CN110904006B

CN110904006B - 鸡源乳酸肠球菌ar及其筛选方法、应用

Info

Publication number: CN110904006B
Application number: CN201911254918.8A
Authority: CN
Inventors: 杨锴; 陈淑芳; 牛志勇; 石虎
Original assignee: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN110904006A

Abstract

本发明公开了一种鸡源乳酸肠球菌AR，属于兽用益生菌领域，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年09月10日，保藏编号为CGMCC No.18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis，解决了使用抗生素安全性低、使用其他制剂对母鸡输卵管炎治疗效果欠佳的问题；本发明还公开了上述鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，由健康母鸡输卵管中分离筛选得到；本发明也公开了上述鸡源乳酸肠球菌AR用于改善母鸡输卵管炎的应用。本发明的鸡源乳酸肠球菌AR能够定殖于鸡输卵管内，抑制并清除病原菌；适用于改善母鸡输卵管炎。

Description

鸡源乳酸肠球菌AR及其筛选方法、应用

技术领域

本发明属于兽用益生菌领域，涉及一种禽类原籍菌，具体地说是一种鸡源乳酸肠球菌AR及其筛选方法、应用。

背景技术

世界上第一例抗生素促生长作用的报道发表于1946 年，证实了日粮中添加青霉素能够改善家禽的生产性能。其后，亚临床剂量抗生素广泛应用于改善动物生产性能和饲料转化效率，同时抗生素的长期大量使用过程中产生的危害也逐渐暴露出来；亚临床剂量抗生素能够造成细菌耐药性，且耐药基因能够由动物转移到人，严重威胁人类健康。1986年，瑞典成为第一个禁止抗生素用作动物促生长剂的国家； 2006 年，欧盟禁止所有抗生素作为动物促生长剂使用； 2016 年，我国禁止硫酸黏杆菌素作为促生长剂使用，限抗或禁抗已成为我国畜牧生产行业不可回避的话题。

同时，由于消费者对食品安全的关注度不断提升，国家对兽用抗生素的监管也愈发严格。国家限抗政策密集出台，2018年4月20号，农业农村部兽医局局长冯忠武在中国饲料发展论坛上表示，药物饲料添加剂将在2020年全部退出。与此同时，农业农村部公布关于2018-2021年开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作的通知，明确了养殖端减抗和限抗的时间表。面对国家出台的“限抗”、“禁抗”政策，开发替代抗生素部分功能的产品，具有较大的市场需求，尤其是以益生菌及其代谢产物为主的微生态制剂具有较好的开发潜力和广阔的应用前景。开发功能性益生菌及其代谢产物，从而达到替代部分抗生素功能，贯彻落实国家政策，可为畜牧业助力，为食品安全保驾护航。

目前，改善母鸡输卵管炎时多采用抗生素，也有一些使用中药制剂以及调节肠道的芽孢杆菌制剂类。其中由于抗生素类药物因长期使用，造成细菌的耐药性增强、残留，从而影响食品安全等问题，对于抗生素的使用已进行限制，而其它产品对母鸡输卵管炎的改善效果不佳。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种鸡源乳酸肠球菌AR，以期解决使用抗生素安全性低，而使用其他制剂又存在治疗效果欠佳的问题；

本发明的另一个目的，是提供上述鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法；

本发明还有一个目的，是提供上述鸡源乳酸肠球菌AR的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种鸡源乳酸肠球菌AR，其菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年09月10日，保藏编号为CGMCC No. 18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis。

作为本发明的一种限定，其16SrRNA的基因序列如下：

CGGGCGGTGTGTAACTGCCCGGTAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGCCCCCGAAGGGGAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCAAATCAAAACCATGCGGTTTCGATTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTTCTGATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCCTCTTTTTCAAATTGATCGGGTTACCTGGTAAGGATTATGAGCCATGATCAAACTCTAC。

作为本发明的另一种限定，其PheS基因序列如下：

AACAATTTCACACAGGACCTAGGCCGAAGGCAAAGCCTGAATATTCTTCTGGATCGATTCCTGACATCTTCAACACATTCGGGTGCACCATGCCAGCTCCTAAAATCTCGATCCATCCAGTGTATTTACATACGTTACAACCGGCACCACCACATTTGAAACAGCTGACATCTACTTCTACTGATGGCTCCGTAAATGGGAAATAACTTGGACGCAAACGGATTTCACGATCTTCCCCAAACATTTTTTTCATTACGACTTCTAATGTTCCTTTAAGGTCGCCCATCGTGATGTTTTTATCAACAACTAGCCCTTCAATTTGATGGAACTGATGGCTGTGGGTCGCATCATCTGTATCTCTGCGGAAAACTTTTCCTGGCGAAATCATTCGTAGAGCACCCTTAGAGAAATCATGCTTTTCCATTGTCCGCGCTTGGACTGGTGAAGTATGTGTCCGAATCAATATCTCGTCTGAAATATAGAAAGTATCTTGCATATCACGAGGCAGGATGGTCGTGACTGGGAAA。

本发明还提供了上述鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，包括依次进行的以下步骤：

步骤1）在无菌厌氧培养箱中取母鸡输卵管中的内容物；

步骤2）将内容物接种于培养基A；

步骤3）将接种后的培养基A’，置于20-40℃的厌氧培养箱或细菌培养箱中静置培养24-72h，得培养物B；

步骤4）在培养物B中选取单菌落C；

接种单菌落C至MRS琼脂培养基，置于20-40℃的细菌培养箱静置培养24-72h，得纯培养物M；

步骤5）取纯培养物M的单个菌落接种至培养基D；

将接种后的培养基D’，于20-40℃的振荡培养24-72h，即得所述的鸡源乳酸肠球菌AR。

作为本发明的一种限定，步骤2）中，培养基A为固体培养基或液体培养基。

作为本发明的进一步限定，所述固体培养基为胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基、亚硫酸铁琼脂培养基或MRS琼脂培养基；

所述液体培养基为LB液体培养基或MRS肉汤培养基。

作为本发明的另一种限定，步骤5）中，培养基D是含1.0-4.0%小牛血清的LB培养基。

作为本发明的另一种限定，步骤3）中，厌氧培养箱中的厌氧环境是体积比为10：5：85的H₂、CO₂和N₂。

本发明也提供了上述的鸡源乳酸肠球菌AR的应用，所述鸡源乳酸肠球菌AR应用于改善母鸡输卵管炎。

由于采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：本发明的鸡源乳酸肠球菌AR，为原籍菌，适应性强，定殖能力好，能够定殖于鸡输卵管内，进行产酸并刺激机体产生粘膜相关免疫因子，从而提高机体免疫力，抑制并清除母鸡生殖系统中的病原菌，可改善母鸡的细菌性输卵管炎，对母鸡的输卵管具有保健作用。

本发明的鸡源乳酸肠球菌AR适用于改善母鸡输卵管炎。

附图说明

图1是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR革兰染色形态（1000×）；

图2是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR在TSA培养基中的生长状态；

图3是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR在BHI培养基中的生长状态；

图4是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR在LB培养基中的生长状态；

图5是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR在NA培养基中的生长状态；

图6是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR在MRS培养基上的生长状态中的生长状态；

图7 是本发明实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR的16S rRNA序列的电泳图，其中，电泳条件为3μL样品+1.0%琼脂糖凝胶，Marker 条带组成：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp，750bp条带浓度为60ng/3μL，其余条带浓度均为30ng/3μL，电泳方向从上向下。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中：胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基），MRS琼脂培养基，MRS肉汤培养基，脑心浸液培养基（BHI），营养琼脂培养基（NA），亚硫酸铁琼脂培养基，购自北京奥博星生物科技有限公司；

胰蛋白胨，酵母粉购自OXOID公司；

氯化钠，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；

生化试管，革兰染色液，药敏纸片购自杭州滨和生物试剂有限公司；

小牛血清，购自Thermo公司。

实施例1 鸡源乳酸肠球菌AR

鸡源乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）AR，是从母鸡输卵管内容物中分离筛选出来的，并于2019年09月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis。

其16SrRNA序列如下：

PheS基因序列如下：

其中，鸡源乳酸肠球菌AR革兰染色形态（1000×）参见图1；鸡源乳酸肠球菌AR的16S rRNA序列的电泳图参见图7，其电泳条件为3μL样品+1.0%琼脂糖凝胶，Marker 条带组成：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp，750bp条带浓度为60ng/3μL，其余条带浓度均为30ng/3μL，电泳方向从上向下。

实施例2 鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法

本实施例为实施例1所涉及的鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，包括依次进行的以下步骤：

1）在无菌条件下取自健康产蛋期的母鸡输卵管，取出后在无菌条件下密封保存；

无菌条件下取母鸡输卵管中的内容物，置于无菌厌氧培养箱备用；

2）将上述内容物接种于A₂培养基上，A₂培养基为胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基）；

3）将接种后的A₂’培养基置于37℃的厌氧培养箱中静置培养48h，得培养物B₁；厌氧培养箱中的厌氧环境由体积比为10：5：85的H₂、CO₂和N₂组成；

4）在培养物B₂中挑取单菌落C₂接种至MRS琼脂培养基，置于37℃的细菌培养箱静置培养48h，得纯培养物M₂；

5）挑取纯培养物M₂的单个菌落接种至D₂培养基上，D₂培养基为含1%小牛血清的LB培养基；

将接种后的D₂’培养基置于37℃的摇床中振荡培养48h，即得鸡源乳酸肠球菌AR，保存。

实施例3-7 鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法

实施例3-7分别为鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，筛选方法与实施例2相同，不同之处在于筛选过程中的部分条件参数不同，具体详见表1：

表1 筛选鸡源乳酸肠球菌AR的不同条件参数一览表

实施例8 鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法

2）将上述内容物接种于A₈培养基上，A₈培养基为胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基）；

3）将接种后的A₈’培养基置于37℃的细菌培养箱中静置培养48h，得培养物B₈；

4）在培养物B₈中挑取单菌落C₈接种至MRS琼脂培养基，置于37℃的细菌培养箱静置培养48h，得纯培养物M₈；

5）挑取纯培养物M₈的单个菌落接种至至D₈培养基上，D₈培养基为含1%小牛血清的LB培养基；

将接种后的D₈’培养基置于37℃的摇床中振荡培养48h，即得鸡源乳酸肠球菌AR，保存。

实施例9-14 鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法

实施例9-14分别为鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，筛选方法与实施例8相同，不同之处在于筛选过程中的部分条件参数不同，具体详见表2：

表2 筛选鸡源乳酸肠球菌AR的不同条件参数一览表

实施例15 鸡源乳酸肠球菌AR的细菌学特征

1、基本特征

本实施例为鸡源乳酸肠球菌AR的细菌学基本特征，其基本特征如下表所示：

表3 鸡源乳酸肠球菌AR的基本特征

2、生化特征

本发明的鸡源乳酸肠球菌AR是一种兼性厌氧菌，耐酸性较强，生长率高，产酸速率快，在10-45℃正常生长，在培养基和鸡体内均显示出了较好的产酸能力，在pH3.0的条件下快速生长。

将实施例1中鸡源乳酸肠球菌AR划线接种至MRS培养基，TSA培养基，BHI培养基，NA培养基，LB培养基培养基，将接种后的上述培养基分别置于37℃细菌培养箱中培养48h，观察生长状态，参见图2-6，图2是鸡源乳酸肠球菌AR在TSA培养基中的生长状态；图3是鸡源乳酸肠球菌AR在BHI培养基中的生长状态；图4是鸡源乳酸肠球菌AR在LB培养基中的生长状态；图5是鸡源乳酸肠球菌AR在NA培养基中的生长状态；图6是鸡源乳酸肠球菌AR在MRS培养基上的生长状态中的生长状态；

由图可知，发现TSA培养基和BHI培养基上生长较好，LB培养基和NA培养基次之，MRS培养基上生长缓慢。

将实施例1中的鸡源乳酸肠球菌AR分别接种至葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露醇、尿素酶、硫化氢、半固体、枸橼酸、明胶酶生化试管中，置于37℃细菌培养箱中培养48h观察记录生化实验结果。

将单个菌落与20μL 的3.0%过氧化氢（接触酶生化实验试剂）混匀，观察是否有气泡产生（产生气泡为阳性）。生化特性如下表4：

表4 鸡源乳酸肠球菌AR生化特性

注：+：表示阳性；-：表示阴性

由表4可见鸡源乳酸肠球菌AR利用大多数糖类，不产生接触酶，不液化明胶，无运动力（半固体生化试管中，沿接种线生长，不发生扩散，即无运动力），不产生硫化氢和尿素酶。

实施例16 鸡源乳酸肠球菌AR的药物敏感性

将实施例2与实施例8所培养的两批鸡源乳酸肠球菌AR分别进行以下操作：分别划线接种至1块MRS平板培养基，将接种后的培养基置37℃细菌培养箱中培养48h后，根据菌落大小挑取单个生长旺盛的菌落接种至MRS肉汤培养基中，37℃振荡培养24h后，计活菌数，得活菌数分别为1.00×10⁹CFU/mL、1.01×10⁹CFU/mL，使用时活菌数浓度分别稀释为1.0×10⁶CFU/mL，按照药敏实验要求（参照1999年美国临床实验室标准化委员会下设的纸片扩散法敏感试验委员会推荐的标准方法）分别涂布在两批12个NA平板上，每批分别在相应的12个NA平板上贴上标准的药敏纸片（庆大霉素、林可霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、泰乐菌素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠、新霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、多西环素、卡那霉素、安普霉素），将上述贴有药敏纸片的NA平板置于37℃细菌培养箱中培养48h后测量结果，具体结果见下表。

表5 鸡源乳酸肠球菌AR药敏结果

表6 部分抗生素抑菌环解释标准

由表5、表6可知，实施例2与实施例8所培养的菌株鸡源乳酸肠球菌AR对庆大霉素，氟苯尼考，多西环素具有高度药物敏感性；菌株鸡源乳酸肠球菌AR对泰乐菌素具有中度药物敏感性；菌株鸡源乳酸肠球菌AR对林可霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、新霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、卡那霉素、安普霉素无药物敏感性。其中恩诺沙星参考同类药物诺氟沙星的抑菌环解释标准，泰乐菌素参考同类药物红霉素的抑菌环解释标准。

实施例17 鸡源乳酸肠球菌AR接种鸡胚的安全性

将实施例2与实施例8所培养的两批鸡源乳酸肠球菌AR分别进行以下操作：分别划线接种至MRS培养基，将接种后的培养基置于37℃细菌培养箱中培养48h，挑取鸡源乳酸肠球菌AR的单个菌落接种至添加有2.0%小牛血清的LB培养基，于37℃摇床培养箱中振荡培养24h，按照细菌涂布计数方法，计活菌数，两批的活菌数分别为1.00×10⁹CFU /mL、1.03×10⁹CFU /mL，分别将每批的菌液浓度各稀释至100CFU/0.1mL，300CFU/0.1mL，1000CFU/0.1mL，3000CFU/0.1mL四个剂量，每批的实验组分为相应的4组，每组分别将上述浓度的菌液接种至11日龄SPF鸡胚，每组接种10枚鸡胚，对照组接种相同体积的生理盐水，接种后观察7天，每天照蛋，统计鸡胚存活情况。7天后两批共8组鸡胚均正常存活。

实施例18 鸡源乳酸肠球菌AR对大肠杆菌的抑制作用

将实施例17中两批鸡源乳酸肠球菌AR的活菌数分别稀释至1.0×10⁷CFU得鸡源乳酸肠球菌AR菌液，分别进行以下操作：

分别取鸡源乳酸肠球菌AR菌液100μL与50μL浓度为7.0×10⁶CFU禽致病性大肠杆菌同时接种至30mL 含有10%葡萄糖的LB培养基中分别为两批共同培养组，对照组分别单独接种两批100μL鸡源乳酸肠球菌AR、50μL大肠杆菌至30mL 含有10%葡萄糖的LB培养基中，将四组接种后的培养基分别置于37℃摇床，每分钟180转振荡培养12h，24h，36h和48h后测定pH值，分别计算鸡源乳酸肠球菌AR菌数和大肠杆菌数，计数结果如下表：

表7 鸡源乳酸肠球菌AR和大肠杆菌菌数统计一览表

由表7可知，培养12h时，鸡源乳酸肠球菌AR和大肠杆菌均有所增长，其中共同培养组的大肠杆菌的增长量低于单独培养的增长量，共同培养组的鸡源乳酸肠球菌AR的生长量略高于单独培养的增长量，且pH分别降至3.91、3.90，低于单独培养大肠杆菌培养液的pH4.40，高于鸡源乳酸肠球菌AR培养液的pH 3.65和3.66；培养24h后，共同培养组中鸡源乳酸肠球菌AR的增长量和单独培养的鸡源乳酸肠球菌AR增长量相似，共同培养组的大肠杆菌的增长量明显低于单独培养的大肠杆菌增长量（统计的数量级大肠杆菌为0），pH进一步降低；同时24h后共同培养组的大肠杆菌统计的数量级为0，说明共同培养组中大肠杆菌完全消失，鸡源乳酸肠球菌AR对大肠杆菌有很好的抑制作用。

实施例19 鸡源乳酸肠球菌AR的治疗试验

选取养殖场2000只240日龄罗曼褐产蛋鸡，存在血蛋、血斑蛋、脱肛等蛋鸡输卵管炎症状，试验组分别饮用实施例2、实施例8所培养的鸡源乳酸肠球菌AR的菌液，连续饮用5天，对照组自由饮水；使用5天后两批试验组血蛋、血斑蛋等症状消失，脱肛情况均明显减少；对照组血蛋、血斑蛋、脱肛等蛋鸡输卵管炎症状未见减少。

实施例20 鸡源乳酸肠球菌AR的急性毒理学试验

将实施例17中两批鸡源乳酸肠球菌AR分别浓缩10倍，50倍和100倍后，一批的活菌数分别为1.00×10¹⁰CFU /mL，5.00×10¹⁰CFU /mL，1.00×10¹¹CFU /mL，二批的活菌数分别为1.03×10¹⁰CFU /mL，5.15×10¹⁰CFU /mL，1.03×10¹¹CFU /mL；两批均分别接种至22周龄的SPF蛋鸡，每批的实验组分为4组，对照组1组，共9组，通过滴口饲喂，每只鸡饲喂1mL实验样品，分别为：对照组：饲喂生理盐水；一批试验1组：饲喂1.00×10⁹CFU的活菌；一批试验2组：饲喂1.00×10¹⁰CFU的活菌，一批试验3组：饲喂5.00×10¹⁰CFU的活菌，一批试验4组：饲喂1.00×10¹¹CFU 活菌，二批试验1组：饲喂1.03×10⁹CFU的活菌；一批试验2组：饲喂1.03×10¹⁰CFU的活菌，一批试验3组：饲喂5.15×10¹⁰CFU的活菌，一批试验4组：饲喂1.03×10¹¹CFU活菌，每组接种5只SPF鸡，接种后观察14天，记录鸡的临床反应，以及剖检后器官病变情况，结果显示：对照组和试验组鸡均正常，无病变发生。

实施例21 鸡源乳酸肠球菌AR的耐酸性特征

取100μL浓度为1.0×10⁸CFU的实施例2和实施例8所培养的两批鸡源乳酸肠球菌AR，分别接种至pH为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的MRS肉汤培养基中，置于37℃摇床振荡培养24h后，按照细菌涂布计数方法（行业内常规的活菌计数方法），计活菌数，计数结果分别为：pH为1.0时，两批均无细菌生长，pH为2.0时，两批的活菌数分别为1.30×10⁶CFU /mL、1.29×10⁶CFU /mL，pH为3.0时，两批的活菌数分别为2.00×10⁷CFU /mL、2.07×10⁷CFU /mL，pH为4.0时，两批的活菌数分别为2.50×10⁸CFU /mL、2.48×10⁸CFU /mL ，pH为5.0时，两批的活菌数分别为6.00×10⁸CFU /mL、6.11×10⁸CFU /mL，pH为6.0时，两批的活菌数分别为1.00×10⁹CFU /mL、0.99×10⁹CFU /mL。

序列表

<110> 河北科星药业有限公司

<120> 鸡源乳酸肠球菌AR及其筛选方法、应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> Enterococcus lactis

<400> 1

cgggcggtgt gtaactgccc ggtaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 60

gcgattccgg cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactgaga gaagctttaa 120

gagattagct tagcctcgcg acttcgcaac tcgttgtact tcccattgta gcacgtgtgt 180

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240

ccggcagtct tgctagagtg cccaactgaa tgatggcaac taacaataag ggttgcgctc 300

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360

cactttgccc ccgaagggga agctctatct ctagagtggt caaaggatgt caagacctgg 420

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480

tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 540

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gagcctcagc gtcagttaca 660

gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccatata tctacgcatt tcaccgctac 720

acatggaatt ccactctcct cttctgcact caagtctccc agtttccaat gaccctcccc 780

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tttcaaattg atcgggttac ctggtaagga ttatgagcca tgatcaaact ctac 1374

<210> 2

<211> 527

<212> DNA

<213> Enterococcus lactis

<400> 2

aacaatttca cacaggacct aggccgaagg caaagcctga atattcttct ggatcgattc 60

ctgacatctt caacacattc gggtgcacca tgccagctcc taaaatctcg atccatccag 120

tgtatttaca tacgttacaa ccggcaccac cacatttgaa acagctgaca tctacttcta 180

ctgatggctc cgtaaatggg aaataacttg gacgcaaacg gatttcacga tcttccccaa 240

acattttttt cattacgact tctaatgttc ctttaaggtc gcccatcgtg atgtttttat 300

caacaactag cccttcaatt tgatggaact gatggctgtg ggtcgcatca tctgtatctc 360

tgcggaaaac ttttcctggc gaaatcattc gtagagcacc cttagagaaa tcatgctttt 420

ccattgtccg cgcttggact ggtgaagtat gtgtccgaat caatatctcg tctgaaatat 480

agaaagtatc ttgcatatca cgaggcagga tggtcgtgac tgggaaa 527

Claims

1.一种鸡源乳酸肠球菌AR，其特征在于:所述鸡源乳酸肠球菌AR的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年09月10日，保藏编号为CGMCC No. 18483，拉丁文名称为Enterococcuslactis。

2.权利要求1所述的鸡源乳酸肠球菌AR的应用，其特征在于:所述鸡源乳酸肠球菌AR用于制备改善母鸡输卵管炎的制剂。