CN105567590A - 一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物菌领域，具体为一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用；步骤包括：制备扩大菌种液和一级种子培养液得到一级菌种液，再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐菌种，再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵液，当发酵完毕后，进行发酵液离心，得到湿菌泥，其中湿菌泥即为双歧杆菌乳酸菌的混合发酵菌泥；通过本发明制备出的双歧杆菌混合菌具有菌的活性高，保质期时间长，最大程度的使双歧杆菌产生更多的有效物质，避免了双歧杆菌受到氧气、水分、光线、保护基质等条件的影响。

Description

一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用

技术领域

本发明涉及生物菌领域，具体为一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用。

背景技术

双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，是人体有益菌中最值得重视和研究的一种，它与人体的健康密不可分。可以说是大自然赐予人类的健康法宝。

双歧杆菌是人体和动物体肠道中最重要的正常菌群之一，能在肠道黏膜上生长形成一道膜菌群，构成一道生物学屏障，从而使入侵的致病菌在肠道内失去生长繁殖的落脚点，双歧杆菌在肠道内生长繁殖代谢产生的乙酸、乳酸、醋酸等。既能使肠道环境变酸，而不利于有害菌在肠道内生长，又能促使肠道蠕动有利于排便和排出有害细菌。双歧杆菌可以持续产生，维生素B1、B2、B6、B12及丙氨酸，天冬氨酸和苏氨酸等人体必要的营养物质，同时产生短链脂肪酸，抗氧化剂，修复胃肠黏膜，促使胃肠溃疡恢复。

双歧杆菌能抑制硝酸盐的还原，降低血液中的氨和游离酚含量的作用，增强人体免疫力和降低体内胆固醇，保持低血脂状态。

长期服用双歧杆菌能够降低胃肠细胞的受损，有助于防止胃肠器官的癌变，降低胃肠内致癌物质，减低血液中的毒性，减轻肝脏压力，平衡胃肠道菌群，清除胃肠道内的腐败菌，将粪便中的亚硝酸盐等诱发癌症的物质分解，从而阻止致癌物质的形成，为人体免疫系统提供营养，抑制癌细胞繁殖，产生抑制肿瘤细胞的化合物，降低细胞化学诱变的机会，对腹泻、便秘有双向调节的明显作用。

科学研究已证实，世界上不少长寿地区的长寿老人，其肠道内的双歧杆菌仍保持着青春壮年水平。

微生态学的现代化崛起和医学技术的进展，使双歧杆菌研究的重要性越来越被认识，由于双歧杆菌制品在世界范围内得以广泛应用，大众已认识到其重要性，这也为双歧杆菌制品的研究开发奠定了发展基础。

双歧杆菌是一种严格厌氧菌，它对生存环境的要求非常苛刻，对营养条件要求较高，易受氧、水分、光线，保护基质等条件的影响，保质期较短，服用后又被胃酸、胆汁酸等的灭活，能安全进入肠道的微乎其微，加上生产工艺，配方的不合理缺陷，发酵过程中未能在很大程度上使双歧杆菌产生更多对人体有益的有效物质，所以服用双歧杆菌制品后的效果就会下降或不明显。

双歧杆菌的多种生物学功能，已被科学发现并应用于各个领域，双歧杆菌要求厌氧及营养要求条件较高且生长缓慢，因此双歧杆菌的生产关键问题是筛选耐氧、耐酸、粘附力强，产量高的菌株，寻求该菌株必要的生长促进物，并选择该菌株在非厌氧条件或兼性厌氧条件下的最佳生产工艺，配方等技术。多年来国内外科学家对双歧杆菌菌株的筛选、驯化、诱变等做了一系列实验，据资料显示，到目前为止，非厌氧或兼性厌氧双歧杆菌的生产及产品在常温下的保存技术仍在实验室阶段，因此，提高双歧杆菌活菌产量及先进的生产工艺及配方这一问题显得越来越重要。

双歧杆菌活菌及其发酵代谢产物对人体健康起到重要作用，但现阶段双歧杆菌的生产方法，主要是厌氧发酵法，但该方法生产周期长，设备投资大，设备利用率和产菌收率低，有效物质单一，产品使用效果不显著，适用范围小，因产品对氧和温度极为敏感，对酸的抵抗力较差，活菌保持较为困难，货架期短，不能有效发挥治疗、保健作用。

针对现有技术所存在的技术问题，山东环亿生物科技有限公司，经多年的深入研究开发，经过人体、动物、植物的多方面试验，成功的开发出一整套齐全的配方、酶解、诱导、发酵法生产双歧杆菌及其代谢产物的方法，该方法的优点在于具有生产配方简单、易操作、发酵周期短、产品收率高、原材料易得、活菌收率高、代谢产物丰富，生产成本更加低廉，使用效果更加明显广泛，产品货架期长，并突破了常温下可保存的难点。

发明内容

为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，对菌种进行了较为全面的分离筛选，规定了特殊的配方及发酵工艺，使双歧杆菌产品达到了耐氧、耐酸、耐常温下储存。干粉在常温下能保持12个月不变，有效物质短链脂肪酸、乙酸、乳酸，经测定比一般生产方法及配方活菌分别提高了10倍、15倍，应用效果明显，发酵液中的活菌量由原来的6—8亿个/毫升，提高到了现在的16—20亿个活菌/毫升，以下是具体技术方案：

一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，步骤包括：制备扩大菌种液和一级种子培养液得到一级菌种液，再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐菌种，再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵液，当发酵完毕后，进行发酵液离心，得到湿菌泥，其中湿菌泥即为双歧杆菌乳酸菌的混合发酵菌泥，再将湿菌泥的冷冻干燥，其中冷冻干燥还包括悬菌液的制备和真空干燥，其中悬菌液的制备包括取湿菌泥并加入无菌蒸馏水加热至60~65℃，并搅拌并加入麦芽糊精，溶化后再加入水、脱脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40℃的条件下搅拌1~2小时，得到悬菌液，然后将悬菌液放入恒温室中恒温60分钟进行预冻，其中真空干燥步骤为将预冻好的料盘放入真空干燥室进行抽真空干燥，并且干燥条件为真空度为10~15pa，温度为-50℃，干燥室温度为32℃，干燥时间为55小时，冻干完毕后收集冻干料；其中扩大菌种液制备包括酶解法制备试管培养基和接种两部分；其中一级种子培养液制备包括酶解法制备一级种子培养液；所述的种子培养基的制备包括酶解法制备种子培养基；所述的发酵罐培养基的制备包括酶解法制备发酵罐培养基。

其中，所述的扩大菌种液的制备包括酶解法制备试管培养基：将10g核桃仁、10g花生仁、5克酪蛋白酸钠、0.1克无水氯化钙不分前后顺序投入到300ml水中进行研磨并打成浆状过滤得到浆液，再在浆液中加入700ml水并进行加热至53℃~57℃并进行搅拌，在搅拌中加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入3gL-精氨酸、3g番茄粉、6g牛肉膏、2g酵母浸粉、5g蛋白胨、0.1g柠檬酸铵、0.6g丝氨酸、3g氯化钠、5g乳糖、8g葡萄糖、8g乙酸钠、3.2g磷酸氢二钾进行搅拌溶解后分装于试管中，每支试管中分装20ml。将所述多个试管放入医用消毒器中，采用0.1~0.14Mpa灭菌20分钟后得到试管培养基；

4、接种：在无菌条件下，打开冻干管菌种，其中冻干管菌种包括：双歧杆菌（菌号：CGTMCC—1.2212，中国普通微生物菌种保藏管理中心），短双歧杆菌（菌号：CGTMCC—1.2213，中国普通微生物菌种保藏管理中心），婴儿双岐杆菌（菌号：CGTMCC—1.2202，中国普通微生物菌种保藏管理中心），鼠李糖乳杆菌（菌号：CICC—6065，中国工业微生物菌种保藏管理中心），将所述的4株菌种内分别加入以上灭菌的试管培养基1ml，摇动溶化后得到冻干管菌悬液备用，再将所述的4支冻干管菌悬液分别各取1ml加入至4支试管培养基中在31-37℃的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中摇动24~30小时制得扩大菌种液。

其中，一级种子培养基培养中各组分为：核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸钠10克、L—精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵母浸粉3克、蛋白胨3克、柠檬酸胺0.15克、丝氨酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化钠3克、乳糖10克、葡萄糖15克、乙酸钠6克、无水氯化钙0.1克、磷酸氢二钾2克、50万单位脂肪酶10克、10万单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自然；将一级种子培养基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、无水氯化钙加入所述600毫升的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后再所得浆液中加入400毫升水并加热到53℃~57℃并进行搅拌，在搅拌下加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入其他原料，进行搅拌熔化得到一级种子培养液；将一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超净工作台中降温，当温度降到31℃~37℃，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中，即100ml一级种子培养液接入的扩大菌种液为4ml，在31-37℃的温度下，采用摇瓶机在150-210转/每分钟的转速下，摇动12-28小时得到一级菌种液。

其中，种子罐培养步骤：将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理；其中种子罐培养基中各组分的重量比为：核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸钠0.2%、L—精氨酸0.3%、番茄粉0.2%、牛肉膏0.4%、蛋白胨0.2%、丁酸钙0.5%、柠檬酸胺0.02%、丝氨酸0.04%、葡萄糖酸0.5%、氯化钠0.3%、乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸钠0.3%、无水氯化钙0.03%、可溶性淀粉0.3%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、磷酸氢二钾0.2%、聚醚消泡剂0.01%、自来水90%，PH自然；将种子罐培养基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙加入20公斤的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后将浆液加热到53℃~57℃进行搅拌，在搅拌中加入脂肪酶进行酶解，再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液、剩余量的水和原料不分先后顺序的投入种子罐并进行搅拌，然后经过高温灭菌及降温处理后，将所述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，接种量分别是罐内种子培养基的2%，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液。

其中，发酵液制备步骤：将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理；其中通风量每100公斤培养液每分钟通入氮气0.1立方米，通入时间为3小时，发酵罐培养：种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为：核桃仁2.5%、花生仁2.5%、酪蛋白酸钠0.3%、L—精氨酸0.3%、磷酸氢二钾0.2%、番茄粉0.2%、卷心菜粉0.1%、牛肉膏0.5%、酵母浸粉0.2%、蛋白胨1%、丁酸钙0.5%、快速渗透剂T0.2%、柠檬酸胺0.2%、丝氨酸0.1%、葡萄糖酸0.6%、氯化钠0.3%、乳糖2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.7%、可溶性淀粉0.2%、无水氯化钙0.1%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、聚醚消泡剂0.1%、自来水83.2%，PH自然；制备发酵罐培养基：首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐中，然后开动搅拌机，结束向搅拌罐中加入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶和无水氯化钙进行搅拌并过滤收集浆液，将浆液加热至53℃~57℃后在搅拌下加入脂肪酶进行酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液和余量的水投入至灭菌的发酵罐并加入余量的原料进行搅拌，转速为80-140转/每分钟，经过高温灭菌及降温处理后，PH值自然，发酵30-40小时。

得到发酵罐培养基；制备诱导液：将丁酸钙、快速渗透剂T、乳糖放至20kg中的自来水中进行搅拌溶化后得到诱导液；接种：通过差压法将种子罐菌种送至发酵罐中，将所述发酵罐培养基接入种子罐菌中，其中接种量是每100kg发酵罐培养基接入种子罐菌种8kg，并在接种过程中加入诱导液进行诱导，得到发酵液；收集湿菌泥：开动管式离心机，调整转速8000转/分钟，以每分钟进料20公斤的进料速度进行例行，弃上清，收集湿菌泥。然后进行二次离心，转速为13000/分钟，弃上清，收集湿菌泥。其中，无菌空气用量为每100公斤种子培养基每分钟用无菌空气0.05立方，PH值自然，搅拌速度80-180转/每分钟，罐压0.05兆帕，温度31-37℃，培养时间20~24小时。

进一步的，制备试管培养基过程中的酶解液和制备一级种子培养液过程中的酶解液的制备是通过过滤后的浆液中加入50万单位的脂肪酶10g酶解10~30分钟，再加入10万单位的无花果酶10g酶解20~70分钟得到。

进一步的，制备种子培养基过程中酶解液和制备发酵罐培养基过程中酶解液的制备是通过过滤后浆液中加入50万单位的脂肪1000g，酶解10~40分钟，再加入10万单位的无花果酶1000g，酶解20~70分钟得到。

进一步的，混合发酵菌的形式包括囊剂、粉剂、片剂、膏剂、液体、奶制品，其中粉剂包括用无菌粉碎机将冻干料粉碎成细度为80目的粉菌；囊剂的复配包括将冻干料粉碎成细度为80目的菌粉10g，与代谢物干燥粉15g、微晶纤维素20g、硅胶粉20g、乳糖10g，硬脂酸镁15g、L-谷氨酰胺10g放入固体搅拌混合机中混合均匀，在无菌条件下分装入胶囊；膏剂包括粉菌进行低温浓缩后的膏状物。

其中，双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌可以运用在农作物的培育中，将双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌按1:3000倍稀释后喷施在黄瓜、茄子的开花到收获的生长过程；可将双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌按1:5000倍的稀释后浇灌于果树的根本。

有益效果：通过本发明制备出的双歧杆菌混合菌具有菌的活性高、活菌收率高，保质期时间长，最大程度的使双歧杆菌产生更多的有效物质，避免了双歧杆菌受到氧气、水分、光线、保护基质等条件的影响，可以运用在人体、禽畜、蔬菜以及水果的保健、生长上，在人体上可用于便秘、腹泻、腹痛等肠道紊乱综合症，胃肠道炎、预防癌症、预防治疗结肠炎、食欲不振、消化不良、营养吸收差，纠正儿童偏食、厌食等病症；改善脂肪代谢紊乱，防止动脉硬化和高血压，预防调节肥胖、减肥等效果，还可提高人体免疫力、缓解失眠等亚健康状态，提高钙、磷、铁的吸收利用率、促进铁和维生素D的吸收，清除人体自由基、抗衰老、延缓肌肤老化等；在禽畜上防止仔猪腹泻，有效改善猪的消化机能，降低猪肉中胆固醇含量，提高瘦肉率，日增重明显，减少猪的死亡率，降低饲养成本；还可提高肉鸡的出肉率，腹泻明显下降，减少死淘率，达到提前出栏的效果，减少蛋鸡死亡率，延长产蛋高峰期，提高产蛋率，减少蛋的破损率，提高鸡体的自身抗病能力，减少抗生素用量，增加动物的抗应激性；在蔬菜上该产品可改善作物营养，增殖作物根际有益菌，激活植物细胞，提高光合作用和抗逆性能力，减少虫害，增产增收；在水果上具有缩短果实成熟期，达到提前上市，增强了果树的抗病能力，成品苹果保质期长，含糖高，汁多，口感好，增产显著。

具体实施方式

实施例1

制备扩大菌种液

培养基的配制：核桃仁10克、花生仁10克、酪蛋白酸钠5克、L—精氨酸3克、番茄粉3克、牛肉膏6克、酵母浸粉2克、蛋白胨5克、柠檬酸胺0.1克、丝氨酸0.6克、氯化钠3克、乳糖5克、葡萄糖8克、乙酸钠8克、无水氯化钙0.1克、磷酸氢二钾3.2克、50万单位脂肪酶10克、10万单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自然。

操作：原料的预处理：

先取配方中的水300毫升，放入研磨机中，然后放入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙，然后开动研磨机将其打成浆状，过滤弃渣收集浆液，然后再将配方中剩余的水，加入到浆液中，将浆液加热至55℃±2℃，在搅拌下加入50万单位的脂肪酶10克酶解10分钟，再加入10万单位的无花果酶10克酶解30分钟即可得到酶解液；然后向酶解液中加入配方中的其它原料，搅拌溶化分装于25×200的试管中，每支试管装20毫升，用硅胶塞牛皮纸封口，放入医用消毒器中0.1—0.14兆帕灭菌20分钟，培养基灭菌完毕，得到试管培养基。

接种：在无菌条件下，分别打开购进的冻干管菌种，因用的是4株菌种，在此须分别接种培养，然后分别向每个开启的冻干管中加入以上灭好菌的试管培养基1毫升，摇动溶化备用，得到冻干管菌悬液，然后取以上灭好菌的试管培养基4支，再将以上溶化好的冻干管菌悬液各取1毫升分别加入到4支试管中，用胶塞，外用保鲜膜、牛皮纸包扎，保持不透气状态，放入摇床上震荡培养，以180—190转/分钟，温度37℃的条件下培育36小时即可，此称为扩大菌种液。

实施例2

制备一级种子培养液

配方：核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸钠10克、L—精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵母浸粉3克、蛋白胨3克、柠檬酸胺0.15克、丝氨酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化钠3克、乳糖10克、葡萄糖15克、乙酸钠6克、无水氯化钙0.1克、磷酸氢二钾2克、50万单位脂肪酶10克、10万单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自然。

操作：原料的预处理：首先取配方中的水600毫升，放入研磨机中，然后加入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙，然后开动研磨机将其打成浆状，过滤弃渣收集浆液，然后将配方中剩余的水加入到浆液中，将浆液加热至55℃±2℃，在搅拌下加入50万单位的脂肪酶10克、酶解20分钟，再加入10万单位的无花果酶10克，酶解60分钟即可，此称为酶解液，然后向酶解液中加入配方中的其它原料，搅拌溶化备用，得到一级种子培养液。

实施例3

制备一级菌种液

将一级种子培养液按用量分装于三角瓶中，然后用八层纱布外加二层牛皮纸扎好瓶口，放入医用消毒器中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀门，等有少量蒸汽排出时关闭。当消毒器上的压力达到0.05兆帕时，打开排气阀门排气6—8分钟，然后关闭排气阀门，继续加温，当压力达到0.1—0.14兆帕时，保持25分钟即可，灭菌完毕后离开加热源，让其自然降温，当压力表归零时，打开消毒器，取出灭好菌的三角瓶培养基放超净工作台中让其自然降温到37℃，然后将以上培养好的扩大菌种液分别加入到三角瓶灭好菌的培养基中。接种分别是4%、即一级种子培养液100毫升、加入扩大菌种液4毫升，完毕后用无菌保鲜膜及牛皮纸密封三角瓶口，不要透气，然后放摇床上，150转/分钟，37℃，培育24小时即可，得到一级菌种液。

实施例4

种子罐菌种培养

配方：核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸钠0.2%、L—精氨酸0.3%、番茄粉0.2%、牛肉膏0.4%、蛋白胨0.2%、丁酸钙0.5%、柠檬酸胺0.02%、丝氨酸0.04%、葡萄糖酸0.5%、氯化钠0.3%、乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸钠0.3%、无水氯化钙0.03%、可溶性淀粉0.3%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、磷酸氢二钾0.2%、聚醚消泡剂0.01%、自来水90%，PH自然。

操作：原料的预处理；首先，取配方中的水20公斤，放入研磨机中，然后加入配方中的核桃仁、花生仁及酪蛋白酸钠、无水氯化钙，开动研磨机将其打成浆状，过滤弃渣收集浆液，将浆液加热至55℃±2℃，在搅拌下加入50万单位的脂肪酶1000克，酶解10分钟，然后再加入10万单位的无花果酶1000克，酶解30分钟即可，此称为酶解液。

将配方中余下的水及酶解液投入到已空罐灭好菌的种子罐中，开动搅拌机，加入配方中所需要的原料，然后在不停地搅拌下通入蒸汽加温，首先利用罐夹层或盘管加热到95℃，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时，保持25分钟即可达到灭菌效果，然后关闭蒸汽，开始降温，当罐中温度降至37℃时备用，得到种子培养基。

然后将培养好的一级菌种液在无菌条件下加入到种子罐中去，接种量分别是罐内种子培养基的2%，进行混合培养混合培养，然后盖好种子罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件为：温度37℃，PH自然。搅拌速度80转/分钟，罐压0.05兆帕，培养时间16小时即达到质量要求。如果罐压降低，可通过氮气保持，过高可通过罐顶的排气阀排出，得到种子罐菌种。

实施例5

发酵液的制备

配方：核桃仁2.5%、花生仁2.5%、酪蛋白酸钠0.3%、L—精氨酸0.3%、磷酸氢二钾0.2%、番茄粉0.2%、卷心菜粉0.1%、牛肉膏0.5%、酵母浸粉0.2%、蛋白胨1%、丁酸钙0.5%、快速渗透剂T0.2%、柠檬酸胺0.2%、丝氨酸0.1%、葡萄糖酸0.6%、氯化钠0.3%、乳糖2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.7%、可溶性淀粉0.2%、无水氯化钙0.1%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、聚醚消泡剂0.1%、自来水83.2%，PH自然。

操作：原料的预处理：（1）首先取配方中的水30公斤，放入研磨机中，然后加入配方中的核桃仁、花生仁及酪蛋白酸钠、无水氯化钙，开动研磨机将其打成浆状，过滤弃渣收集浆液，将浆液加热至55℃±2℃，在搅拌下加入50万单位的脂肪酶1000克，酶解30分钟，然后再加入10万单位的无花果酶1000克，酶解60分钟即可，得到酶解液；（2）将配方中的丁酸钙，快速渗透剂T，乳糖投入到20kg的自来水中，搅拌溶化后115℃灭菌15分钟备用，得到诱导液。

具体操作：将配方中余下的水及酶解液投入到已空罐灭菌的发酵罐中，开动搅拌机，加入配方中其他原料，然后在不停地搅拌下通入蒸汽加温，首先，利用发酵罐的加热器加热到95℃，然后再改用直接蒸汽加热，当罐温度达到121℃时，保持40分钟可达到灭菌的效果，然后降温，当发酵罐中温度降至37℃时备用，得到发酵罐培养基。

接种：首先提高种子罐的压力为0.1兆帕，发酵罐的压力为0.05兆帕，然后打开接种管道的阀门，将培养好的种子罐菌种，通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门。其中接种量是每100公斤发酵罐培养基接入种子罐菌种8公斤。培养条件：发酵温度37℃，搅拌速度100转/分钟，发酵时间36小时，罐压0.05兆帕，PH值自然，氮气通入量每100公斤发酵罐培养基每分钟通入氮气0.01立方米，通入时间3小时。发酵至3小时停止通入氮气，继续发酵，当发酵至8小时，开始用蠕动泵向发酵罐中流加以上灭好菌的诱导液，以每小时0.8公斤的速度流加，发酵至36小时，停止发酵，得到发酵液。

实施例6

收集湿菌泥

开动管式离心机，调整转速8000转/分钟，以每分钟进料20公斤的进料速度进行离心，离心完毕后收集湿菌泥，然后对发酵液进行第二次离心，离心前调整离心机转速13000/分钟，以每分钟进料20公斤的速度进行离心，然后收集湿菌泥。

实施例7

湿菌泥冷冻干燥

悬菌液的制备：取湿菌泥1000克，加入无菌蒸馏水4000毫升，脱脂奶粉600克，乳糖300克，98%的甘油200克，麦芽糊精150克。

操作：首先取配方中的水1500毫升加热至60℃—65℃，在搅拌下加入麦芽糊精，溶化后再加入配方中余下的水，然后再加入配方中其它的原料。在37℃—40℃的条件下充分搅拌1小时，即成为悬菌液，然后将该悬菌液放入37℃的恒温室或箱中恒温60分钟进行预冻。

冷冻干燥前的预冻，将恒温60分钟的悬菌液分装于冻干盘中，然后放入冷冻干燥机的预冻室内在零下40℃—45℃的条件下预冻6小时，冻结后进行抽真空干燥。

真空干燥：将预冻好的料盘放入真空干燥室开始抽真空干燥，干燥条件为：真空度为10—15帕，温度零下50℃，干燥室温度32℃，干燥时间55小时。冻干完毕后收集冻干料，用无菌粉碎机粉碎成细度为80目的菌粉密封包装备用，得到冻干菌粉。

实施例8

胶囊复配

取80目的冻干菌粉10克，代谢物干燥粉15克，微晶纤维素20克，硅胶粉20克，乳糖10克，硬脂酸镁15克，L—谷氨酰胺10克。

操作：将以上各物料放入固体搅拌混合机中混合均匀，然后在无菌条件下分装入胶囊中，装瓶或压片即为成品。

实施例9

表1

人体应用效果

说明：

男性：服用10天对便秘、腹泻、腹痛、结肠炎、消化不良有改善者360人，服用15天明显改善者365人，服用28天显著改善者380人，服用100天达到正常状态的385人，停服180天未出现反复的382人，出现反复的3人，达到预期满意效果。

女性：服用10天对便秘、腹泻、腹痛、结肠炎、消化不良有改善者365人，服用15天明显改善者375人，服用28天显著改善者387人，服用100天达到正常状态的390人，停服180天未出现反复的386人，出现反复的4人，达到预期满意效果。

实施例10

表2

人体应用效果

说明：

男性：服用10天对小儿食欲不振、厌食、肠道炎有改善者380人，服用15天明显改善者385人，服用28天显著改善者383人，服用100天达到正常状态的395人，肤色改善者280人，腹部脂肪明显减少者达260人，大脑记忆明显改善者达330人，达到预期满意效果。停服180天反复2人。

女性：服用10天对小儿食欲不振、厌食、肠道炎有改善者392人，服用15天明显改善者396人，服用28天显著改善者391人，服用100天达到正常状态的397人，肤色改善者287人，腹部脂肪明显减少者达275人，大脑记忆明显改善者达379人，停服180天食欲不振反复2人，达到预期满意效果。

实施例11

胃癌细胞抑制生长试验（MGC---803细胞株）

注：按0.5%的加入量直接将0.5克本发明生产的载体菌加入到100毫升含有癌细胞的培养液中，37℃厌氧培养36小时，72小时，得出以上结果，并且按以上操作重复做了24批次，得出相同效果。

实施例12

结肠癌细胞抑制生长试验（MC---38细胞株）

注：按0.5%的加入量直接将0.5克本公司生产的载体菌加入到100毫升含有癌细胞的培养液中，37℃厌氧培养36小时，72小时，得出以上结果，并且按以上操作重复做了31批次，得出相同效果。

实施例13

畜禽试验结果：太湖猪（增重效果）

其中：在猪的全价饲料中添加0.15%的载体菌粉，饲喂60天达到的效果。

实施例14

畜禽试验结果：罗曼肉鸡（增重效果）

其中，在鸡的全价饲料中添加0.1%的载体菌粉，饲喂40天达到的效果。

实施例15

畜禽试验结果：海兰蛋鸡（产蛋率）

组别	数量	12个月试验期	外观
				实验组	2000只	平均每只产蛋330枚	蛋壳厚、蛋黄红、蛋清稠
对照组	2000只	平均每只产蛋285枚	蛋壳薄、蛋黄白、蛋清稀

其中，在蛋鸡的全价饲料中加入0.1%的载体菌粉，自由采食达到以上效果。

实施例16

美国八号果蔬试验

组别	数量	试验期为2年，2个产果期	腐烂果	含糖量
					实验组	200棵	第1年产果1.5万公斤，第2年产果1.55万公斤	第1年烂果80公斤，第2年烂果95公斤	14.5%
对照组	200棵	第1年产果1.4万公斤，第2年产果1.35万公斤	第1年烂果135公斤，第2年烂果117公斤	12．1%

其中，在水中加入0.25%的载体菌粉，花期喷洒1次，坐果期喷1次，灌根1次，达到以上效果。

实施例17

黄瓜果树试验：爱丰品种

组别	数量	试验期1年	试验期白粉病	单瓜重	腐烂
						实验组	亩3500株	产量6700公斤	白粉病245株	220克	63公斤
对照组	亩3500株	产量5900公斤	白粉病495株	190克	115公斤

其中，在水中加入0.3%的载体菌粉花期喷洒1次，果期喷洒1次，果期灌根1次，达到以上效果。

实施例18

茄子果蔬试验：京茄10号

其中，在水中加入0.3%的载体菌粉花期喷洒1次，初果期喷洒1次，灌根1次，达到以上效果。

Claims (14)

1.一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的步骤包括：制备扩大菌种液和一级种子培养液得到一级菌种液，再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐菌种，再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵液，当发酵完毕后，进行发酵液离心，得到湿菌泥，其中湿菌泥即为双歧杆菌乳酸菌的混合发酵菌泥；其中所述的扩大菌种液制备包括酶解法制备试管培养基和接种两部分；其中所述的一级种子培养液制备包括酶解法制备一级种子培养液；所述的种子培养基的制备包括酶解法制备种子培养基；所述的发酵罐培养基的制备包括酶解法制备发酵罐培养基。

2.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的扩大菌种液的制备包括以下步骤：

酶解法制备试管培养基：将10g核桃仁、10g花生仁、5克酪蛋白酸钠、0.1克无水氯化钙不分前后顺序投入到300ml水中进行研磨并打成浆状过滤得到浆液，再在浆液中加入700ml水并进行加热至53℃~57℃并进行搅拌，在搅拌中加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入3gL-精氨酸、3g番茄粉、6g牛肉膏、2g酵母浸粉、5g蛋白胨、0.1g柠檬酸铵、0.6g丝氨酸、3g氯化钠、5g乳糖、8g葡萄糖、8g乙酸钠、3.2g磷酸氢二钾进行搅拌溶解后分装于试管中，每支试管中分装20ml，将所述多个试管放入医用消毒器中，采用0.1~0.14Mpa灭菌20分钟后得到试管培养基；

接种：在无菌条件下，打开冻干管菌种，其中冻干管菌种包括：双歧杆菌（菌号：CGTMCC—1.2212，中国普通微生物菌种保藏管理中心），

短双歧杆菌（菌号：CGTMCC—1.2213，中国普通微生物菌种保藏管理中心），婴儿双岐杆菌（菌号：CGTMCC—1.2202，中国普通微生物菌种保藏管理中心），鼠李糖乳杆菌（菌号：CICC—6065，中国工业微生物菌种保藏管理中心），将所述的4株菌种内分别加入以上灭菌的试管培养基1ml，摇动溶化后得到冻干管菌悬液备用，再将所述的4支冻干管菌悬液分别各取1ml加入至4支试管培养基中进行密封后放摇瓶机摇动制得扩大菌种液。

3.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的一级种子培养基培养中各组分为：

核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸钠10克、L—精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵母浸粉3克、蛋白胨3克、柠檬酸胺0.15克、丝氨酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化钠3克、乳糖10克、葡萄糖15克、乙酸钠6克、无水氯化钙0.1克、磷酸氢二钾2克、50万单位脂肪酶10克、10万单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自然；

将所述一级种子培养基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、无水氯化钙加入所述600毫升的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后再所得浆液中加入400毫升水并加热到53℃~57℃并进行搅拌，在搅拌下加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入其他原料，进行搅拌熔化得到一级种子培养液；

将所述的一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超净工作台中降温，当温度降到31℃~37℃，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中，即100ml一级种子培养液接入的扩大菌种液为4ml，完毕后放摇瓶机中，得到一级菌种液。

4.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的种子罐培养包括以下步骤：

将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理；

其中种子罐培养基中各组分的重量比为：

核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸钠0.2%、L—精氨酸0.3%、番茄粉0.2%、牛肉膏0.4%、蛋白胨0.2%、丁酸钙0.5%、柠檬酸胺0.02%、丝氨酸0.04%、葡萄糖酸0.5%、氯化钠0.3%、乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸钠0.3%、无水氯化钙0.03%、可溶性淀粉0.3%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、磷酸氢二钾0.2%、聚醚消泡剂0.01%、自来水90%，PH自然；

将所述的种子罐培养基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙加入20公斤的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后将浆液加热到53℃~57℃进行搅拌，在搅拌中加入脂肪酶进行酶解，再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液、剩余量的水和原料不分先后顺序的投入种子罐并进行搅拌，然后经过高温灭菌及降温处理后，将所述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，接种量分别是罐内种子培养基的2%，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液。

5.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的发酵液制备包括以下步骤：

将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理；

发酵罐培养：

种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为：

核桃仁2.5%、花生仁2.5%、酪蛋白酸钠0.3%、L—精氨酸0.3%、磷酸氢二钾0.2%、番茄粉0.2%、卷心菜粉0.1%、牛肉膏0.5%、酵母浸粉0.2%、蛋白胨1%、丁酸钙0.5%、快速渗透剂T0.2%、柠檬酸胺0.2%、丝氨酸0.1%、葡萄糖酸0.6%、氯化钠0.3%、乳糖2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.7%、可溶性淀粉0.2%、无水氯化钙0.1%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、聚醚消泡剂0.1%、自来水83.2%，PH自然；

制备发酵罐培养基：首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐中，然后开动搅拌机，向搅拌罐中加入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶和无水氯化钙进行搅拌并过滤收集浆液，将浆液加热至53℃~57℃后在搅拌下加入脂肪酶进行酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液和余量的水投入至灭菌的发酵罐并加入余量的原料进行搅拌，经过高温灭菌及降温处理后，得到发酵罐培养基；

制备诱导液：将丁酸钙、快速渗透剂T、乳糖放至20kg中的自来水中进行搅拌溶化后得到诱导液；

接种：通过差压法将种子罐菌种送至发酵罐中，将所述发酵罐培养基接入种子罐菌中，其中接种量是每100kg发酵罐培养基接入种子罐菌种8kg，并在接种过程中加入诱导液进行诱导，得到发酵液；

收集湿菌泥：开动管式离心机，调整转速8000转/分钟，以每分钟进料20公斤的进料速度进行例行，弃上清，收集湿菌泥，然后进行二次离心，转速为13000/分钟，弃上清，收集湿菌泥。

6.根据权利要求2所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，其中所述扩大菌种液是在31-37℃的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中摇动24~30小时制得。

7.根据权利要求3所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，其中所述一级菌种液是在31-37℃的温度下，采用摇瓶机在150-210转/每分钟的转速下，摇动12-28小时制得。

8.根据权利要求4所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，其中所述通过无菌通风培养制得种子罐菌种液的过程中，无菌空气用量为每100公斤种子培养基每分钟用无菌空气0.05立方，PH值自然，搅拌速度80-180转/每分钟，罐压0.05兆帕，温度31-37℃，培养时间20~24小时。

9.根据权利要求5所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的发酵培养的培养条件为：温度31-37℃、80-140转/每分钟，通风量每100公斤培养液每分钟通入氮气0.1立方米，通入时间为3小时，PH值自然，发酵时间为30-40小时结束。

10.根据权利要求2或3所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的制备试管培养基过程中的酶解液和制备一级种子培养液过程中的酶解液的制备是通过过滤后的浆液中加入50万单位的脂肪酶10g酶解10~30分钟，再加入10万单位的无花果酶10g酶解20~70分钟得到。

11.根据权利要求4或5所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的制备种子培养基过程中酶解液和制备发酵罐培养基过程中酶解液的制备是通过过滤后浆液中加入50万单位的脂肪1000g，酶解10~40分钟，再加入10万单位的无花果酶1000g，酶解20~70分钟得到。

12.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的步骤中还包括湿菌泥的冷冻干燥，其中冷冻干燥还包括悬菌液的制备和真空干燥，其中悬菌液的制备包括取湿菌泥并加入无菌蒸馏水加热至60~65℃，并搅拌并加入麦芽糊精，溶化后再加入水、脱脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40℃的条件下搅拌1~2小时，得到悬菌液，然后将悬菌液放入恒温室中恒温60分钟进行预冻；

其中真空干燥步骤为将预冻好的料盘放入真空干燥室进行抽真空干燥，并且干燥条件为真空度为10~15pa，温度为-50℃，干燥室温度为32℃，干燥时间为55小时，冻干完毕后收集冻干料。

13.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在于，所述的混合发酵菌的形式包括囊剂、粉剂、片剂、膏剂、液体、奶制品，所述的粉剂包括用无菌粉碎机将冻干料粉碎成细度为80目的粉菌；所述的囊剂的复配包括将冻干料粉碎成细度为80目的菌粉10g，与代谢物干燥粉15g、微晶纤维素20g、硅胶粉20g、乳糖10g，硬脂酸镁15g、L-谷氨酰胺10g放入固体搅拌混合机中混合均匀，在无菌条件下分装入胶囊；所述的膏剂包括粉菌进行低温浓缩后的膏状物。

14.一种利用权利要求1~12的工艺制备的双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌的运用，其特征在于，所述的双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌可以运用在农作物的培育中，将双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌按1:3000倍稀释后喷施在黄瓜、茄子的开花到收获的生长过程；可将双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌按1:5000倍的稀释后浇灌于果树的根本。