CN106236782A - 乳酶生制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含活性活肠链球菌组分的口服制剂，具体涉及乳酶生制备方法及应用。该制备方法由菌种纯化、配置培养基、灭菌、接种、发酵、菌体分离等步骤组成，通过本发明所述制备方法工艺简单易操作，活菌数高，生命力强，每克菌粉含乳酸菌2亿个左右，通过对其生命力研究发现，在2年的有效期内，该菌死亡数量在5％以内。用本发明制备方法制备的产品，质量稳定，安全可靠，对治疗小儿及成人胃肠疾病如消化不良、腹胀、腹泻等有显著疗效。
Description
技术领域
本发明涉及含活性活肠链球菌组分的口服制剂，具体涉及乳酶生制备方法及应用。
背景技术
乳酶生,又叫“表飞鸣”，是一种传统的活菌素制剂。乳酶生为白色或淡黄色干燥粉末；微臭，无味，几乎不溶于水。用于消化不良，肠内异常发酵，小儿腹泻及小儿绿便等。乳酶生为活肠球菌的干燥制剂，在肠内分解糖类生成乳酸，使肠内酸度增高，从而抑制腐败菌的生长繁殖，并防止肠内发酵，减少产气，因而有促进消化和止泻作用。传统的乳酶生制备方法存在诸多缺陷，例如活菌数量少，生命力不强等。
发明内容
本发明提供了乳酶生制备方法及应用，使用本发明所述的制备方法制备出来的药物其活性成分与现有技术相比显著提升，并且对于小儿胃肠疾病具有良好的治愈效果。
本发明由以下技术方案实现：
乳酶生制备方法及应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(2)菌种纯化
取活肠球菌冻干菌种，放入液体培养基在37℃条件下24小时后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时，接入脱脂鲜奶牛奶试管培养37℃恒温12小时后，将牛奶试管置紫外灯下照射15分钟后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时后，分接于试管中，备用；
(2)配置三级培养基：配置一、二、三级培养基；
(3)培养基灭菌：一、二、三级培养基灭菌时间均为121℃灭菌30分钟；
(4)接种：
一级种子接种操作过程：取生产用斜面菌种，以无菌操作法，用接种环取菌苔接入一级种子培养液中，接种量约为6％，将接种好的一级种子培养液放入培养箱内培养；
二级种子接种操作过程：取培养好的一级种子培养液，按无菌操作法，将一级种子培养液迅速倒入二级培养基中，接种量约为17ml，将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内培养；三级种子接种操作过程：取培养好的二级种子液，按无菌操作法，将二级种子液迅速倒入三级培养基中，接种量约为354.5ml，将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内发酵；
(5)发酵：将三级种子进行发酵培养；
(6)菌体分离：
将布氏漏斗内，铺好已灭菌600目滤布，再将滤布上铺上滤纸，用无菌水润湿，再将400克灭菌后的碳酸钙用400ml已灭菌纯化水溶解后倒入漏斗内，真空抽滤，待碳酸钙干燥后缓缓倒入发酵液，真空度为-0.03—-0.05Mpa，待发酵液完全抽滤完毕后，继续抽滤见滤饼出现裂隙时停止。
进一步地，所述步骤(1)中液体培养基由以下组分组成：蛋白胨1.5g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，纯化水200ml。
进一步地，所述步骤(1)中平板培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，琼脂2g，纯化水200ml。
进一步地，所述一级培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉浸膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g。
进一步地，所述二级培养基由以下组分组成：蛋白胨163g，牛肉浸膏108g，氯化钠136g，葡萄糖108g，碳酸钙32g。
进一步地，所述三级培养基由以下组分组成：蛋白胨4000g，牛肉浸膏540g，氯化钠540g，葡萄糖4320g，碳酸钙1040g。
进一步地，所述步骤(2)中三级培养基的配置方法为：
一级培养基的配制：将一级培养基所需物料加入272ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.2-6.4范围内，纱布过滤，均分装于16支试管中，每支约17ml；
二级培养基的配制：将二级培养基所需物料加入5400ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶三角瓶中，每瓶装量约337.5ml；
三级培养基的配制：将三级培养基所需物料加入108000ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶圆底烧瓶中，每瓶装量约6750ml既得。
进一步地，所述步骤(5)发酵培养过程为：
一级种子的发酵培养：将接种好的一级种子液放入生化培养箱内37±1℃静止培养48小时；
二级种子液的发酵培养：将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每隔40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解。发酵培养18小时；
三级种子的发酵培养：将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解，发酵培养16小时。
进一步地，所述步骤(6)中碳酸钙的灭菌条件为在121℃的条件下灭菌30min。
进一步地，所述乳酶生制备方法制得的药物在治疗胃肠疾病上的应用。
本发明的有益效果：通过本发明所述制备方法工艺简单易操作，严格控制培养基组分及含量，监控发酵培养时间和温度，促进其主要活性成分的生长繁殖，活菌数高，生命力强，每克菌粉含乳酸菌2亿个左右，通过对其生命力研究发现，在2年的有效期内，该菌死亡数量在5％以内。用本发明制备方法制备的产品，质量稳定，安全可靠，对治疗小儿及成人胃肠疾病如消化不良、腹胀、腹泻等有显著疗效。
具体实施方式
实施例1
乳酶生制备方法及应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)菌种纯化
取活肠球菌冻干菌种，放入液体培养基在37℃条件下24小时后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时，接入脱脂鲜奶牛奶试管培养37℃恒温12小时后，将牛奶试管置紫外灯下照射15分钟后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时后，分接于试管中，备用；
(2)配置三级培养基：配置一、二、三级培养基；
(3)培养基灭菌：一、二、三级培养基灭菌时间均为121℃灭菌30分钟；
(4)接种：
一级种子接种操作过程：取生产用斜面菌种，以无菌操作法，用接种环取菌苔接入一级种子培养液中，接种量约为6％，将接种好的一级种子培养液放入培养箱内培养；
二级种子接种操作过程：取培养好的一级种子培养液，按无菌操作法，将一级种子培养液迅速倒入二级培养基中，接种量约为17ml，将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内培养；三级种子接种操作过程：取培养好的二级种子液，按无菌操作法，将二级种子液迅速倒入三级培养基中，接种量约为354.5ml，将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内发酵；
(5)发酵：将三级种子进行发酵培养；
(6)菌体分离：
将布氏漏斗内，铺好已灭菌600目滤布，再将滤布上铺上滤纸，用无菌水润湿，再将400克灭菌后的碳酸钙用400ml已灭菌纯化水溶解后倒入漏斗内，真空抽滤，待碳酸钙干燥后缓缓倒入发酵液，真空度为-0.03—-0.05Mpa，待发酵液完全抽滤完毕后，继续抽滤见滤饼出现裂隙时停止。
进一步地，所述步骤(1)中液体培养基由以下组分组成：蛋白胨1.5g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，纯化水200ml。
进一步地，所述步骤(1)中平板培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，琼脂2g，纯化水200ml。
进一步地，所述一级培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉浸膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g。
进一步地，所述二级培养基由以下组分组成：蛋白胨163g，牛肉浸膏108g，氯化钠136g，葡萄糖108g，碳酸钙32g。
进一步地，所述三级培养基由以下组分组成：蛋白胨4000g，牛肉浸膏540g，氯化钠540g，葡萄糖4320g，碳酸钙1040g。
进一步地，所述步骤(2)中三级培养基的配置方法为：
一级培养基的配制：将一级培养基所需物料加入272ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.2-6.4范围内，纱布过滤，均分装于16支试管中，每支约17ml；
二级培养基的配制：将二级培养基所需物料加入5400ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶三角瓶中，每瓶装量约337.5ml；
三级培养基的配制：将三级培养基所需物料加入108000ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶圆底烧瓶中，每瓶装量约6750ml既得。
进一步地，所述步骤(5)发酵培养过程为：
一级种子的发酵培养：将接种好的一级种子液放入生化培养箱内37±1℃静止培养48小时；
二级种子液的发酵培养：将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每隔40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解。发酵培养18小时；
三级种子的发酵培养：将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解，发酵培养16小时。
进一步地，所述步骤(6)中碳酸钙的灭菌条件为在121℃的条件下灭菌30min。
进一步地，所述乳酶生制备方法制得的药物在治疗胃肠疾病上的应用。
含量测定：
取本品10g，照乳酸菌制剂检验法项下的活乳酸菌数测定法测定。每1g样品含乳酸菌数为2.35×109个。
在24个月内对乳酸菌活菌浓度进行测定，测定结果见下表：
| 时间(月数) | 1 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 |
| 数量(×109CFU/g) | 2.35 | 2.35 | 2.34 | 2.32 | 2.30 | 2.27 |
对本发明中所公开的实施方式的描述并非为了限制本发明的范围，而是用于描述本发明。相应地，本发明的范围不受以上实施方式的限制，而是由权利要求或其等同物进行限定。
Claims (10)
1.乳酶生制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)菌种纯化
取活肠球菌冻干菌种，放入液体培养基在37℃条件下24小时后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时，接入脱脂鲜奶牛奶试管培养37℃恒温12小时后，将牛奶试管置紫外灯下照射15分钟后接入平板培养基中于37℃恒温培养48小时后，分接于试管中，备用；
(2)配置三级培养基：配置一、二、三级培养基；
(3)培养基灭菌：一、二、三级培养基灭菌时间均为121℃灭菌30分钟；
(4)接种：
一级种子接种操作过程：取生产用斜面菌种，以无菌操作法，用接种环取菌苔接入一级种子培养液中，接种量约为6％，将接种好的一级种子培养液放入培养箱内培养；
二级种子接种操作过程：取培养好的一级种子培养液，按无菌操作法，将一级种子培养液迅速倒入二级培养基中，接种量约为17ml，将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内培养；
三级种子接种操作过程：取培养好的二级种子液，按无菌操作法，将二级种子液迅速倒入三级培养基中，接种量约为354.5ml，将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内发酵；
(5)发酵：将三级种子进行发酵培养；
(6)菌体分离：
将布氏漏斗内，铺好已灭菌600目滤布，再将滤布上铺上滤纸，用无菌水润湿，再将400克灭菌后的碳酸钙用400ml已灭菌纯化水溶解后倒入漏斗内，真空抽滤，待碳酸钙干燥后缓缓倒入发酵液，真空度为-0.03—-0.05Mpa，待发酵液完全抽滤完毕后，继续抽滤见滤饼出现裂隙时停止。
2.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中液体培养基由以下组分组成：蛋白胨1.5g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，纯化水200ml。
3.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中平板培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g，琼脂2g，纯化水200ml。
4.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述一级培养基由以下组分组成：蛋白胨2.6g，牛肉浸膏0.8g，氯化钠1.3g，乳糖5.3g。
5.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述二级培养基由以下组分组成：蛋白胨163g，牛肉浸膏108g，氯化钠136g，葡萄糖108g，碳酸钙32g。
6.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述三级培养基由以下组分组成：蛋白胨4000g，牛肉浸膏540g，氯化钠540g，葡萄糖4320g，碳酸钙1040g。
7.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中三级培养基的配置方法为：
一级培养基的配制：将一级培养基所需物料加入272ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.2-6.4范围内，纱布过滤，均分装于16支试管中，每支17ml；
二级培养基的配制：将二级培养基所需物料加入5400ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶三角瓶中，每瓶装量337.5ml；
三级培养基的配制：将三级培养基所需物料加入108000ml纯化水中加热到微沸，使其溶解，PH值应在6.5-7.0范围内，用纱布滤过，滤液分装于16瓶圆底烧瓶中，每瓶装量6750ml既得。
8.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述步骤(5)发酵培养过程为：
一级种子的发酵培养：将接种好的一级种子液放入生化培养箱内37±1℃静止培养48小时；
二级种子液的发酵培养：将接种好的二级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每隔40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解。发酵培养18小时；
三级种子的发酵培养：将接种好的三级种子液放入电热恒温培养箱内37±1℃发酵培养，每40分钟振摇一次，使瓶底碳酸钙完全溶解，发酵培养16小时。
9.根据权利要求1所述的乳酶生制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中碳酸钙的灭菌条件为在121℃的条件下灭菌30min。
10.所述乳酶生制备方法制得的药物在治疗胃肠疾病上的应用。
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