CN111011590B - 复合益生菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合益生菌剂，属于兽用益生菌领域，它含鸡源乳酸肠球菌AR≥8.0×1010CFU/mL，屎肠球菌S2≥1.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌≥1.0×1010CFU/mL，解决了鸡产蛋期因输卵管炎导致蛋品质下降的问题。本发明还公开了上述复合益生菌剂的制备方法，由体积份数5‑8份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数1‑3份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数1‑2份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成；本发明还提供了上述复合益生菌剂用于改善鸡输卵管炎的应用。本发明的复合益生菌剂可改善蛋禽细菌性输卵管炎，改善蛋壳质量、提高产蛋率，本发明的复合益生菌剂用于喂饲母鸡以实现防病治病的目的。
Description
技术领域
本发明属于兽用益生菌领域，具体涉及一种复合益生菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，由于消费者对食品安全的关注度不断提升，国家对兽用抗生素的监管也愈发严格，药物饲料添加剂将在2020年全部退出。农业农村部公布关于2018-2021年开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作的通知，明确了养殖端限抗、禁抗的时间表。面对国家出台的“限抗”、“禁抗”政策，开发替代抗生素部分功能的产品，具有较大的市场需求，尤其是以益生菌及其代谢产物为主的微生态制剂具有较好的开发潜力和广阔的应用前景。进一步地，开发功能性益生菌及其代谢产物替代部分抗生素功能，贯彻落实国家政策，可为畜牧业助力，为食品安全保驾护航。
目前，应用较广泛的改善鸡输卵管炎的产品多是抗生素、中药制剂以及一些调节肠道的芽孢杆菌制剂，虽然这些产品也能够达到改善鸡输卵管炎的目的，但仍存在以下不足：
其一，抗生素类药物因长期使用，造成细菌的耐药性增强，残留，影响食品安全等问题，已限制使用；
其二，中药制剂以及一些调节肠道的芽孢杆菌制剂针对鸡输卵管的改善效果不佳。
因此，现有的改善鸡输卵管炎的产品安全性差、改善效果不好，进而造成鸡产蛋期因输卵管炎导致的蛋品质下降、产蛋率下降以及产蛋高峰期缩短等问题。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种复合益生菌剂及其制备方法与应用，以解决鸡产蛋期因输卵管炎导致的蛋品质下降、产蛋率下降以及产蛋高峰期缩短等问题；
本发明的另一个目的，是要提供上述复合益生菌剂的一种制备方法；
本发明的还有一个目的，是要提供上述复合益生菌剂的一种应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明所用到的屎肠球菌S2通常购自山东蔚蓝生物科技有限公司；乳酸片球菌通常购自山东宝来利来生物工程股份有限公司。上述屎肠球菌S2和乳酸片球菌为公众容易得到的普通菌种，其在国内外商业上能够买到。
一种复合益生菌剂，它中含鸡源乳酸肠球菌AR≥8.0×1010CFU/mL，屎肠球菌S2≥1.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌≥1.0×1010CFU/mL。
本发明还提供了上述复合益生菌剂的一种制备方法，它是由体积份数5-8份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数1-3份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数1-2份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成。
作为本发明的一种限定，各菌液是由相应的菌泥复溶制得，
即：鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液是由鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌泥复溶制得；
屎肠球菌S2发酵产物的菌液是由屎肠球菌S2发酵产物的菌泥复溶制得；
乳酸片球菌发酵产物的菌液是由乳酸片球菌发酵产物的菌泥复溶制得。
作为本发明的进一步限定，所述复溶是以原发酵液或生理盐水为溶剂溶解菌泥，所得菌液的体积为菌泥体积的比10-30倍。
作为本发明的进一步限定，菌泥的制备过程均包括依次进行的以下步骤：
步骤1）制备活化菌种：
取菌种接种至培养基A上，置于细菌培养箱中30-38℃培养24-48h，制得活化菌种；
步骤2）制备纯化菌种：
取活化菌种接种到培养基B，置于细菌培养摇床中培养，取OD600为1.5-4.0时的菌种，即为纯化菌种，经火焰保护，接入不同的种子罐；
步骤3）制备发酵液：
根据需求量进行至少一级发酵，制得发酵液；
步骤4）制备菌泥：
取发酵液离心，制得菌泥。
作为本发明的更进一步限定，培养基A的主要成分为蛋白胨5.0-14.0g/L、牛肉浸粉1.0-6.0g/L、酵母浸粉1.0-5.0g/L、葡萄糖6.0-25.0g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、柠檬酸三铵1.0-5.0g/L、醋酸钠1.0-6.0g/L、七水硫酸镁0.05-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-1g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L、琼脂粉13.0-17.0 g/L；调节培养基A的pH值至5.8-6.2。
作为本发明的更进一步限定，培养基B的主要成分为蛋白胨5.0-14.0 g/L、牛肉浸粉1.0-6.0 g/L、酵母浸粉1.0-5.0 g/L、葡萄糖6-25.0 g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5 g/L、柠檬酸三铵1.0-3.5 g/L、醋酸钠1.0-6.0 g/L、七水硫酸镁0.05-0.3 g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L；调节培养基B的pH值至5.8-6.2。
作为本发明的更进一步限定，步骤3）中，一级发酵的条件为：在35-42℃、溶氧DO≥15%条件下，在发酵培养基C上培养6-8h，当分光光度计600 nm波长时的吸光值 OD600在2.5-3.5之间时，移种至二级种子罐或OD600＞3.5时停罐；
当进行二级发酵或若干级发酵时，二级发酵或若干级发酵的条件为：在35-42℃，溶氧DO≥15%，pH 5.5-7.0，转速 80-120rpm，风量2-5m³/h， 罐压 0.03-0.07MPa条件下，在发酵培养基C上培养15-18h ，当pH回升差值达到0.1时，移种至下一级种子罐或停罐；
发酵培养基C的主要成分为蔗糖20-35g/L、麦芽糊精10-25g/L、酵母浸粉 10-30g/L、1，4-丁二醇1.0-5.0g/L、蛋白胨 4.0-12.0g/L、结晶乙酸钠3.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.5-3.0g/L、磷酸氢二钾1.0-3.0g/L、七水硫酸镁0.1-0.7g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-80 0.5-1.5g/L、司班-80 0.5-1.5g/L；调节发酵培养基的pH值至6.3-6.7。
作为本发明的更进一步限定，步骤2）中，取活化菌种接种至培养基B，在35-42℃、150-200rpm条件下，培养14-18h。
本发明还提供了上述复合益生菌剂的一种应用，所述复合益生菌用于改善鸡输卵管炎。
上述的应用，通过将复合益生菌剂以无菌生理盐水稀释后，投入饮水或者拌料给蛋鸡饲喂，连用3-5天实现鸡输卵管炎的改善。具体方法为，将复合益生菌剂以1L无菌生理盐水稀释后，当投入饮水使用时，需先控水，集中2-3h内饮完；当拌料使用时，需当天拌料当天使用完。优选上午8点之前使用。该复合益生菌剂需4-8℃冷藏保存。
鸡源乳酸肠球菌AR的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年09月10日，保藏编号为CGMCC No. 18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis。
鸡源乳酸肠球菌AR为革兰氏染色阳性椭球形细菌，发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇，不发酵木糖，不产生硫化氢，不液化明胶，不利用枸橼酸，尿素酶为阴性。在MRS、TSA、BHI和LB培养基上生长良好，菌落大小为1-3mm。耐酸性较强（在pH=3.0的条件下可以正常生长），生长速率高，产酸速度快（含葡萄糖的LB培养基培养24h，pH可降到4.0以下），生长温域宽（10-45℃可正常生长），在纯培养和鸡体内条件下可产酸。
本发明针对鸡类的生殖系统保健和疾病改善问题，将从健康产蛋鸡输卵管中分离的鸡源乳酸肠球菌AR与屎肠球菌S2、乳酸片球菌复配后，制成复合益生菌剂。
本发明复合益生菌剂中鸡源乳酸肠球菌AR可以快速定殖输卵管，排阻致病菌的定殖，产生抑制致病菌的代谢产物，从而杀灭致病菌，保证蛋鸡的输卵管健康。
由于鸡的肠道和输卵管于泄殖腔处交汇，多数输卵管炎是由于泄殖腔或环境中的致病菌经交汇处上行感染，从而导致鸡输卵管炎的发生。而屎肠球菌S2和乳酸片球菌进入肠道后，能够大量繁殖，产生细菌素、过氧化氢、乳酸等抑菌物质，抑制肠道内致病菌，从而达到清洁肠道的作用。因此，屎肠球菌S2和乳酸片球菌的清理肠道作用，一定程度上对于鸡输卵管炎的治疗有辅助作用。
本发明与现有技术相比，所取得的技术进步如下：
本发明中复合益生菌剂中的鸡源乳酸肠球菌AR来源于高产蛋鸡的输卵管内，屎肠球菌S2和乳酸片球菌来源于健康鸡肠道，均为鸡的原籍菌，该菌剂应用于鸡，适应性更强，定殖能力更好，且对鸡的输卵管保健效果好，可有效改善蛋禽细菌性输卵管炎，改善蛋壳质量，提高产蛋率，延长产蛋高峰期 ，减少软蛋、血蛋、沙皮蛋、脱肛、啄肛，降低鸡蛋破损率。
本发明的复合益生菌剂适用于饲喂母鸡，能改善鸡输卵管炎。
附图说明：
图1为本发明实施例13中的鸡源乳酸肠球菌AR革兰染色形态（1000×）；
图2 为本发明实施例13中的屎肠球菌S2革兰染色结果（1000×）；
图3 为本发明实施例13中的乳酸片球菌革兰染色结果（1000×）；
图4 为本发明实施例4中的鸡源乳酸肠球菌AR在TSA培养基、BHI培养基、LB培养基、NA培养基、MRS培养基上的生长状态。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中：胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基），脑心浸液培养基（BHI），营养琼脂培养基（NA），亚硫酸铁琼脂培养基，购自北京奥博星生物科技有限公司；
胰蛋白胨，酵母粉购自OXOID公司；
氯化钠，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；
生化试管，革兰染色液，药敏纸片购自杭州滨和生物试剂有限公司；
小牛血清，购自Thermo公司；
营养琼脂平板培养基购自北京奥博星生物科技有限公司；
培养基A、培养基B、发酵培养基C为本公司按下述比例配制：
培养基A的主要成分为蛋白胨5.0-14.0g/L、牛肉浸粉1.0-6.0g/L、酵母浸粉1.0-5.0g/L、葡萄糖6.0-25.0g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、柠檬酸三铵1.0-5.0g/L、醋酸钠1.0-6.0g/L、七水硫酸镁0.05-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-1g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L、琼脂粉13.0-17.0 g/L；调节培养基A的pH值至5.8-6.2；
培养基B的主要成分为蛋白胨5.0-14.0 g/L、牛肉浸粉1.0-6.0 g/L、酵母浸粉1.0-5.0 g/L、葡萄糖6-25.0 g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5 g/L、柠檬酸三铵1.0-3.5 g/L、醋酸钠1.0-6.0 g/L、七水硫酸镁0.05-0.3 g/L、一水硫酸锰0.01-0.1 g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L；调节培养基B的pH值至5.8-6.2；
发酵用培养基C的成分为：蔗糖20-35g/L、麦芽糊精10-25g/L、酵母浸粉 10-30g/L、1，4-丁二醇1.0-5.0g/L、蛋白胨 4.0-12.0g/L、结晶乙酸钠3.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.5-3.0g/L、磷酸氢二钾1.0-3.0g/L、七水硫酸镁0.1-0.7g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-80 0.5-1.5g/L、司班-80 0.5-1.5g/L；调节发酵培养基的pH值至6.3-6.7。
实施例1 鸡源乳酸肠球菌AR
一种鸡源乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）AR，该菌是从母鸡输卵管内容物中分离筛选出来的，并于2019年09月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis。
其16SrRNA序列如下：
CGGGCGGTGTGTAACTGCCCGGTAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGCCCCCGAAGGGGAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCAAATCAAAACCATGCGGTTTCGATTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTTCTGATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCCTCTTTTTCAAATTGATCGGGTTACCTGGTAAGGATTATGAGCCATGATCAAACTCTAC。
其PheS基因序列如下：
AACAATTTCACACAGGACCTAGGCCGAAGGCAAAGCCTGAATATTCTTCTGGATCGATTCCTGACATCTTCAACACATTCGGGTGCACCATGCCAGCTCCTAAAATCTCGATCCATCCAGTGTATTTACATACGTTACAACCGGCACCACCACATTTGAAACAGCTGACATCTACTTCTACTGATGGCTCCGTAAATGGGAAATAACTTGGACGCAAACGGATTTCACGATCTTCCCCAAACATTTTTTTCATTACGACTTCTAATGTTCCTTTAAGGTCGCCCATCGTGATGTTTTTATCAACAACTAGCCCTTCAATTTGATGGAACTGATGGCTGTGGGTCGCATCATCTGTATCTCTGCGGAAAACTTTTCCTGGCGAAATCATTCGTAGAGCACCCTTAGAGAAATCATGCTTTTCCATTGTCCGCGCTTGGACTGGTGAAGTATGTGTCCGAATCAATATCTCGTCTGAAATATAGAAAGTATCTTGCATATCACGAGGCAGGATGGTCGTGACTGGGAAA。
其中，鸡源乳酸肠球菌AR革兰染色形态（1000×）参见图1。
实施例2 鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法
本实施例为实施例1所涉及的鸡源乳酸肠球菌AR的筛选方法，包括依次进行的以下步骤：
a1）在无菌条件下取自健康产蛋期的母鸡输卵管，取出后在无菌条件下密封保存；
无菌条件下取母鸡输卵管中的内容物置于无菌厌氧培养箱备用；
a2）将内容物接种于胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基）；
a3）将接种后的TSA培养基置于37℃的厌氧培养箱中静置培养48h，得培养物E；厌氧环境由体积比为10：5：85的H2、CO2和N2组成；
a4）在培养物E中挑取单菌落F接种至MRS琼脂培养基，置于37℃的普通细菌培养箱静置培养48h，得纯培养物M；
a5）挑取纯培养物M的单个菌落接种至含1%小牛血清的LB培养基；
将接种后的LB培养基置于37℃的摇床中振荡培养48h，即得鸡源乳酸肠球菌AR，保存。
实施例3 鸡源乳酸肠球菌AR的细菌学特征
1、基本特征
本实施例为实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR的细菌学基本特征，其基本特征如下表所示：
表1 鸡源乳酸肠球菌AR的基本特征
2、生化特征
本发明的鸡源乳酸肠球菌AR是一种兼性厌氧菌，耐酸性较强，生长率高，产酸速率快，在10-45℃正常生长，在培养基和鸡体内均显示出了较好的产酸能力，在pH3.0的条件下快速生长。
将实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR划线接种至培养基A，TSA培养基，BHI培养基，NA培养基，LB培养基培养基，将接种后的培养基分别置于37℃细菌培养箱中培养48h，观察生长状态，参见图4，鸡源乳酸肠球菌AR在TSA培养基、BHI培养基、LB培养基、NA培养基、培养基A上的生长状态中的生长状态，发现TSA培养基和BHI培养基上生长较好，LB培养基和NA培养基次之，培养基A上生长缓慢，但生长量较多；
培养基A的成分为蛋白胨5.0 g/L、牛肉浸粉6.0 g/L、酵母浸粉1.0g/L、葡萄糖6.0g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、柠檬酸三铵3.5 g/L、醋酸钠6.0 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、一水硫酸锰0.01 g/L、吐温-80 2.0g/L、明胶 0.5g/L、番茄汁2.0g/L、琼脂粉17.0 g/L；调节培养基A的pH值至6.0±0.2。
将实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR分别接种至葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露醇、尿素酶、硫化氢、半固体、枸橼酸、明胶酶生化试管中，置于37℃细菌培养箱中培养48h观察记录生化实验结果。
将单个菌落与20μL 的3.0%过氧化氢（接触酶生化实验试剂）混匀，观察是否有气泡产生（产生气泡为阳性）。生化特性如下表2：
表2 鸡源乳酸肠球菌AR生化特性
注：+表示阳性；-表示阴性
由表4可见鸡源乳酸肠球菌AR利用大多数糖类，不产生接触酶，不液化明胶，无运动力（半固体生化试管中，沿接种线生长，不发生扩散，即无运动力），不产生硫化氢和尿素酶。
实施例4 鸡源乳酸肠球菌AR的药物敏感性
培养基A的成分为：蛋白胨5.0 g/L、牛肉浸粉6.0 g/L、酵母浸粉1.0g/L、葡萄糖6.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、柠檬酸三铵3.5 g/L、醋酸钠6.0 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、一水硫酸锰0.01 g/L、吐温-80 2.0g/L、明胶 0.5g/L、番茄汁2.0g/L、琼脂粉17.0 g/L，调节MRS培养基的pH值至6.0±0.2；
将实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR进行以下操作：划线接种至1块MRS平板培养基，将接种后的培养基置37℃细菌培养箱中培养48h后，根据菌落大小挑取单个生长旺盛的菌落接种至MRS肉汤培养基中，37℃振荡培养24h后，计活菌数，得活菌数为1.00×109CFU/mL，使用时活菌数浓度稀释为1.0×106CFU/mL，按照药敏实验要求（参照1999年美国临床实验室标准化委员会下设的纸片扩散法敏感试验委员会推荐的标准方法）分别涂布在12个NA平板上，在相应的12个NA平板上贴上标准的药敏纸片（庆大霉素、林可霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、泰乐菌素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠、新霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、多西环素、卡那霉素、安普霉素），将上述贴有药敏纸片的NA平板置于37℃细菌培养箱中培养48h后测量结果，具体结果见下表。
表3 鸡源乳酸肠球菌AR药敏结果
表4部分抗生素抑菌环解释标准
由表3、表4可知，实施例2所培养的菌株鸡源乳酸肠球菌AR对庆大霉素，氟苯尼考，多西环素具有高度药物敏感性；菌株鸡源乳酸肠球菌AR对泰乐菌素具有中度药物敏感性；菌株鸡源乳酸肠球菌AR对林可霉素、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、新霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、卡那霉素、安普霉素无药物敏感性。其中恩诺沙星参考同类药物诺氟沙星的抑菌环解释标准，泰乐菌素参考同类药物红霉素的抑菌环解释标准。
实施例5 鸡源乳酸肠球菌AR接种鸡胚的安全性
培养基A的成分为：蛋白胨5.0 g/L、牛肉浸粉6.0 g/L、酵母浸粉1.0g/L、葡萄糖6.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、柠檬酸三铵3.5 g/L、醋酸钠6.0 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、一水硫酸锰0.01 g/L、吐温-80 2.0g/L、明胶 0.5g/L、番茄汁2.0g/L、琼脂粉17.0 g/L，调节MRS培养基的pH值至6.0±0.2；
将实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR划线接种至培养基A，将接种后的培养基置于37℃细菌培养箱中培养48h，挑取鸡源乳酸肠球菌AR的单个菌落接种至添加有2.0%小牛血清的LB培养基，于37℃摇床培养箱中振荡培养24h，按照细菌涂布计数方法，计活菌数，活菌数为1.0×109CFU /mL，分别将菌液浓度稀释至100CFU/0.1mL，300CFU/0.1mL，1000CFU/0.1mL，3000CFU/0.1mL四个剂量，实验组分为4组，每组分别将上述浓度的菌液接种至11日龄SPF鸡胚，每组接种10枚鸡胚，对照组接种相同体积的生理盐水，接种后观察7天，每天照蛋，统计鸡胚存活情况。7天后各组鸡胚均正常存活。
实施例6 鸡源乳酸肠球菌AR对大肠杆菌的抑制作用
将实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR的活菌数适当稀释至1.0×107CFU得鸡源乳酸肠球菌AR菌液，取菌液100μL和50μL浓度为7.0×106CFU禽致病性大肠杆菌同时接种至30mL 含有10%葡萄糖的LB培养基中为共同培养组，对照组分别单独接种100μL鸡源乳酸肠球菌AR、50μL大肠杆菌至30mL 含有10%葡萄糖的LB培养基中，将三组接种后的培养基分别置于37℃摇床，每分钟180转振荡培养12h，24h，36h和48h后测定pH值，分别计算鸡源乳酸肠球菌AR菌数和大肠杆菌数，计数结果如下表：
表5 鸡源乳酸肠球菌AR和大肠杆菌菌数统计一览表
由表5可知，培养12h时，鸡源乳酸肠球菌AR和大肠杆菌均有所增长，其中共同培养组的大肠杆菌的增长量低于单独培养的增长量，共同培养组的鸡源乳酸肠球菌AR的生长量略高于单独培养的增长量，且pH降至3.91，低于单独培养大肠杆菌培养液的pH 4.40，高于鸡源乳酸肠球菌AR培养液的pH 3.65；培养24h后，共同培养组中鸡源乳酸肠球菌AR的增长量和单独培养的鸡源乳酸肠球菌AR增长量差不多，共同培养组的大肠杆菌的增长量明显低于单独培养的大肠杆菌增长长量（统计的数量级大肠杆菌为0），pH进一步降低；同时24h后共同培养组的大肠杆菌统计的数量级为0，说明共同培养组中大肠杆菌完全消失，鸡源乳酸肠球菌AR对大肠杆菌有很好的抑制作用。
综上所述，鸡源乳酸肠球菌AR对大肠杆菌有很好的抑制作用。
实施例7 鸡源乳酸肠球菌AR的急性毒理学试验
将实施例5中鸡源乳酸肠球菌AR分别浓缩10倍，50倍和100倍后，活菌数分别为1.0×1010CFU /mL，5.0×1010CFU /mL，1.0×1011CFU /mL，分别接种至22周龄的SPF蛋鸡，实验组分为5组，通过滴口饲喂，每只鸡饲喂1mL实验样品，分别为：对照组：饲喂生理盐水；试验1组：饲喂1.0×109CFU的活菌；试验2组：饲喂1.0×1010CFU的活菌，试验3组：饲喂5.0×1010CFU的活菌，试验4组：饲喂1.0×1011CFU 活菌，每组接种5只SPF鸡，接种后观察14天，记录鸡的临床反应，以及剖检后器官病变情况，结果显示：对照组和试验组鸡均正常，无病变发生。
综上所述，鸡源乳酸肠球菌AR能够应用于蛋鸡，不具有急性毒性。
实施例8 鸡源乳酸肠球菌AR的耐酸性特征
取100μL浓度为1.0×108CFU的实施例2所培养的鸡源乳酸肠球菌AR分别接种至pH为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的培养基B中，置于37℃摇床振荡培养24h后，按照细菌涂布计数方法（行业内常规的活菌计数方法），计活菌数，计数结果分别为：pH为1.0时，无细菌生长，pH为2.0时，活菌数为1.3×106CFU /mL，pH为3.0时，活菌数为2.0×107CFU /mL ，pH为4.0时，活菌数为2.5×108CFU /mL ，pH为5.0时，活菌数为6.0×108CFU /mL，pH为6.0时，活菌数为1.0×109CFU /mL。
综上所述，鸡源乳酸肠球菌AR具有一定的耐酸性。
实施例9 复合益生菌剂及制备方法
一种复合益生菌剂，由体积份数6份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数3份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数2份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成。
上述复合益生菌剂中菌总含量为1.7×1011CFU/mL；其中，鸡源乳酸肠球菌AR的含量为1.2×1011CFU/mL，屎肠球菌S2的含量为3.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌的含量为2.0×1010CFU/mL。
实施例10 复合益生菌剂及制备方法
一种复合益生菌剂，由体积份数8份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数1份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数2份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成。
上述复合益生菌剂中菌总含量为1.0×1011CFU/mL；其中，鸡源乳酸肠球菌AR的含量为8.0×1010CFU/mL，屎肠球菌S2的含量为1.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌的含量为2.0×1010CFU/mL。
实施例11 复合益生菌剂及制备方法
一种复合益生菌剂，由体积份数5份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数2份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数1份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成。
上述复合益生菌剂中菌总含量为1.5×1011CFU/mL；其中，鸡源乳酸肠球菌AR的含量为1.0×1011CFU/mL，屎肠球菌S2的含量为4.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌的含量为2.0×1010CFU/mL。
实施例12 复合益生菌剂及制备方法
一种复合益生菌剂，由体积份数7份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数3份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数1份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成。
上述复合益生菌剂中菌总含量为2.2×1011CFU/mL；其中，鸡源乳酸肠球菌AR的含量为1.4×1011CFU/mL，屎肠球菌S2的含量为6.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌的含量为2.0×1010CFU/mL。
实施例13 复合益生菌剂的制备方法
一种复合益生菌剂的制备方法，包括依次进行的如下步骤：
下述菌种为鸡源乳酸肠球菌AR、屎肠球菌S2、乳酸片球菌中的任一一种，三种菌种制备最后复配用的菌液的方法相同，在此不再一一赘述。
其中，鸡源乳酸肠球菌AR革兰染色形态（1000×）参见图1；屎肠球菌S2革兰染色结果（1000×）参见图2 ；乳酸片球菌革兰染色结果（1000×）参见图3。
步骤1）制备活化菌种：
将菌种接种至培养基A上，置于细菌培养箱中37℃培养24h，制得活化菌种；
培养基A的成分为蛋白胨5.0 g/L、牛肉浸粉6.0 g/L、酵母浸粉1.0g/L、葡萄糖6.0g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、柠檬酸三铵3.5 g/L、醋酸钠6.0 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、一水硫酸锰0.01 g/L、吐温-80 2.0g/L、明胶 0.5g/L、番茄汁2.0g/L、琼脂粉17.0 g/L；调节MRS培养基的pH值至6.0；
步骤2）制备纯化菌种：
分别取1mL活化菌种接种至300mL培养基B上，置于细菌培养摇床中，在37℃、180rpm条件下，培养16h，采用分光光度计检测三种活化菌种的生长情况，取OD600为1.5时的菌种，即为纯化菌种，经火焰保护，接入一级种子罐；
培养基B的成分为蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉5.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、醋酸钠5.0 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、一水硫酸锰0.05 g/L、吐温-80 1.0g/L；调节培养基B的pH值6.0。
步骤3）制备发酵液：
c1）一级发酵：
A.校正pH电极。
B.种子罐培养基pH：6.3，加入3mL消泡剂，结合冷凝水情况定容消前体积，控制消后体积30L。121℃实消25min。
C.校正DO条件：
校正0点：浸入饱和无水亚硫酸钠溶液；
校正100%点：灭菌降温结束接种之前，转速100rpm 、风量0.2m³/h 、罐压0.05Mpa。
D.种子罐接种后培养条件
温度37℃，通过搅拌控制DO≥15%，在发酵培养基上培养6h，当OD600＞2.5时，移种至二级种子罐。注意：移种前移种管道蒸汽灭菌30min，灭菌后用二级种子罐的空气保压。
若仅需少量菌液，可以只经过一级发酵即可，停罐后即可使用。
c2）二级发酵：
A.校正pH电极。
B.发酵培养基消前pH：6.3，消前加入50mL消泡剂。结合冷凝水情况定容消前体积，控制消后体积300L。121℃实消25min。
C.校正DO条件：
校正0点：浸入饱和无水亚硫酸钠溶液；
校正100%点：灭菌降温结束接种之前，转速50rpm 、风量3m³/h 、罐压 0.05Mpa。
D.培养条件：
温度37℃，溶氧DO≥15%，流加氨水控制pH 6.0，转速50rpm、风量2m³/h、 罐压0.05Mpa。
发酵过程DO控制：DO≤30%后，通过交替提高搅拌10rpm、风量0.5m³/h、罐压0.01Mpa，控制DO＞10%，其中搅拌最高提至350 rpm、风量最高18m³/h、罐压最高 0. 1Mpa。
泡沫控制：如泡沫多液面较高，优先提高罐压，少量多次流加消泡剂控制泡沫低于消泡桨叶。
发酵过程检测项：每4h测一次OD600和离线pH，检测发酵是否结束；每12h取无菌样在营养琼脂平板划线检测无菌状况；每4h涂片染色显微镜拍照镜检。
注意：每次取样后取样口蒸汽灭菌30min，取无菌样时取样前后管道均需蒸汽灭菌30min。
E.补料工艺：
称取3kg蔗糖，热水溶解后定容至6L，装入10L补料瓶，用纱布及牛皮纸包好补料瓶的针头、瓶口，放入灭菌柜121℃灭菌15min。
发酵10h，在500L罐顶火焰保护插上补料针，通过蠕动泵一次性将灭菌后的6L蔗糖补加入500L罐。
停罐标准：发酵16h，pH回升差值达到0.1，停罐。
停罐操作：搅拌降至30rpm，罐压升高至0.1Mpa，空气流量降至0.5m³/h，温度降至20℃以下等待放料。
c3）若干级发酵
根据需求量，进行三级、四级或者更多级发酵，实际操作与二级发酵控制和二级发酵停罐标准相同，不同之处仅在于发酵罐的大小，最终达到发酵需求量后，发酵检测结果中pH回升差值达到0.1时，停罐。
发酵培养基C的成分为：蔗糖20g/L、麦芽糊精25g/L、酵母浸粉 10g/L、1，4-丁二醇5.0g/L、蛋白胨 4.0g/L、结晶乙酸钠3.0g/L、柠檬酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、七水硫酸镁0.7g/L、一水硫酸锰0.01g/L、吐温-80 1.5g/L、司班-80 1.5g/L；调节发酵培养基C的pH值至6.5。
步骤4）制备菌泥：
发酵液通过管路连接管式离心机，间歇进料每次200L，室温下离心排出的上清液至无上清液排出，收集离心机内剩余的菌体，即为菌泥，菌泥收集率占发酵液体积的3.0%。
离心排出的上清液排入灭活罐灭活后处理。
步骤5）制备复合益生菌剂
取鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌泥，以原发酵液为溶剂，复溶菌泥制得鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液，复溶后的体积与菌泥体积的比为30：1。
屎肠球菌S2发酵产物的菌液和乳酸片球菌发酵产物的菌液与鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液的复溶方法相同，在此不再一一赘述。
取复溶后的三种菌液按实施例9比例复配，灌装，包装，即得复合益生菌剂。
实施例14-17 复合益生菌的制备方法
实施例14-17分别为复合益生菌的制备方法，其制备步骤与实施例25的制备步骤相同，不同之处在于各步骤各参数有差别，参数差别见下表6：
表6 实施例14-17的不同参数
其中，实施例14中的培养基A的主要成分为蛋白胨14.0g/L、牛肉浸粉1.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、葡萄糖25.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、柠檬酸三铵1.0g/L、醋酸钠1.0g/L、七水硫酸镁0.05g/L、一水硫酸锰1g/L、吐温-80 0.5g/L、明胶2.0g/L、番茄汁0.3g/L、琼脂粉13.0 g/L；调节培养基A的pH值至5.8；
培养基B的主要成分为蛋白胨14.0 g/L、牛肉浸粉6.0 g/L、酵母浸粉1.0g/L、葡萄糖25.0 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、柠檬酸三铵3.5 g/L、醋酸钠1.0g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、一水硫酸锰0.1 g/L、吐温-80 2.0g/L、明胶 2.0g/L、番茄汁0.3g/L；调节培养基B的pH值至5.8；
发酵培养基C的成分为蔗糖35g/L、麦芽糊精10g/L、酵母浸粉30g/L、1，4-丁二醇1.0g/L、蛋白胨12.0g/L、结晶乙酸钠9.0g/L、柠檬酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾3.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.1g/L、吐温-80 0.5g/L、司班-80 0.5g/L；调节发酵培养基C的pH值至6.3。
实施例15中的培养基A的主要成分为蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L、酵母浸粉3.0g/L、葡萄糖10.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、柠檬酸三铵3.0g/L、醋酸钠3.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.5g/L、吐温-80 1.0g/L、明胶 1.0g/L、番茄汁1.0g/L、琼脂粉15.0g/L，调节培养基A的pH值至5.9；
培养基B的主要成分为蛋白胨5.0 g/L、牛肉浸粉1.0g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖6.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、醋酸钠6.0 g/L、七水硫酸镁0.05g/L、一水硫酸锰0.01g/L、吐温-80 0.5g/L、明胶 2.0g/L、番茄汁2.0g/L；调节培养基B的pH值至6.1；
发酵培养基C的成分为蔗糖20-35g/L、麦芽糊精10-25g/L、酵母浸粉 10-30g/L、1，4-丁二醇1.0-5.0g/L、蛋白胨 4.0-12.0g/L、结晶乙酸钠3.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.5-3.0g/L、磷酸氢二钾1.0-3.0g/L、七水硫酸镁0.1-0.7g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-800.5-1.5g/L、司班-80 0.5-1.5g/L；调节发酵培养基C的pH值至6.7。
实施例16中的培养基A的主要成分为蛋白胨8.0g/L、牛肉浸粉2.0g/L、酵母浸粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、醋酸钠2.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.1g/L、吐温-80 1.5g/L、明胶1.5g/L、番茄汁1.5g/L、琼脂粉16.0g/L；调节培养基A的pH值至6.2；
培养基B的主要成分为蛋白胨5.0～14.0 g/L、牛肉浸粉1.0-6.0 g/L、酵母浸粉1.0-5.0 g/L、葡萄糖6-25.0 g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5 g/L、柠檬酸三铵1.0-3.5 g/L、醋酸钠1.0-6.0 g/L、七水硫酸镁0.05-0.3 g/L、一水硫酸锰0.01-0.1 g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L；调节培养基B的pH值至5.9；
发酵培养基C的成分为蔗糖30g/L、麦芽糊精20g/L、酵母浸粉20g/L、1，4-丁二醇3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、结晶乙酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、吐温-80 1.0g/L、司班-80 1.0g/L；调节发酵培养基C的pH值至6.4。
实施例17中的培养基A的主要成分为蛋白胨12.0g/L、牛肉浸粉4.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖15.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、柠檬酸三铵4.0g/L、醋酸钠4.0g/L、七水硫酸镁0.25g/L、一水硫酸锰0.8g/L、吐温-80 0.8g/L、明胶0.8g/L、番茄汁0.5g/L、琼脂粉14.0g/L；调节培养基A的pH值至6.1；
培养基B的主要成分为蛋白胨12.0 g/L、牛肉浸粉3.0 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、柠檬酸三铵2.5 g/L、醋酸钠3.0 g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、吐温-80 1.0g/L、明胶 1.0g/L、番茄汁1.0g/L；调节培养基B的pH值至6.2；
发酵培养基C的成分为蔗糖25g/L、麦芽糊精15g/L、酵母浸粉 15g/L、1，4-丁二醇2.0g/L、蛋白胨 5.0g/L、结晶乙酸钠7.0g/L、柠檬酸铵1.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.3g/L、一水硫酸锰0.08g/L、吐温-80 0.8g/L、司班-80 0.8g/L；调节发酵培养基C的pH值至6.6。
实施例18 复合益生菌剂对产蛋鸡输卵管炎的改善作用
某养殖场9000只360日龄罗曼褐产蛋鸡，存在血蛋，啄肛等蛋鸡输卵管炎症状，将9000只360日龄罗曼褐产蛋鸡平均分为5组，实验组1将实施例9的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组2将实施例10的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组3将实施例11的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组4将实施例12的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，对照组自由饮水；5天后实验组1、2、3、4血蛋和啄肛症状消失，对照组血蛋和啄肛症状未见减少。
结论：复合益生菌剂能够有效减少血蛋和啄肛症状，证明复合益生菌剂具有很好的改善产蛋鸡输卵管炎的作用。
实施例19 复合益生菌剂对蛋破损率的降低作用
某养殖场20000只300日龄京粉产蛋鸡，存在破损蛋，蛋壳颜色差，沙皮蛋，斑点蛋等输卵管炎症状，将20000只300日龄京粉产蛋鸡平均分为5组，实验组1将实施例9的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组2将实施例10的任一复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组3将实施例11的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组4将实施例12的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，对照组自由饮水；5天后实验组1相对对照组蛋破损率降低80%，实验组2相对对照组蛋破损率降低83%，实验组3相对对照组蛋破损率降低78%，实验组4相对对照组蛋破损率降低81%，实验组1、2、3、4蛋壳颜色转好，沙皮蛋和斑点蛋情况消失，对照组症状未见减少。
结论：复合益生菌剂能够有效降低蛋破损率，证明复合益生菌剂具有很好的改善产蛋鸡输卵管炎的作用。
实施例20 复合益生菌剂对畸形蛋产量的降低作用
某养殖场20000只260日龄新罗曼产蛋鸡，存在沙壳、软皮、褪色、畸形、麻点蛋等蛋鸡输卵管炎症状，将20000只260日龄新罗曼产蛋鸡平均分为5组，实验组1将实施例9的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组2将实施例10的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组3将实施例11的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，实验组4将实施例12的复合益生菌剂投入饮水，连续饮水5天，对照组自由饮水；5天后实验组1相对对照组畸形蛋减少90%，实验组2相对对照组畸形蛋减少89%，实验组3相对对照组畸形蛋减少92%，实验组4相对对照组畸形蛋减少91%，实验组1、2、3、4蛋壳光泽发亮、蛋壳厚度增加，对照组症状未见减少。
结论：复合益生菌剂能够有效降低畸形蛋的产量，证明复合益生菌剂具有很好的改善产蛋鸡输卵管炎的作用。
序列表
<110> 河北科星药业有限公司
<120> 复合益生菌剂及其制备方法与应用
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> Enterococcus lactis
<400> 1
cgggcggtgt gtaactgccc ggtaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 60
gcgattccgg cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactgaga gaagctttaa 120
gagattagct tagcctcgcg acttcgcaac tcgttgtact tcccattgta gcacgtgtgt 180
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240
ccggcagtct tgctagagtg cccaactgaa tgatggcaac taacaataag ggttgcgctc 300
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360
cactttgccc ccgaagggga agctctatct ctagagtggt caaaggatgt caagacctgg 420
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480
tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 540
agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 600
actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gagcctcagc gtcagttaca 660
gaccagagag ccgccttcgc cactggtgtt cctccatata tctacgcatt tcaccgctac 720
acatggaatt ccactctcct cttctgcact caagtctccc agtttccaat gaccctcccc 780
ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 840
ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900
gtggctttct ggttagatac cgtcaaggga tgaacagtta ctctcatcct tgttcttctc 960
taacaacaga gttttacgat ccgaaaacct tcttcactca cgcggcgttg ctcggtcaga 1020
ctttcgtcca ttgccgaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1080
cagtcccaat gtggccgatc accctctcag gtcggctatg catcgtggcc ttggtgagcc 1140
gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggtccatcca tcagcgacac ccgaaagcgc 1200
ctttcaaatc aaaaccatgc ggtttcgatt gttatacggt attagcacct gtttccaagt 1260
gttatcccct tctgatgggc aggttaccca cgtgttactc acccgttcgc cactcctctt 1320
tttcaaattg atcgggttac ctggtaagga ttatgagcca tgatcaaact ctac 1374
<210> 2
<211> 527
<212> DNA
<213> Enterococcus lactis
<400> 2
aacaatttca cacaggacct aggccgaagg caaagcctga atattcttct ggatcgattc 60
ctgacatctt caacacattc gggtgcacca tgccagctcc taaaatctcg atccatccag 120
tgtatttaca tacgttacaa ccggcaccac cacatttgaa acagctgaca tctacttcta 180
ctgatggctc cgtaaatggg aaataacttg gacgcaaacg gatttcacga tcttccccaa 240
acattttttt cattacgact tctaatgttc ctttaaggtc gcccatcgtg atgtttttat 300
caacaactag cccttcaatt tgatggaact gatggctgtg ggtcgcatca tctgtatctc 360
tgcggaaaac ttttcctggc gaaatcattc gtagagcacc cttagagaaa tcatgctttt 420
ccattgtccg cgcttggact ggtgaagtat gtgtccgaat caatatctcg tctgaaatat 480
agaaagtatc ttgcatatca cgaggcagga tggtcgtgac tgggaaa 527
Claims (5)
1.一种复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合益生菌剂中含鸡源乳酸肠球菌AR≥8.0×1010CFU/mL，屎肠球菌S2≥1.0×1010CFU/mL，乳酸片球菌≥1.0×1010CFU/mL；它是由体积份数5-8份鸡源乳酸肠球菌AR发酵产物的菌液、体积份数1-3份屎肠球菌S2发酵产物的菌液和体积份数1-2份乳酸片球菌发酵产物的菌液复配而成；所述鸡源乳酸肠球菌AR是从母鸡输卵管内容物中分离筛选出来的，并于2019年09月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18483，拉丁文名称为Enterococcus lactis；各菌液是由相应的菌泥复溶制得；所述复溶是以原发酵液或生理盐水为溶剂溶解菌泥，所得菌液的体积为菌泥体积的10-30倍；菌泥的制备过程均包括依次进行的以下步骤：
步骤1）制备活化菌种：
取菌种接种至培养基A上，于30-38℃培养24-48h，制得活化菌种；
步骤2）制备纯化菌种：
取活化菌种接种到培养基B，培养，取OD600为1.5-4.0时的菌种，即为纯化菌种，经火焰保护，接入不同的种子罐；
步骤3）制备发酵液：
根据需求量进行至少一级发酵，制得发酵液；
步骤4）制备菌泥：
取发酵液离心，制得菌泥。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，培养基A的主要成分为蛋白胨5.0-14.0g/L、牛肉浸粉1.0-6.0g/L、酵母浸粉1.0-5.0g/L、葡萄糖6.0-25.0g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、柠檬酸三铵1.0-5.0g/L、醋酸钠1.0-6.0g/L、七水硫酸镁0.05-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-1g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L、琼脂粉13.0-17.0 g/L；调节培养基A的pH值至5.8-6.2。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，培养基B的主要成分为蛋白胨5.0-14.0 g/L、牛肉浸粉1.0-6.0g/L、酵母浸粉1.0-5.0g/L、葡萄糖6-25.0 g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5 g/L、柠檬酸三铵1.0-3.5 g/L、醋酸钠1.0-6.0 g/L、七水硫酸镁0.05-0.3 g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-80 0.5-2.0g/L、明胶 0.5-2.0g/L、番茄汁0.3-2.0g/L；调节培养基B的pH值至5.8-6.2。
4.根据权利要求1所述的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3）中，一级发酵的条件为：在35-42℃、溶氧DO≥15%条件下，在发酵培养基C上培养6-8h，当分光光度计600nm波长时的吸光值OD600在2.5-3.5之间时，移种至二级种子罐或OD600＞3.5时停罐；当进行二级发酵或若干级发酵时，二级发酵或若干级发酵的条件为：在35-42℃，溶氧DO≥15%，pH5.5-7.0，转速80-120rpm，风量2-5
m³/h， 罐压0.03-0.07MPa条件下，在发酵培养基C上培养15-18h，当pH回升差值达到0.1时，移种至下一级种子罐或停罐；发酵培养基C的主要成分为蔗糖20-35g/L、麦芽糊精10-25g/L、酵母浸粉10-30g/L、1，4-丁二醇1.0-5.0g/L、蛋白胨4.0-12 .0g/L、结晶乙酸钠3.0-9.0g/L、柠檬酸铵0.5-3.0g/L、磷酸氢二钾1.0-3.0g/L、七水硫酸镁0.1-0.7g/L、一水硫酸锰0.01-0.1g/L、吐温-80 0.5-1.5g/L、司班-80 0.5-1.5g/L；调节发酵培养基的pH值至6.3-6.7。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，取活化菌种接种至培养基B，在35-42℃、150-200rpm条件下，培养14-18h。
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Application publication date: 20200417 Assignee: HEBEI GREENLAND ANIMAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980002521 Denomination of invention: Composite probiotics and their preparation methods and applications Granted publication date: 20221202 License type: Common License Record date: 20240305 |