CN115386523B - 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及微生物领域，具体公开了一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用。一株乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）5019菌株于2021年01月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.21607。本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物具有耐热性、稳定性的优点，可用于抗幽门螺杆菌感染。

Description

一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，更具体地说，它涉及一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用。
背景技术
幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧的细菌，是目前能够在人胃中生存的唯一微生物种类。幽门螺杆菌病包括由幽门螺杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等。研究表明，初次感染幽门螺杆菌年龄较早的人群萎缩性胃炎和胃癌的发生率比较高，幽门螺杆菌感染与胃癌死亡率的高低呈现平行关系。因此，幽门螺杆菌的防控与治疗逐渐被越来越多的人重视。
目前幽门螺杆菌感染主要是采用抗生素疗法，对初次感染的患者，大多采用标准的三联或四联疗法，四联疗法是指采用一种质子泵抑制剂和两种抗生素以及以及铋剂，通过两周的连续服药，以达到治疗的目的。但是由于幽门螺杆菌易被传染，即使治愈后，也可能会被再次感染。再次治疗时，由于幽门螺杆菌对抗菌药物的耐药性不断上升，会导致治愈率不断下降，导致了治疗的反复性。因此，近年来，越来越多的研究人员探索其他抗幽门螺杆菌感染的新方法，如益生菌治疗或者疫苗预防等。
目前也有一些利用益生菌辅助治疗幽门螺杆菌的报道。例如，通过某些益生菌可以分泌幽门螺杆菌竞争性粘附受体以及代谢抗菌物质，通过刺激粘附蛋白的表达和稳定胃粘膜来阻止幽门螺杆菌在胃粘膜的定植。这种益生菌一般只能起到辅助治疗的作用，仍然需要与三联疗法或四联疗法配合使用。此外，益生菌能发挥作用的前提是其需要保持高活性以及需要有足够的使用量，否则其对幽门螺杆菌的防控效果会明显降低。
因此，如何提供一种能有效抑制幽门螺杆菌感染的方法，成为亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用。
第一方面，本申请提供一株乳酸乳球菌，采用如下的技术方案：
一株乳酸乳球菌，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株5019，于2021 年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.21607。
在电子显微镜下观察乳酸乳球菌5019形态发现，该菌体呈椭球状，0.7-0.9μm×0.8- 1.2μm，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性。
第二方面，本申请提供一种发酵液，采用如下的技术方案：
一种发酵液，所述发酵液由乳酸乳球菌5019经发酵产生。
第三方面，本申请提供一种代谢产物，采用如下的技术方案：
一种代谢产物，所述代谢产物由乳酸乳球菌5019发酵液经酸处理后得到。
乳酸乳球菌5019代谢产物在37-120℃下具有一定的耐温性，并且乳酸乳球菌5019代谢产物在4℃及25℃条件下贮存12个月活性不受影响。
第四方面，本申请提供乳酸乳球菌5019的应用，采用如下的技术方案：
一种乳酸乳球菌5019或乳酸乳球菌5019发酵液或乳酸乳球菌5019的代谢产物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。
第五方面，本申请提供一种抗菌制剂，采用如下的技术方案：
一种抗菌制剂，包含乳酸乳球菌5019或乳酸乳球菌5019发酵液或乳酸乳球菌5019的代谢产物。
优选的，所述抗菌制剂中还包含药学上可接受的载体；制备得到的抗菌制剂可以有效预防和/或治疗幽门螺杆菌感染。
第六方面，本申请提供了一种乳酸乳球菌5019代谢产物的制备方法，采用如下的技术方案：
一种代谢产物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将乳酸乳球菌种子液接种于培养基中，静置培育，得到乳酸乳球菌5019发酵液；
S2、调节乳酸乳球菌5019发酵液的pH值至2-2.5，加热后离心，取上清液，得到乳酸乳球菌5019的代谢产物。
通过采用上述技术方案，乳酸乳球菌5019发酵液通过酸处理后，将其吸附在乳酸乳球菌表面的乳链菌素彻底释放，利用其释放的乳链菌素进行体外杀菌，可以有效清除并抑制幽门螺杆菌的增殖。
经过酸处理后得到的乳酸乳球菌5019代谢产物，其体外抑菌效果优于未经过酸处理后的发酵液。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请的乳酸乳球菌5019的代谢产物可以有效清除并抑制幽门螺杆菌的增殖，可用于抗幽门螺杆菌感染。
2.本申请的乳酸乳球菌5019的代谢产物具有耐温性，在37-120℃下不影响其抑菌效果。
3.本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物具有稳定性，在4℃及25℃条件下贮存12个月，不影响其抑菌效果。
附图说明
图1是本申请实施例一中乳酸乳球菌5019的菌落形态图；
图2是本申请实施例一中乳酸乳球菌5019的细胞形态图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
以下实例中，
MRS培养基的配方：10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g 磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml 蒸馏水，加热溶解，调节pH值为6.7，分装后，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。
GM17固体培养基的配方：葡萄糖5g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5.0g/L，聚蛋白胨5.0g/L，抗坏血酸0.5g/L，牛肉浸膏2.5g/L，β-甘油磷酸二钠19g/L，0.02g/L MgSO4·7H2O；加入蒸馏水溶解后，调节pH7.0，固体培养基需加入1.5％(重量)的琼脂粉，115℃灭菌30分钟。
NA培养基配方：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂粉15g，加入适量蒸馏水加热溶解，并搅拌均匀，加入NaOH溶液调节pH值至7.0-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，备用。
NB肉汤配方：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，加入适量蒸馏水加热溶解，并搅拌均匀，加入NaOH溶液调节pH值至7.0-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，分装5mL于试管中，加塞，121℃高压灭菌20min，备用。
幽门螺杆菌液体培养基配方：牛脑浸粉4g，牛心浸粉4g，蛋白胨5g，酪蛋白胨16g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，加入适量蒸馏水加热溶解，并搅拌均匀，加入 NaOH溶液调节pH值至7.4±0.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却至50-55℃时，加入70ml脱纤维羊血和10支HP抑菌剂；其中，HP抑菌剂，含萘啶酮酸 1mg、TMP 0.5mg、万古霉素0.3mg、两性霉素B 0.2mg。
实施例1：乳酸乳球菌的分离培养
1.乳酸乳球菌的分离、培养
采集山东某奶牛场的生牛奶，将生牛奶进行10倍比稀释，采用涂布法，取100μL的液体涂布于含体积浓度为0.01％溴甲酚紫的MRS培养基，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱，培养36h，观察菌落形态，如附图1所示。
2.乳酸乳球菌的筛选和鉴定
挑取在体积浓度为0.01％溴甲酚紫的MRS培养基上变黄的单菌落，采用平板划线，在MRS 培养基上挑取单菌落，在MRS培养基上三区划线，挑取单菌落重复进行3-5次纯化，挑取生长48h的菌落进行电镜观察及16SrDNA鉴定。
结果如图2所示，在电子显微镜下观察乳酸乳球菌5019形态发现，该菌体呈椭球状， 0.7-0.9μm×0.8-1.2μm，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性。
提取分离菌株的基因组DNA，对其进行扩增和测序，得到该菌株的16S rDNA片段，其序列为：SEQ ID NO：1。
将16SrDNA基因序列提交NCBI进行在线比对，结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定该筛选的菌株为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，将其命名为5019。
实施例2：发酵液及代谢产物的制备
一种乳酸乳球菌5019的代谢产物，采用如下方法制备：
S1、乳酸乳球菌5019(实施例1制得)划线平板为GM17固体培养基，从冻存管中划线的平板在30℃下生长48h；
S2、GM17固体培养基中挑取乳酸乳球菌5019单菌落于5mL的GM17液体培养基中，在30℃下静置生长24h；
S3、以体积比5％的接种量接种到GM17液体培养基中进行培养；于30℃下静置发酵，不通入空气，每1h-2h振荡一次；发酵至8h或者监测到pH值低于4.70时即可停止发酵，获得乳酸乳球菌5019发酵液；
S4、发酵结束后，加入浓盐酸调节pH值至2.0-2.5，加热煮沸5min；将煮沸的发酵液11000rpm离心5min，取上清，获得乳酸乳球菌5019代谢产物。
实施例3：代谢产物体外抑菌活性测定
S1、检测菌(藤黄微球菌)的培养：用无菌接种环从甘油管或冻干管中取一环检测菌(藤黄微球菌)，接种在无菌的NA平皿上，进行自然分离，挑出单菌落接在NB肉汤中，在37℃下，以220rpm振荡培养20h；涂布法测定菌液浓度，放入2-8℃冰箱中；
S2、菌液制备：将菌液浓度为1.0×108CFU/mL左右的藤黄微球菌，按照体积比1％添加到 NA培养基中，培养基中菌液终浓度为1.0×106CFU/mL左右。
S3、平板准备：NA培养基加入指示菌(本实施例步骤S2得到的藤黄微球菌)后，倒入水平放置的一次性平板中，等完全凝固后用直径7mm打孔器在平板上打出12孔，取出孔内琼脂，吹干后加入150倍及300倍稀释的未处理的发酵液(实施例2制备得到的乳酸乳球菌5019发酵液)及处理后的发酵液(实施例2制备得到的乳酸乳球菌5019代谢产物)，每孔加入50μL，每个做三个平行，37℃培养20h后统计抑菌圈直径，结果见表1。
表1乳酸乳球菌5019发酵液未处理与处理后对体外抑菌的影响
通过表1发现，处理后的发酵液的抑菌圈直径大于未处理发酵液的抑菌圈直径，说明经过酸处理后得到的乳酸乳球菌5019代谢产物，其体外抑菌效果优于未处理组。
实施例4：胃液对乳酸乳球菌5019代谢产物的影响
1)人工胃液配制方法：参照2010年《中国药典》二部附录XA中方法配制人工胃液：取浓盐酸23.4ml加水100ml配制成含体积浓度9.5％-10.5％稀盐酸；取上述稀盐酸1.64ml，加水约80ml与胃蛋白酶1g混匀，加水稀释成100ml，即得人工胃液，人工胃液的pH约为2；
2)将乳酸乳球菌5019代谢产物(实施例2制得)与人工胃液按照体积比1:1的比例进行混合，在37℃下分别孵育30min，1h，2h，6h，12h对其活力进行检测。
3)NA培养基加入指示菌(藤黄微球菌)后，倒入水平放置的一次性平板中，等完全凝固后用直径7mm打孔器在平板上打出18孔，取出孔内琼脂，吹干后加入与人工胃液不同时间处理的乳酸乳球菌5019代谢产物，作为样品组，设置未处理的乳酸乳球菌5019代谢产物作为阳性对照，将样品组以及阳性对照稀释至同样梯度(稀释300倍)，每孔加入50μL，每个做三个平行，37℃培养20h后统计抑菌圈直径，结果见表2。
表2人工胃液对乳酸乳球菌5019代谢产物的影响
通过表2发现，乳酸乳球菌5019代谢产物在30min-12h内，抑菌圈直径并未发生变化，说明人工胃液对于乳酸乳球菌5019代谢产物的活性不造成影响。
实施例5：温度对乳酸乳球菌5019代谢产物的影响
1)将液体乳酸乳球菌5019代谢产物(实施例2制得)分别置于37℃，80℃，100℃及120℃鼓风干燥箱内，处理30min，对其活力进行检测。
2)NA培养基加入指示菌(藤黄微球菌)后，倒入水平放置的一次性平板中，等完全凝固后用直径7mm打孔器在平板上打出12孔，取出孔内琼脂，吹干后加入不同温度处理的乳酸乳球菌5019代谢产物，作为样品组，设置37℃处理的乳酸乳球菌5019代谢产物作为阳性对照，将样品组以及阳性对照组稀释300倍，每孔加入50μL，每个做三个平行，37℃培养20h后统计抑菌圈直径，结果见表3。
表3乳酸乳球菌5019代谢产物对不同温度下的耐受结果
通过表3发现，乳酸乳球菌5019代谢产物在37-120℃下，其抑菌圈直径并未发生变化，说明乳酸乳球菌5019代谢产物在37-120℃下具有一定的耐温性。
实施例6：4℃和25℃对乳酸乳球菌5019代谢产物保存的影响
1)将液体乳酸乳球菌5019代谢产物(实施例2制得)置于4℃及25℃条件下贮存，15d，1 个月，3个月，6个月及12个月对其活力进行检测。
2)NA培养基加入指示菌(藤黄微球菌)后，倒入水平放置的一次性平板中，等完全凝固后用直径7mm打孔器在平板上打出6个孔，取出孔内琼脂，吹干后加入不同温度不同保存时间处理的乳酸乳球菌5019代谢产物，将不同温度不同保存时间下的样品稀释300倍，每孔加入50μL，每个做三个平行，37℃培养20h后统计抑菌圈直径，结果见表4。
表4不同贮存温度下乳酸乳球菌5019代谢产物保存效果
通过表4发现，乳酸乳球菌5019代谢产物在4℃及25℃条件下，其抑菌圈直径并未发生变化，说明乳酸乳球菌5019代谢产物在4℃及25℃条件下贮存12个月活性不受影响。
实施例7：乳酸乳球菌5019的代谢产物对幽门螺杆菌生长的抑制作用
1.制备HP菌液：将复苏的幽门螺杆菌接种至幽门螺杆菌液体培养基，在37℃，微需氧培养 (氧气体积浓度为5％，二氧化碳体积浓度为15％，氮气体积浓度为85％)条件下培养7d，得到HP菌液。
2.体外抑菌试验：
1)将液体培养的HP菌液用幽门螺杆菌液体培养基稀释至1×108CFU/ml。
2)采用盐酸调节幽门螺杆菌液体培养基至pH＝2.5，作为稀释液，用稀释液将液体乳酸乳球菌5019代谢产物(实施例2制得)进行2.5倍、5倍、10倍、20倍稀释。
3)取6根15ml无菌离心管，分别为乳酸乳球菌5019代谢产物原液组、1：2.5组、1： 5组、1：10组、1：20组和空白对照组，每根管中加入5ml稀释至1×108CFU/ml的HP菌液，随后分别加入5ml稀释至不同倍数的乳酸乳球菌5019代谢产物，原液组加入乳酸乳球菌5019代谢产物(实施例2制得)，对照组加入稀释液。随后于37℃微需氧环境作用2h。
4)作用结束后，采用10mmol/L的氢氧化钠将其反应液调整至pH＝7.0，将作用后的液体进行倍比稀释，最终每个样本平均被稀释2.25倍数。
5)稀释滴定计数(20μL点板)：取6个平板，每个平板平均分为9个区域。其中第 9区域为原液，从1-8分别对于10-1-10-8稀释度。本次实验重复3次。随后将固体平板在37℃微需氧培养7天。进行菌落计数，结果见表5。
表5不同浓度乳酸乳球菌5019代谢产物对幽门螺杆菌的杀伤效果
组别 样本1(CFU/mL) 样本2(CFU/mL) 样本3(CFU/mL) 平均值
原液组 0 0 0 0
1：2.5组 0 0 0 0
1：5组 4.50×103 3.38×103 3.75×103 3.88×103
1：10组 2.13×105 6.75×105 3.38×105 4.09×105
1：20组 2.25×106 1.01×106 2.50×106 1.92×106
空白对照组 3.38×108 5.63×108 5.25×108 4.75×108
通过表5发现，乳酸乳球菌5019代谢产物可有效杀灭幽门螺杆菌。
实施例8：乳酸乳球菌5019的代谢产物对猫体内幽门螺杆菌的抑制作用
某宠物医院收诊一只3岁雄性橘猫，对其采集肛拭子，通过巴迪泰仪器设备检测，通过截止指数(COI)发现，该橘猫检测数值为1.20，正常数值0-0.99，因此该橘猫幽门螺杆菌超标。
该橘猫服用本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物，剂量原液0.5ml/次，一天口服两次，连续5天，服用5天后，采集肛拭子，通过巴迪泰仪器设备检测，通过截止指数 (COI)发现，该橘猫检测数值为0.59，属于正常范围。
经分析，本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物对猫幽门螺杆菌有抑制作用。
实施例9：乳酸乳球菌5019的代谢产物对人体内幽门螺杆菌的抑制作用
一名39岁男性，体检检测C14尿素呼气试验，试验检测数值为540dpm，正常数值为0- 99dpm，经判定，该名男性患有幽门螺杆菌超标。
该患者服用本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物，剂量原液1ml/次，一天口服两次，连续5天，服用5天后，该名患者重新进行C14尿素呼气试验，试验检测数值为30dpm，属于正常范围。
经分析，本申请的乳酸乳球菌5019代谢产物对人体幽门螺杆菌有抑制作用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (6)

1.一株乳酸乳球菌，其特征在于，所述乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株被命名为乳酸乳球菌5019，于2021年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，保藏编号为CGMCC NO.21607。
2.一种发酵液，其特征在于：所述发酵液由权利要求1所述的乳酸乳球菌5019经发酵产生。
3.一种代谢产物，其特征在于：所述代谢产物由权利要求2所述的发酵液经酸处理后得到；
代谢产物的制备方法，步骤如下：
S1、乳酸乳球菌5019划线平板为GM17固体培养基，从冻存管中划线的平板在30℃下生长48h；
S2、GM17固体培养基中挑取乳酸乳球菌5019单菌落于5mL的GM17液体培养基中，在30℃下静置生长24h；
S3、以体积比5%的接种量接种到GM17液体培养基中进行培养；于30℃下静置发酵，不通入空气，每1h-2h振荡一次；发酵至8h或者监测到pH值低于4.70时即可停止发酵，获得乳酸乳球菌5019发酵液；
S4、发酵结束后，加入浓盐酸调节pH值至2.0-2.5，加热煮沸5min；将煮沸的发酵液11000rpm离心5min，取上清，获得乳酸乳球菌5019代谢产物。
4.一种如权利要求1所述的乳酸乳球菌5019或如权利要求2所述的发酵液或如权利要求3所述的代谢产物在制备治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。
5.一种抗菌制剂，其特征在于：包含如权利要求1所述的乳酸乳球菌5019或如权利要求2所述的发酵液或如权利要求3所述的代谢产物。
6.根据权利要求5所述的抗菌制剂，其特征在于：所述抗菌制剂中还包含药学上可接受的载体。
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