐药APP均具有较强的抑菌效果。
（3）内生菌形态观察
将内生菌接种于TSA培养平板，放入30 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌的菌落形态，见图5。
挑取内生菌单菌落涂布于载玻片上，用革兰氏染液染色，然后在油镜下观察内生菌的菌体形态，见图6。
由图5可以看出，菌株2203LBZ02在固体培养基上形成圆形乳白色菌落，菌落表面光滑湿润，革兰氏染色阳性。
由图6可以看出，内生菌的菌体呈粗杆状，菌端钝圆或平截，为革兰氏阳性大杆菌，1.0~1.2 µm×3~5 µm，芽孢椭圆形，位于菌体中央。菌体单在或是2~5个相连的短链，相连的菌端平截而成竹节状。结合菌落和菌体的形态学观察结果初步判定该内生菌为巨大普里斯特氏菌。
（4）内生菌分子鉴定
采用16S rRNA和23 S rRNA进行PCR扩增和测序鉴定，所用引物见表2。
以内生菌的DNA为模板，50 µL扩增体系进行扩增。扩增产物首先用1%琼脂糖凝胶进行电泳，确定条带大小位置，结果见图7和图8。
然后把PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，序列见SEQ ID NO.1。
CCATTCTGTCCACTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTA（SEQ ID NO.1）
将测序结果在NCBI数据库中进行分析比对，用MEGA 5.0软件中的临接法（Neighbor Joining）构建系统发育树，见图9。将测序序列与巨大普里斯特氏菌序列进行同源性分析，见表3。
从表3可以看出，与2203LBZ02同源性较高的菌株有19个，同源性达99%以上，其中与MG937742.1和MK318790.1的同源性达100%。根据测序结果，确定2203LBZ02菌株为巨大普里斯特氏菌。
（5）内生菌发酵液活性检测
为了进一步检测内生菌发酵液的抑菌效果，对内生菌菌株进行发酵培养，检测发酵液活性。挑取-80℃保存的内生菌接种至NB培养基中，放入30℃培养箱培养24 h，12 000rpm/min离心10 min，取上清液用0.22µm的无菌滤膜过滤除菌。然后用牛津杯法测量抑菌情况，每孔加入100µL内生菌发酵液，4个重复，测量抑菌圈大小，取其平均值，结果见图10，图10中抑菌圈的大小为27mm。
实施例2：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂的制备
（1）菌株培养与制备
将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白胨大豆琼脂平板上，在28-32℃下培养24-48小时；
（2）种子液的制备
将步骤（1）培养的菌种接入胰蛋白胨大豆液体培养基内，在28-32℃下培养12-24h，得种子液；
（3）液体发酵生产
取将种子液按3-5%的接种量接种于发酵培养基中，在28-32℃、转速200-240rpm、pH 7.0-7.5条件下发酵培养24-48小时后，收集发酵液，即得微生物菌剂。菌剂的活菌浓度为9-12×109cfu/mL。
实施例3：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂（实施例2培养的菌液）在猪接触传染性胸膜肺炎防治上的实验验证
本实验验证于2022年3月在河南省农业科学院试验动物房进行。以氟甲砜霉素和空白作为对照。
具体操作步骤如下：
（1）选取体重大小一致60 kg左右的育肥猪60只，分为5组，每组12只，分别不同菌剂实验组、甲砜霉素对照组和空白作为对照组。预饲养3天。
（2）挑取-80 ℃保存的猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌接种至胰蛋白大豆肉汤（添加10%胎牛血清+10%NAD）液体培养基上，制成1×109菌液，用于攻毒试验。每头猪注射0.5 mL。
（3）接种后，每天观察发病情况，待出现临床症状后，用巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂和氟甲砜霉素进行治疗，观察和统计治疗效果。治疗实验结果如表4所示：
由表4可以看出，5×菌剂实验组和10×菌剂实验组对猪接触传染性胸膜肺炎均具有100%的防治效果。
实施例4：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂（实施例2培养的菌液）在猪接触传染性胸膜肺炎防治上的实验验证
试验验证于2022年6月在河南省原阳县一猪场进行。该猪场育肥场有75 kg左右猪只体温升高，咳嗽，精神沉郁、食欲减退、喜卧地、不愿走动；并出现消瘦，生长缓慢，病死猪只口鼻流血的情况。经临床症状观察、剖检变化和实验室诊断，确诊为猪接触传染性胸膜肺炎。
用5×菌剂对患病猪只进行伴料治疗性试验，治疗过程中，发病猪只临床症状逐步减轻，体温逐渐恢复至正常温度，饮食欲增强，咳嗽和喘气症状减轻并恢复至正常；所有发病猪只治疗3天后，全部治愈。
综上实验结果，证明本发明获取的巨大普里斯特氏菌2203LBZ02制备的生物菌剂对猪接触传染性胸膜肺炎具有很好的防治效果，可以有效解决猪接触传染性胸膜肺炎的防治难题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株巨大普里斯特氏菌，其特征在于：所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCC No.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌，其特征在于：所述巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02是从中药种子芦巴子中筛选得到。
3.一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂，其特征在于：包括所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02和/或所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的代谢产物。
4.一种如权利要求3所述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白大豆琼脂固体培养基上，在28-32℃下培养24-48小时；
步骤二、取步骤一培养的菌种接入胰蛋白大豆液体培养基内，在28-32 ℃下培养12-24h，得种子液；
步骤三、将种子液按照3-5%的接种量接种于发酵培养基中，在28-32℃、转速200-240rpm、pH 7.0-7.5条件下发酵培养24-72小时，收集发酵液，即得微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，其特征在于：该巨大普里斯特氏菌生物菌剂的活菌浓度为9-12×109cfu/mL。
6.一株巨大普里斯特氏菌或依据其制备的生物菌剂在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其在防治普通猪胸膜肺炎放线杆菌及多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211552820.2A CN115927102A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211552820.2A CN115927102A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115927102A true CN115927102A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=86653785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211552820.2A Pending CN115927102A (zh) | 2022-12-06 | 2022-12-06 | 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115927102A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116445374A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-07-18 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株巨兽普里斯特氏菌及其应用 |
| CN116622576A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-08-22 | 中国水稻研究所 | 一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用 |
| CN116987615A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-11-03 | 吉林农业大学 | 一株阿氏普里斯特氏菌yz-151及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101024078A (zh) * | 2007-03-23 | 2007-08-29 | 吉林大学 | 短小棒状杆菌制备猪传染性胸膜肺炎生物制剂的用途 |
-
2022
- 2022-12-06 CN CN202211552820.2A patent/CN115927102A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101024078A (zh) * | 2007-03-23 | 2007-08-29 | 吉林大学 | 短小棒状杆菌制备猪传染性胸膜肺炎生物制剂的用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HAU-HSUAN HWANG等: "A Plant Endophytic Bacterium Priestia megaterium StrainBP-R2 Isolated from the Halophyte Bolboschoenus planiculmis Enhances Plant Growth under Salt and Drought Stresses", 《MICROORGANISMS》, vol. 10, 17 October 2022 (2022-10-17), pages 6 - 7 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116987615A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-11-03 | 吉林农业大学 | 一株阿氏普里斯特氏菌yz-151及其应用 |
| CN116987615B (zh) * | 2023-04-19 | 2024-05-28 | 吉林农业大学 | 一株阿氏普里斯特氏菌yz-151及其应用 |
| CN116622576A (zh) * | 2023-05-26 | 2023-08-22 | 中国水稻研究所 | 一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用 |
| CN116622576B (zh) * | 2023-05-26 | 2024-03-26 | 中国水稻研究所 | 一株马斯利亚农业菌、复合菌剂及其应用 |
| CN116445374A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-07-18 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株巨兽普里斯特氏菌及其应用 |
| CN116445374B (zh) * | 2023-06-14 | 2023-11-10 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株巨兽普里斯特氏菌及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115927102A (zh) | 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用 | |
| CN113170842B (zh) | 一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用 | |
| CN110734879A (zh) | 罗伊氏乳杆菌lr-co21及其应用 | |
| CN114350578B (zh) | 一株产溶菌酶并高效拮抗多药耐药幽门螺杆菌的植物乳杆菌lp1z及其应用 | |
| CN113249255B (zh) | 一种防控禽肠炎的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN113846039B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN110004096A (zh) | 一株植物乳杆菌及其应用 | |
| CN113621533A (zh) | 一株砖红链霉菌z1-26、微生态制剂及其制备方法 | |
| CN114836349B (zh) | 拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la16及其应用 | |
| CN113652373A (zh) | 一株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108949619A (zh) | 一种鸭疫里默氏杆菌的发酵工艺 | |
| CN113616715B (zh) | 治疗仔猪腹泻及改善其肠道菌群的发酵中药口服液 | |
| CN105779346B (zh) | 一种产细菌素的屎肠球菌及其应用 | |
| CN116064324B (zh) | 一株鼠李糖乳杆菌及其培养方法和在防治腹泻和肠炎方面的应用 | |
| CN116536195A (zh) | 克劳氏盐碱芽孢杆菌及其在制备有机微生物菌肥中的应用 | |
| CN107254424B (zh) | 一种畜禽用新型液态复合微生态制剂及其制备方法 | |
| CN115851496B (zh) | 一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用 | |
| CN115895941B (zh) | 一株鼠李糖乳杆菌及其应用 | |
| CN116731912B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌scuec9菌株及其应用 | |
| CN115154489B (zh) | 一种治疗羊干酪性淋巴结炎的多菌群复合制剂及培养物 | |
| CN114836338B (zh) | 一株鼠李糖乳杆菌a5及其应用 | |
| CN116200313B (zh) | 一株唾液乳杆菌及其应用 | |
| CN115386523B (zh) | 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用 | |
| CN116731939B (zh) | 一种植物乳杆菌及其应用 | |
| CN113444694B (zh) | 马链球菌马亚种噬菌体sp2019-lx株及其在制备腺疫治疗性药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |