CN115927102A

CN115927102A - 一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115927102A
Application number: CN202211552820.2A
Authority: CN
Inventors: 李海利; 郎利敏; 方剑玉; 朱文豪; 张青娴; 游一; 张立宪; 王治方; 徐引弟; 王克领
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明属于微生物及生物制品技术领域，具体涉及一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。该巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCC No.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；依据该巨大普里斯特氏菌制备的生物菌剂不仅对APP具有极强的抑菌效果，也对多重耐药APP也具有极强的抑菌效果，且其制备方法简单，使用方便，无抗生素残留，高效安全。

Description

一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物及生物制品技术领域，具体涉及一株巨大普里斯特氏菌、菌剂、制备方法及其在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。

背景技术

猪接触传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，急性者病死率高，给规模化养猪场造成了巨大的经济损失。猪场发生胸膜肺炎后，可采取多种措施防治传染性胸膜肺炎，如抗生素疗法，灭活苗免疫接种，亚单位苗免疫接种等。但是如果长期用抗生素治疗，会加重放线杆菌耐药，出现多重耐药菌株和超级耐药菌株，如不及时进行有效防治，将会严重影响猪群的生长速度和造成更高的死亡率。

为了减少胸膜肺炎放线杆菌对猪群造成的影响，坚持自繁自养和引进无该病原的种猪是最简便、经济、有效的防治途径，加强种猪检疫，做好种猪带菌检测工作，从无病区引种，且在引种时杜绝带菌种猪混入合格种猪中。但受到种猪资源贵、检测方法有限等因素限制；最常用的、最快速、最直接的防治途径是抗生素防治，抗生素防治在一定程度上减少了胸膜肺炎病发生，但同时由过度、过频使用抗生素杀菌剂所带来的兽药残留、食品安全、耐药菌株、环境污染、生态平衡破坏和病原产生抗药性等问题，在很大程度上也限制着抗生素的使用。

基于上述情况，随着健康养殖的发展，人们对无污染、无公害绿色畜产品呼声日益提高，生物防治已经逐渐成为动物细菌性病害防治的研究热点，它在生产方式、兽药残留、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。

目前，生防菌作为生物防治的重要一环，也是动物细菌性病害生物防治研究的热点。因生防菌种类繁多，真菌、细菌、放线菌等类别生防菌均在生产上得到广泛的应用。但是药用植物内生微生物作为生防菌还未见报道。因此亟待开发新的药用植物内生微生物生防菌株，以期在动物细菌性病害、人和自然和谐共存、维护生态平衡和促进农业可持续发展进程中发挥重要的作用。

发明内容

针对目前生物菌防治在多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌防治效果不佳和防控困难的缺陷和问题，本发明提供一株巨大普里斯特氏菌2203LBZ02、菌剂及其在多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌上进行应用。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一株巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（ Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCCNo.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述的巨大普里斯特氏菌，所述巨大普里斯特氏菌（ Priestia megaterium）2203LBZ02是从中药种子芦巴子中筛选得到。

本发明还提供一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂，包括所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02和/或所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的代谢产物。

本发明还提供一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白大豆琼脂固体培养基上，在28-32 ℃下培养24-48小时；

步骤二、取步骤一培养的菌种接入胰蛋白大豆液体培养基内，在28-32 ℃下培养12-24 h，得种子液；

步骤三、将种子液按照3-5%的接种量接种于发酵培养基中，在28-32℃、转速200-240rpm、pH 7.0-7.5条件下发酵培养24-72小时，收集发酵液，即得微生物菌剂。

上述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，该巨大普里斯特氏菌生物菌剂的活菌浓度为9-12×10⁹cfu/mL。

本发明还提供了一株巨大普里斯特氏菌或依据其制备的生物菌剂在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。

上述的应用，是其在防治普通猪胸膜肺炎放线杆菌及多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。

本发明的有益效果：

本发明从芦巴子种子中分离筛选出的巨大普里斯特氏菌2203LBZ02及依据该巨大普里斯特氏菌制备的生物菌剂不仅对APP具有极强的抑菌效果，也对多重耐药APP也具有极强的抑菌效果。

本发明的生物菌剂制备方法简单，按照口服、伴料或饮水中的任一种方式使用对猪接触传染性胸膜肺炎均能达到很好的治疗效果，使用方便，无抗生素残留，高效安全。

附图说明

图1为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性。

图2为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性。

图3为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈法抑菌活性。

图4为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈法抑菌活性。

图5为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌落形态特征。

图6为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02革兰氏染色后显微镜下的菌体形态。

图7为采用16S rRNA进行PCR扩增的电泳图谱。

图8为采用23S rRNA进行PCR扩增的电泳图谱。

图9为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02系统进化树分析图。

图10为巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的发酵上清液对多重耐药APP抑菌活性。

具体实施方式

为了详细说明本发明的具体内容，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。需要注意的是：在下述各实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和培养基如无特别说明，均为常规市售；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。试验所用的多重耐药APP为中国兽药杂志，2022，56（2）：70-77，《中草药提取物对多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌试验及抑菌效果研究》中所用多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌。

实施例1：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的分离和筛选

（1）巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的分离和纯化

将芦巴子种子（购自河南禹州中药材市场种子专卖店，种子呈扁平状）进行表面消毒和在显微镜下内外胚层的分离，然后接种至PDA和LB两种培养基上，30℃培养3-7 d，挑取不同形态的菌落在TSA培养基上纯化，然后通过菌落显微镜下形态特征，剔除相同的菌株。纯化后的菌株用10%的脱脂奶粉，-80 ℃保存。

（2）抑菌内生菌的筛选

挑取-80℃保存的内生菌接种至TSA（10%胎牛血清+10%NAD）培养平板中，用划线法进行抑菌活性强弱的检测。分别在两个TSA（10%胎牛血清+10% NAD）培养平板的中央各划一道线，接种内生菌；然后在两个培养平板划线内生菌的两侧分别划线接种APP和多重耐药APP（多重耐药APP的菌株信息见表1），放入30 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌对APP和多重耐药APP的抑菌情况，分别见图1和图2。

由图1和图2可以看出，提取的内生菌对APP和多重耐药APP均具有一定的抑菌效果。

为了进一步获取抑菌强弱的大小，用抑菌圈法测量抑菌圈的大小。挑取-80 ℃保存的内生菌分别接种至TSA（10%胎牛血清+10%NAD）平板的中央，然后分别将1×10⁹APP菌液和1×10⁹多重耐药APP菌液涂布在内生菌的周围，放入37 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌对APP的抑菌情况，并测量抑菌圈的大小。若内生菌周围有透明的抑菌圈，说明此株内生菌对APP有抑制效果。抑菌效果强弱以抑菌圈大小表示，抑菌圈直径＞20 mm表示抑菌效果较强；抑菌圈＜20 mm且＞10 mm表示抑菌效果中等；抑菌圈＜10 mm表示抑菌效果较弱；具体见图3和图4，其中图3中抑菌圈的大小为45 mm，图4中抑菌圈的大小为44 mm。

由图3和图4可以看出，获取的内生菌对APP和多重耐药APP的抑菌圈直径均＞20mm，说明获取的内生菌对APP和多重耐药APP均具有较强的抑菌效果。

（3）内生菌形态观察

将内生菌接种于TSA培养平板，放入30 ℃培养箱培养24 h，观察内生菌的菌落形态，见图5。

挑取内生菌单菌落涂布于载玻片上，用革兰氏染液染色，然后在油镜下观察内生菌的菌体形态，见图6。

由图5可以看出，菌株2203LBZ02在固体培养基上形成圆形乳白色菌落，菌落表面光滑湿润，革兰氏染色阳性。

由图6可以看出，内生菌的菌体呈粗杆状，菌端钝圆或平截，为革兰氏阳性大杆菌，1.0~1.2 µm×3~5 µm，芽孢椭圆形，位于菌体中央。菌体单在或是2~5个相连的短链，相连的菌端平截而成竹节状。结合菌落和菌体的形态学观察结果初步判定该内生菌为巨大普里斯特氏菌。

（4）内生菌分子鉴定

采用16S rRNA和23 S rRNA进行PCR扩增和测序鉴定，所用引物见表2。

以内生菌的DNA为模板，50 µL扩增体系进行扩增。扩增产物首先用1%琼脂糖凝胶进行电泳，确定条带大小位置，结果见图7和图8。

然后把PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，序列见SEQ ID NO.1。

CCATTCTGTCCACTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTA（SEQ ID NO.1）

将测序结果在NCBI数据库中进行分析比对，用MEGA 5.0软件中的临接法（Neighbor Joining）构建系统发育树，见图9。将测序序列与巨大普里斯特氏菌序列进行同源性分析，见表3。

从表3可以看出，与2203LBZ02同源性较高的菌株有19个，同源性达99%以上，其中与MG937742.1和MK318790.1的同源性达100%。根据测序结果，确定2203LBZ02菌株为巨大普里斯特氏菌。

（5）内生菌发酵液活性检测

为了进一步检测内生菌发酵液的抑菌效果，对内生菌菌株进行发酵培养，检测发酵液活性。挑取-80℃保存的内生菌接种至NB培养基中，放入30℃培养箱培养24 h，12 000rpm/min离心10 min，取上清液用0.22µm的无菌滤膜过滤除菌。然后用牛津杯法测量抑菌情况，每孔加入100µL内生菌发酵液，4个重复，测量抑菌圈大小，取其平均值，结果见图10，图10中抑菌圈的大小为27mm。

实施例2：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂的制备

（1）菌株培养与制备

将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白胨大豆琼脂平板上，在28-32℃下培养24-48小时；

（2）种子液的制备

将步骤（1）培养的菌种接入胰蛋白胨大豆液体培养基内，在28-32℃下培养12-24h，得种子液；

（3）液体发酵生产

取将种子液按3-5%的接种量接种于发酵培养基中，在28-32℃、转速200-240rpm、pH 7.0-7.5条件下发酵培养24-48小时后，收集发酵液，即得微生物菌剂。菌剂的活菌浓度为9-12×10⁹cfu/mL。

实施例3：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂（实施例2培养的菌液）在猪接触传染性胸膜肺炎防治上的实验验证

本实验验证于2022年3月在河南省农业科学院试验动物房进行。以氟甲砜霉素和空白作为对照。

具体操作步骤如下：

（1）选取体重大小一致60 kg左右的育肥猪60只，分为5组，每组12只，分别不同菌剂实验组、甲砜霉素对照组和空白作为对照组。预饲养3天。

（2）挑取-80 ℃保存的猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌接种至胰蛋白大豆肉汤（添加10%胎牛血清+10%NAD）液体培养基上，制成1×10⁹菌液，用于攻毒试验。每头猪注射0.5 mL。

（3）接种后，每天观察发病情况，待出现临床症状后，用巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂和氟甲砜霉素进行治疗，观察和统计治疗效果。治疗实验结果如表4所示：

由表4可以看出，5×菌剂实验组和10×菌剂实验组对猪接触传染性胸膜肺炎均具有100%的防治效果。

实施例4：巨大普里斯特氏菌2203LBZ02菌剂（实施例2培养的菌液）在猪接触传染性胸膜肺炎防治上的实验验证

试验验证于2022年6月在河南省原阳县一猪场进行。该猪场育肥场有75 kg左右猪只体温升高，咳嗽，精神沉郁、食欲减退、喜卧地、不愿走动；并出现消瘦，生长缓慢，病死猪只口鼻流血的情况。经临床症状观察、剖检变化和实验室诊断，确诊为猪接触传染性胸膜肺炎。

用5×菌剂对患病猪只进行伴料治疗性试验，治疗过程中，发病猪只临床症状逐步减轻，体温逐渐恢复至正常温度，饮食欲增强，咳嗽和喘气症状减轻并恢复至正常；所有发病猪只治疗3天后，全部治愈。

综上实验结果，证明本发明获取的巨大普里斯特氏菌2203LBZ02制备的生物菌剂对猪接触传染性胸膜肺炎具有很好的防治效果，可以有效解决猪接触传染性胸膜肺炎的防治难题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株巨大普里斯特氏菌，其特征在于：所述巨大普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02，保藏编号：CGMCC No.24901，保藏日期：2022年5月18日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的巨大普里斯特氏菌，其特征在于：所述巨大普里斯特氏菌（Priestia megaterium）2203LBZ02是从中药种子芦巴子中筛选得到。

3.一种巨大普里斯特氏菌生物菌剂，其特征在于：包括所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02和/或所述巨大普里斯特氏菌2203LBZ02的代谢产物。

4.一种如权利要求3所述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、将巨大普里斯特氏菌2203LBZ02接种到胰蛋白大豆琼脂固体培养基上，在28-32℃下培养24-48小时；

步骤二、取步骤一培养的菌种接入胰蛋白大豆液体培养基内，在28-32 ℃下培养12-24h，得种子液；

5.根据权利要求4所述的巨大普里斯特氏菌生物菌剂的制备方法，其特征在于：该巨大普里斯特氏菌生物菌剂的活菌浓度为9-12×10⁹cfu/mL。

6.一株巨大普里斯特氏菌或依据其制备的生物菌剂在防治猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其在防治普通猪胸膜肺炎放线杆菌及多重耐药猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎上的应用。