CN116590192A - 一种幽门螺杆菌固体分离培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌培养技术领域，提供了一种幽门螺杆菌固体分离培养基及其制备方法和应用。一种幽门螺杆菌固体分离培养基，包括如下组分：琼脂6～11g、可溶性淀粉0.5～1g、脑心浸粉4～8g、蛋白胨20～25g、氯化钠3～10g、乳酸0.1～0.15ml、抑菌剂1～3ml、无菌脱纤维羊血40～60mL、葡萄糖0.5～1.5g。本发明通过制备幽门螺杆菌固体分离培养基，可以提高幽门螺杆菌的培养阳性率，同时能够促进幽门螺杆菌快速增殖，避免其他杂菌感染，维持细菌的高活性。
Description
技术领域
本发明涉及细菌培养技术领域，尤其涉及一种幽门螺杆菌固体分离培养基及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Hp)是常见消化道疾病包括慢性胃炎、消化性溃疡的重要病原因子，同时也和胃癌、MALT淋巴瘤的发生密切相关。1994年世界卫生组织WHO将幽门螺杆菌列为一类致癌原，2022年美国卫生与公共服务部将幽门螺杆菌列为明确致癌物。
目前有很多方法可以用于诊断幽门螺杆菌感染和耐药检测，细菌培养是金标准。幽门螺杆菌是一种微需氧菌，体外培养条件比较苛刻，且生长缓慢，对气体环境和培养基的要求比较严格，培养基不仅要满足幽门螺杆菌培养的营养要求，还需要抑制杂菌，提高幽门螺杆菌活性。而传统的分离培养基，如哥伦比亚琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基都不能满足幽门螺杆菌的培养要求。无论是用于菌种鉴定还是细菌耐药，第一步都需要将幽门螺杆菌从胃粘膜分离培养，由于胃粘膜组织中许多杂菌的生长速度远远高于幽门螺杆菌，一旦菌落形成，会快速建立竞争优势，使幽门螺杆菌难以生长或被杂菌覆盖，导致幽门螺杆菌难以分离，阳性检出率降低。
大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌，是一种非常常见的兼性厌氧菌，是在有氧或无氧条件下都能够生长发育的一种微生物菌种，其次在普通培养基上即可生长。而幽门螺杆菌是一种菌体细长、弯曲呈螺旋形、微需氧(5％O2、10％CO2)的革兰阴性菌，在有氧或无氧环境均不生长，潮湿，37℃，微需氧环境中生长良好，由于一般技术方法难以培养成功，是公认的苛养菌。
因此，如何提高幽门螺杆菌培养阳性率，加快幽门螺杆菌生长速度，仍然是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于幽门螺杆菌的固体分离培养基及其制备方法和应用，提高幽门螺杆菌培养阳性率，同时能够促进幽门螺杆菌快速增殖，避免其他杂菌感染，维持细菌的高活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种幽门螺杆菌固体分离培养基，每升水中包括如下组分：琼脂6～11g、可溶性淀粉0.5～1g、脑心浸粉4～8g、蛋白胨20～25g、氯化钠3～10g、乳酸0.1～0.15ml、抑菌剂1～3ml、无菌脱纤维羊血40～60mL、葡萄糖0.5～1.5g。
优选地，所述抑菌剂是将万古霉素、两性霉素B、甲氧氨苄嘧啶和头孢他啶溶于无菌水，过滤除菌后制备得到。
优选地，所述幽门螺杆菌固体分离培养基中含有万古霉素4～6mg、两性霉素B 2～3mg、甲氧氨苄嘧啶2～4mg、头孢他啶2～4mg。
优选地，所述培养基的pH值为7.0～7.4。
本发明提供了一种幽门螺杆菌固体分离培养基的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照配方量将琼脂、可溶性淀粉、脑心浸粉、蛋白胨、氯化钠、乳酸、葡萄糖溶入蒸馏水中，灭菌处理备用；
(2)将步骤(1)制备得到的溶液冷却后加入无菌脱纤维羊血和抑菌剂，倒入无菌培养皿中，制备得到幽门螺杆菌固体分离培养基。
优选地，步骤(1)中所述灭菌处理的温度为111～131℃；所述灭菌处理的时间为10～20min。
优选地，步骤(2)中所述溶液冷却至50～55℃。
本发明还提供了一种幽门螺杆菌固体分离培养基在精准筛选幽门螺杆菌中的应用。
本发明提供了一种幽门螺杆菌固体分离培养基制备方法。本发明提供的培养基中，含有脑心浸粉、蛋白胨、葡萄糖等多种生长促进因子，满足幽门螺杆菌生长高营养的需求。脑心浸粉作为培养基中的基础营养物质，提供细菌生长所需碳源，基于其丰富的营养成分；葡萄糖作为可发酵的碳源；可溶性淀粉可吸附样本中有毒物质及Hp生长的代谢物。脱纤维羊血能够为幽门螺杆菌提供有利于细胞生长增殖所需的激素，从而促进幽门螺杆菌的快速生长。加入乳酸和幽门螺杆菌抑菌剂合适的组合和比例，能够减少革兰氏阳性球菌、酵母菌、霉菌等杂菌的污染。本发明的分离培养基借助微需氧工作平台进行幽门螺杆菌的培养，可以提高培养阳性率，维持幽门螺杆菌的高活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例2中制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基的标准菌株培养；
图2为实施例2中制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基的临床标本幽门螺杆菌的培养；
图3为实施例3中制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基的临床标本幽门螺杆菌的培养；
图4为实验例1中幽门螺杆菌固体分离培养基在48h时培养幽门螺杆菌的实际培养情况；
图5为实验例2中哥伦比亚血平板培养幽门螺杆菌72h时幽门螺杆菌的生长状况；
图6为实验例2中成品培养基培养幽门螺杆菌72h时幽门螺杆菌的生长状况；
图7为实验例2中幽门螺杆菌固体分离培养基培养幽门螺杆菌24h时幽门螺杆菌的生长状况；
图8为实验例2中幽门螺杆菌固体分离培养基培养幽门螺杆菌48h时幽门螺杆菌的生长状况；
图9为实验例2中幽门螺杆菌固体分离培养基培养幽门螺杆菌72h时幽门螺杆菌的生长状况；
图10为实验例2中幽门螺杆菌固体分离培养基培养组织标本72h的培养结果；
图11为实验例2中哥伦比亚血平板培养组织标本72h的典型培养结果；
图12为实验例2中成品培养基培养组织标本72h的典型培养结果；
图13为实验例3中幽门螺杆菌固体分离培养基对幽门螺杆菌生长状况的影响；
图14为实验例3中幽门螺杆菌固体分离培养基缺乏万古霉素后对幽门螺杆菌生长状况的影响；
图15为实验例4中幽门螺杆菌固体分离培养基培养C14阳性患者组织的幽门螺杆菌的阳性率；
图16为实验例4中哥伦比亚血平板培养C14阳性患者组织的幽门螺杆菌的阳性率；
图17为实验例4中在72h时幽门螺杆菌固体分离培养基培养C14阳性患者组织的幽门螺杆菌的阳性率；
图18为实验例4中在72h时改良哥伦比亚血平板培养C14阳性患者组织的幽门螺杆菌的阳性率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种幽门螺杆菌固体分离培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g的琼脂、1g的可溶性淀粉、6g的脑心浸粉、21g的蛋白胨、5g的氯化钠、0.1mL的乳酸及1g葡萄糖溶入1000mL蒸馏水中，121℃灭菌处理15分钟备用；
(2)将5.5mg的万古霉素、3mg的两性霉素B、3mg的甲氧氨苄嘧啶、2.5mg的头孢他啶溶解于2mL无菌水中，0.2μm滤膜过滤除菌，制得抑菌剂，备用；
(3)将步骤(1)得到的溶液冷却至50℃后加入50mL无菌脱纤维羊血和2mL的抑菌剂，倒入无菌培养皿中，制备得到幽门螺杆菌固体分离培养基。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于，未加入脑心浸粉、葡萄糖、乳酸和抑制剂，其余制备方法相同。利用该实施例培养的培养基培养可以用于培养标准菌株(图1)，但是用于培养临床样本的幽门螺杆菌在分离时因为临床标本筛选杂菌太多，分离难度较高(图2)。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于，未加入脑心浸粉、乳酸；加入的抑制剂由3.5mg的万古霉素、2mg的两性霉素B、3mg的多粘菌素组成，其余制备方法相同。经试验，该配方的培养基不能够很好的抑制住杂菌的生长，导致分离纯化幽门螺杆菌菌落难度较高。如图3所示，可看到培养基中还会有一些球菌和少部分杆菌存在，虽然能看到针尖装菌落，但是分离纯化幽门螺杆菌菌落难度较高。
实验例1
以实施例1为优化培养基，特点为：营养物质更丰富，乳酸和抑菌剂等组分最终配比更适合幽门螺杆菌快速生长。
实验过程：按照实施例1的配方及方法配置分离培养基，共计30份，接种胃黏膜样本(胃镜下取的粘膜放入Hp保存液中，将粘膜及保存液同时转移到Hp实施例1培养基上，均匀涂布)，在37℃微需氧条件下培养5天。
用实施例1的优化培养基培养幽门螺杆菌，如图4所示，培养皿中可以看到清晰可见的针尖半透明状的幽门螺杆菌典型菌落，且经过质谱和16sRNA鉴定为幽门螺杆菌，质谱鉴定幽门螺杆菌的准确率高达99.9％。
实验例2
将本发明实施例1制备的幽门螺杆菌固体分离培养基与现有的哥伦比亚血平板、成品培养基进行比较。测定幽门螺杆菌固体分离培养基、哥伦比亚血平板、成品培养基在24h、48h、72h三个时间点培养幽门螺杆菌时幽门螺杆菌的生长状况。
其中，成品培养基购自海博生物有限公司，成品培养基包括幽门螺杆菌固体培养基(HB8646)和幽门螺杆菌添加剂(HB8646a)；幽门螺杆菌固体培养基(HB8646)由牛脑浸粉4.0g/L、牛心浸粉4.0g/L、蛋白胨5.0g/L、酪蛋白胨16.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、琼脂13.5g/L组成，pH为7.4；幽门螺杆菌添加剂(HB8646a)规格为1mL/支，每93mL幽门螺杆菌固体培养基(HB8646)加入一支幽门螺杆菌添加剂(HB8646a)制备得到成品培养基。
成品培养基的制备：称取幽门螺杆菌固体培养基(HB8646)5.2g，加热搅拌溶解于93ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷至55℃时，加入7ml脱纤维羊血和1支幽门螺杆菌抑菌剂，混匀，倾入无菌平皿，得到成品培养基。
选取30例胃炎患者临床黏膜组织标本同时接种哥伦比亚血平板、成品培养基以及实施例1得到的幽门螺杆菌固体分离培养基，在37℃下培养，结果如表1所示，可得知，在30例临床黏膜组织标本中，哥伦比亚血平板和成品培养基在培养时间达到72h时分别有3例和11例阳性，如图5～6平板所示，哥伦比亚血平板和成品培养基中均具有杂菌，可见，哥伦比亚血平板和成品培养基加大了分离纯化、药敏试验的难度。而实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基中从48h开始具有23例幽门螺杆菌培养阳性，其中4例在24h即可看到明显的菌落(图7)，大部分在48h铺满平板的70％(图8)，另外仅有3例患者平板内稍有杂菌生长(图9)。
表1三种培养基在不同时间点幽门螺杆菌生长状况的比较
由表1还可知，三种培养基在培养临床黏膜组织标本达到72h时幽门螺杆菌的分离率。幽门螺杆菌在实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基中培养72h后阳性率达到76.6％，其余7例均为幽门螺杆菌阴性(C14检测为阴性)，因此，本发明提供的固体分离培养基对幽门螺杆菌的检出率为100％；幽门螺杆菌在哥伦比亚血平板中培养72h后阳性率为10％，根据上述分析，检出率为10.13％，即使有幽门螺杆菌生长，也可能被覆盖，分离单菌落相当困难；成品培养基中有11例患者幽门螺杆菌阳性，培养阳性率为36.6％，检出率为47.83％。而通过图10～12可得，幽门螺杆菌在实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基中生长迅速，呈透明针尖样菌落且菌落单一(图10)；哥伦比亚血平板中可以看到较多杂菌(图11)；成品培养基中未看到明显的幽门螺旋杆菌菌落(图12)。
实验例3
在实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基的基础上省略万古霉素的添加后，对幽门螺杆菌进行培养，观察减少万古霉素后的培养基对幽门螺杆菌生长状况的影响。
取一人份的实验例2中的胃炎患者临床黏膜组织标本平分后同时接种至实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基以及缺乏万古霉素的培养基，在37℃下培养48h。结果如图13～14所示，图13表示为实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基接种幽门螺杆菌后培养基中菌落单一，图14表示为缺乏万古霉素的培养基接种幽门螺杆菌后平板中看到数个杂菌，影响了幽门螺杆菌菌落纯度。证明实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基中抑菌剂成分和比例较适合当地幽门螺杆菌的生长。
实验例4
选取表1中幽门螺杆菌固体分离培养基72h的23例胃炎患者的临床黏膜组织标本接种至实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基，在37℃下培养48h。将实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基用于培养的临床黏膜组织标本获得的幽门螺杆菌与患者C14结果进行比较，结果如表2所示，在23例胃炎患者中，幽门螺杆菌固体分离培养基培养出幽门螺杆菌的阳性率为100％；23例胃炎患者中，C14阳性为22例，C14阴性为1例，23例患者中C14阳性率为95％。
表2培养结果与C14结果比较
| 幽门螺杆菌固体分离培养基 | C14 | |
| 阳性率 | 23/23(100％) | 22/23(95％) |
选择上述1例幽门螺杆菌固体分离培养基培养阳性但C14为阴性的胃炎患者的临床黏膜组织标本分别接种至实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基与哥伦比亚血平板中，在37℃下培养48h，结果如图15～16所示，图15表示为在实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基中能够发现较多幽门螺杆菌单一菌落，图16表示为在哥伦比亚血平板培养中未发现幽门螺杆菌菌落，且杂菌布满整个平板。
选择上述3例对C14阳性的胃炎患者的粘膜进行培养，分别接种于含有实施例1制得的抑菌剂的哥伦比亚血平板(称为改良哥伦比亚血平板)与幽门螺杆菌固体分离培养基中，在37℃、5％O2条件下进行培养，每过24h记录一下菌落生长情况，结果如图17～18所示，图17表示为发现在72h时幽门螺杆菌固体分离培养基中长满Hp单菌落，图18表示为在72h时改良哥伦比亚血平板只长了很少的菌落，不满足后续细菌鉴定和细菌药敏试验的要求。
可见利用实施例1制备得到的幽门螺杆菌固体分离培养基经分离纯化后得到纯的幽门螺杆菌菌落，提高了幽门螺杆菌培养阳性率。为临床精准治疗奠定良好的基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种幽门螺杆菌固体分离培养基，其特征在于，每升水中包括如下组分：琼脂6～11g、可溶性淀粉0.5～1g、脑心浸粉4～8g、蛋白胨20～25g、氯化钠3～10g、乳酸0.1～0.15ml、抑菌剂1～3ml、无菌脱纤维羊血40～60mL、葡萄糖0.5～1.5g。
2.如权利要求1所述的幽门螺杆菌固体分离培养基，其特征在于，所述抑菌剂是将万古霉素、两性霉素B、甲氧氨苄嘧啶和头孢他啶溶于无菌水，过滤除菌后制备得到。
3.如权利要求2所述的幽门螺杆菌固体分离培养基，其特征在于，每升所述幽门螺杆菌固体分离培养基中含有万古霉素4～6mg、两性霉素B2～3mg、甲氧氨苄嘧啶2～4mg、头孢他啶2～4mg。
4.如权利要求3所述的幽门螺杆菌固体分离培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为7.0～7.4。
5.一种权利要求1～4任一项所述幽门螺杆菌固体分离培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将琼脂、可溶性淀粉、脑心浸粉、蛋白胨、氯化钠、乳酸、葡萄糖溶入蒸馏水中，灭菌处理备用；
(2)将步骤(1)制备得到的溶液冷却后加入无菌脱纤维羊血和抑菌剂，倒入无菌培养皿中，制备得到幽门螺杆菌固体分离培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述灭菌处理的温度为111～131℃；所述灭菌处理的时间为10～20min。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶液冷却至50～55℃。
8.一种幽门螺杆菌固体分离培养基在精准筛选幽门螺杆菌中的应用。
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