CN108277178B - 一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法以及菌粉包埋方法 - Google Patents
一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法以及菌粉包埋方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法；所述发酵培养基为：玉米浆干粉0.3‑1.5％，大豆蛋白胨0‑1.8％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3‑1.5％，牛肉膏0‑1％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％；所述发酵方法包括菌种活化培养、一级菌种培养、二级种子液制备、车间200L小罐培养和车间1T大罐发酵培养。本发明提供的培养基组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％，且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产需求。所述菌种包埋技术，大大提高菌种耐受人体及外界环境的能力。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品制备技术领域，涉及一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法。
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效，从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。人体肠道中栖息着数量巨大的微生物群，它们的构成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育及营养与药物的代谢。乳酸菌作为益生菌的主要类别之一，在维持肠道菌群平衡、降低胆固醇、减少内毒素、促进人体正常生理功能等方面发挥重要作用，因此各种乳酸菌制品风靡全世界。人体肠道中栖息着数量巨大的微生物群，它们的构成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育及营养与药物的代谢。目前可用于食品中的益生菌种类主要有：双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、明串球菌属、片球菌属、芽孢杆菌属，其中双歧杆菌属及乳杆菌属为其中的主要种类，亦是人体中维护机体健康的正常菌群之一。
由于工艺流程等差别，实验室成果不能反应生产的实际情况，实验室研究很难对大型工业设备中出现的许多问题作充分的考虑。在连续运转的工业生产上，如何保证设备的稳定、工艺的重现性、降低工艺成本、解决实验室中所不能解决和发现的问题，是工业化大生产中必然面对的问题。目前乳酸杆菌类常用的培养主要为MRS培养基，双歧杆菌类常用为TPY培养基，但这两种培养基成本较高，很多原料购买渠道窄，且活菌数相对较低，尤其是TPY培养基，为了降低成本提高活菌数，研究人员进行了一系列培养基优化，如添加具有双歧增长因子的物质，如番茄汁、菊芋汁、胡萝卜汁等，虽然达到了一定的提高活菌数的目的，但此类培养基配制步骤繁琐，促生长因子的价格因季节变化较大，成本较高，不适宜于工业化生产的需求。所以在生产制备菌体过程中，廉价经济的培养基显的格外重要。
益生菌在生产、销售贮藏以及进入宿主的胃肠道的过程中，需经受一系列外在及人体不良环境因素的影响，致使定植于肠道的益生菌活菌数大大降低，从而限制了其生理作用的发挥。如何有效提高益生菌在生产、贮藏、销售以及在宿主消化道内逆环境的抵抗力，成为国内外研究的热点。其中筛选抗性菌株，添加保护剂和包埋都比较有效，然而研究最多的还是微胶囊包埋技术。微胶囊技术 (microencapsulation)是一种利用天然或合成的高分子成膜材料把分散均匀的固体微粒、液体或气体包覆形成微小固体颗粒的技术，其中，被微胶囊包埋在内部的物质称为芯材，包埋芯材实现微囊胶化的物质称为壁材。利用微胶囊包埋技术，将芯材与外界不利环境隔离，使其免受不利环境的影响，进而保持芯材物质的稳定性。将益生菌包埋于微胶囊微球中，不仅可增强菌株对光线、温度、氧气等不良外界环境因素的抵抗能力，提高其在加工及贮藏中的稳定性，而且能显著提高益生菌在胃酸环境中的存活率，因此微胶囊包埋效果在益生菌领域的应用越来越受到人们的关注。微囊化可以保护益生菌免受不利环境因素的影响，但在食品加工中，所用的微囊化载体材料都要求是食品级以上。
发明内容
为解决目前益生菌共培养中培养基成本较高、工业化生产方法复杂及菌粉体外存活率低等问题，同时提高工业化生产中乳酸菌的活菌数，本发明提供了一种直投式双歧杆菌和乳酸杆菌的高密度混合发酵培养基、发酵培养方法和大生产发酵方法，通过筛选优化不同的培养基及培养方式，同时采取一些简单实用的代谢调控手段等综合措施，使培养液中乳酸菌的密度达到1010cfu/ml。本发明所涉及工业化生产组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％左右，而且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产的需求。同时本发明还提供了一种提高菌粉稳定性的菌种包埋技术，通过包埋之后的菌粉大大提高了其耐受人体环境及外界环境的存活能力。
本发明的技术方案如下：
一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基，所述发酵培养基的成分及质量分数为：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％， L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％， L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。
本发明还提供了一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化培养：
分别将MRS及TPY斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌 15-30min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有乳酸杆菌、双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置2-3h，然后在无菌操作台中用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将乳酸杆菌接种于MRS斜面培养基、将双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于 30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次；
步骤二，一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的乳酸杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的双歧杆菌菌种接种于200ml的 TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用食用油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤三，二级种子液制备：
分别取步骤二制得的含乳酸杆菌的MRS培养液和含双歧杆菌的TPY培养液，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比1:1混合后，接种到二级种子培养基SQ1 培养基中，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液混合液占二级种子培养基体积比为 3-4％；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
所述二级种子培养基SQ1培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉 0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾 0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得；
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2-8％的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1 培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐。
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2-3％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接SQ1培养基或者大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，30-37℃培养12-16h，每2h镜检菌体形态，于6h补料1-2％(与发酵液的重量比)葡萄糖和0.5-1％的玉米浆干粉(与发酵液的重量比)一次，发酵期间控制pH值稳定在6.0-6.5。发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，于0～8℃转速8000～10000rpm离心2～2.5h，获取菌泥；
所述1T大罐培养基SQ2培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得；
补料成分为葡萄糖和玉米浆干粉。
优选的，步骤一和步骤二中所述乳酸杆菌选自植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一株，所述双歧杆菌选自长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的一株；
步骤三中共培养菌株为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的任何一株与长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的任何一株共培养。
优选的，步骤二中所述食用油为大豆油。
优选的，所述步骤三中玉米浆干粉采用玉米浆制备，所述玉米浆干粉的制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代TPY配方中的氮源。
优选的，所述步骤五中补料过程为补充发酵液重量1-2％的葡萄糖和发酵液重量0.5-1％的玉米浆干粉。
优选的，步骤五中将步骤四制得的小罐发酵液转接大罐培养基SQ2培养基中进行大罐发酵培养。
优选的，步骤五中发酵过程中当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH 溶液使培养液的pH值稳定在6.0-6.5，从而解除乳酸的反馈抑制作用。
本发明的目的还在于提供一种复合发酵菌粉的冻干包埋方法，包括以下步骤：
步骤A，制备保护剂，保护剂配方如下：蔗糖2-5％、奶粉5-15％、甘油1-3％、抗坏血酸钠1-3％、硫酸亚铁0.1-0.5％、海藻糖5-8％、谷氨酸钠2-4％、低聚木糖3-6％、甘露糖醇2-5％，混合后，115-121℃灭菌15-30min，将灭菌的保护剂与步骤五中车间1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:(1-3)比例混匀，静置 30-60min，得到菌泥混合液。
其中保护剂中添加对菌体具有保护作用的功能性糖海藻糖和低聚木糖、糖醇甘露糖醇及抗氧化成分抗坏血酸钠。
步骤B，冻干菌泥，将步骤A中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻 2-5h，然后在-50～-40℃、真空冷冻干燥机中真空度20-30pa条件下冷冻干燥 24-48h，制备得到混合冻干菌粉。
步骤C，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为4-6％的抗性淀粉中，200-400rpm下搅拌20min后，得到混合液。
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:(1-2)的比例加入到质量分数为2-3％海藻酸钠和2-4％大豆蛋白混合溶液中，300-600rpm下搅拌15-20min，得混合菌胶。
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:(2-3)的比例加入到含2％span80 和0.2％吐温-80的植物油中，在1000-1500rpm下离心乳化15-20min后快速加入到2-4％的氯化钙溶液中，静置30-60min后，于4℃3000rpm离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9％的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F，冷冻干燥：将制备好的微胶囊于置于冰箱中于-20℃预冻6-8h后，在-50～-40℃、真空度20-30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
优选的，步骤E中所述植物油为大豆油。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供一种双歧杆菌和乳酸杆菌在工业化大生产不同阶段的混合培养和发酵方法、培养基及菌粉包埋技术，同时提供了上述所述不同培养基的配方、包埋成分及其应用。
本发明通过分析比对现用的双歧杆菌和乳酸杆菌配方，通过正交优化、促生长因子优化及车间1T大罐验证，筛选出一套适合双歧杆菌和乳酸杆菌共培养的液体发酵配方及生产流程，并通过采取控制大罐发酵液pH来解除酸抑制作用及优化补料培养基的方案，充分发挥两种乳酸菌的协同作用，降低生产成本，提高设备利用率。
本发明提供的培养基组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％，且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产需求。
对发酵获得的菌泥冻干时在保护剂中添加对菌体具有保护作用的功能性糖、糖醇及抗氧化成分，减少了菌体的死亡率，并通过多层包埋技术，使菌体包埋在对外界环境比较稳定的高分子膜复合物体系中，使其免受不利环境的影响，进而保持菌体的稳定性。
本发明通过密度培养法及菌粉包埋方法，所获得的冻干粉活菌数含量高达 5-6*1011cfu/g，多层包埋后的菌粉具有耐胃酸性、耐胆盐性、肠溶性快、贮藏稳定性良好的优点，制备方法简单，实用性强，便于工业化大生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1不同组方发酵效果验证结果图；
图2玉米浆干粉优化筛选结果图；
图3玉米浆干粉发酵效果验证及配方调整结果图；
图4大生产不同级别培养基筛选验证结果图；
图5微胶囊耐人工胃酸能力曲线图；
图6微胶囊耐人工胆盐能力曲线图；
图7微胶囊肠溶性曲线图；
图8微胶囊保质期活菌数变化曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，应该指出，以下详细说明都是示例性的，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但本发明的内容并非仅限于所举实施例。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
在实施例中，OD值是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通过OD来测定微生物浓度或者数量等生长情况，也就是比浊法，根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，光密度OD值越大，表明微生物浓度越大，微生物数量越大。
通用TPY组方的成分及含量：酪蛋白胨1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母粉0.25％，葡萄糖1.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化镁0.05％，氯化钙0.015％，硫酸锌0.025％，氯化铁0.01％，L-半胱氨酸盐酸盐0.005％，吐温-80 1mL，水1L，调pH至6.5。
MRS及TPY斜面培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
冻干菌泥采用的装置名称和厂家或者方法名称：冻干机厂家为上海富龙科技股份有限公司。
抗性淀粉又称抗酶解淀粉，难消化淀粉，在小肠中不能被酶解，但在人的肠胃道结肠中可以与挥发性脂肪酸起发酵反应。
pH2.5人工胃液的配制方法：取浓度为1mol/ml的稀盐酸，加水稀释，将pH 调至2.5。每100ml液体中加入1g胃蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
0.3％胆盐溶液配制方法：将0.3％的胆盐按重量比加入0.9％的生理盐水中混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
人工肠液配制方法：取KH2PO46.8g加水500ml溶解，用0.4％(w/w)的NaOH 溶液回调pH至6.8。每100ml液体中加入1g胰蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。
正如背景技术所介绍的，目前益生菌共培养中培养基成本较高、工业化生产方法复杂及菌粉体外存活率低，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种直投式双歧杆菌和乳酸杆菌的高密度混合培养和大生产发酵方法，培养基以及菌泥的包埋方法。
实施例1，混合菌株高密度发酵培养基筛选：
1、不同碳氮源对混合菌株发酵活菌数的影响：
根据目前车间、文献中涉及的乳酸杆菌及双歧杆菌配方进行分析，对培养基主要成分葡萄糖、乳糖、低聚果糖、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，进行7因素2水平正交试验，正交出序号1-8种7因素百分比含量结果，依次按照7个因素百分比含量称取序号1-8，再加入基础培养基成分，基础培养基成分为：磷酸氢二钾1.35％，硫酸镁0.02％，吐温0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，调pH6.8-7.0，配制出8种培养基于500mL盐水瓶中，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比 1:1混合后与8种培养基按3-4％的体积比，接种菌株发酵液，发酵结束，测定发酵液OD值，结果如表1所示：
表1不同碳氮源对混合菌株发酵活菌数的影响结果表
在表1中，r值为两个因素水平条件下OD值的平均值的差，r越大相对应因素对实验影响越大，通过比较r值，可以看出大豆蛋白胨、低聚果糖、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉对活菌数影响较大，各因素对双歧杆菌和乳酸杆菌混合菌株发酵的影响大小为：大豆蛋白胨>低聚果糖>牛肉膏>葡萄糖>酵母粉>乳糖>蛋白胨；选取大豆蛋白胨、低聚果糖、牛肉膏在实验中的最大含量，葡萄糖和酵母粉的较小含量，添加乳糖在实验中的加入量，剔除对结果影响小的蛋白胨，得出最佳组方 SQ-ZJ，并在后续试验中对本组方做进一步验证，该组方SQ-ZJ成分为大豆蛋白胨 1.2％，低聚果糖0.5％，牛肉膏0.6％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.5％，乳糖0.5％，蛋白胨0；因葡萄糖为常规碳源，优化后添加量较少，不再进行优化，对其他添加因素进一步优化研究。
2、大豆蛋白胨、低聚果糖、牛肉膏、酵母粉添加量正交试验：
前期筛选出对双歧杆菌和乳酸杆菌混合菌株发酵影响较大的因素大豆蛋白胨、低聚果糖、牛肉膏、酵母粉进行添加量正交试验优化。正交出序号1-9种4 因素百分比含量结果，依次按照4个因素百分比含量称取序号1-9，每个序号成分再加入基础培养基成分，基础培养基成分为：磷酸氢二钾1.35％，硫酸镁0.02％，吐温0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，调pH6.8-7.0，配制出8种培养基于500mL 盐水瓶中，序号1具体组方为：大豆蛋白胨1.2％，牛肉膏0.6％，酵母粉0％，低聚果糖0.5％，磷酸氢二钾1.35％，硫酸镁0.02％，吐温0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，其他序号组方依次类推。乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比1:1混合后与8 种培养基按3-4％的体积比，接种菌株培养液，发酵结束，测定发酵液OD值，结果如表2所示：
表2筛选碳氮源正交优化结果表
| 序号 | 大豆蛋白胨 | 牛肉膏 | 酵母粉 | 低聚果糖 | OD值 |
| 1 | 1(1.2％) | 1(0.6％) | 1(0％) | 1(0.5％) | 1.757 |
| 2 | 1(1.2％) | 2(0.8％) | 2(0.2％) | 2(0.7％) | 1.911 |
| 3 | 1(1.2％) | 3(1.0％) | 3(0.5％) | 3(1％) | 1.841 |
| 4 | 2(1.5％) | 1(0.6％) | 2(0.2％) | 3(1％) | 1.953 |
| 5 | 2(1.5％) | 2(0.8％) | 3(0.5％) | 1(0.5％) | 1.515 |
| 6 | 2(1.5％) | 3(1.0％) | 1(0％) | 2(0.7％) | 1.918 |
| 7 | 3(1.8％) | 1(0.6％) | 3(0.5％) | 2(0.7％) | 1.856 |
| 8 | 3(1.8％) | 2(0.8％) | 1(0％) | 3(1％) | 1.834 |
| 9 | 3(1.8％) | 3(1.0％) | 2(0.2％) | 1(0.5％) | 1.405 |
通过测定OD值，初步确定所需组方，验证结果显示：9个试验方中方4的OD 值最高，发酵最好，将该组方命名为SQ-YH。SQ-YH组方为：大豆蛋白胨1.5％，牛肉膏0.6％，酵母粉0.2％，低聚果糖1％，磷酸氢二钾1.35％，硫酸镁0.02％，吐温0.1％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％。
3、不同组方发酵效果验证：
验证SQ-ZJ、SQ-YH及通用TPY组方对混合菌株发酵效果的影响，测定其OD 值、pH值及活菌数，实验结果如图1所示，通过测定OD值、pH结果看：SQ-ZJ、 SQ-YH方均好于现用TPY组方，且两个优化方之间差异显著，其中SQ-ZJ组方活菌数达25亿/ml，相对TPY而言高3.5倍左右，保留该组方进行下一步验证。
4、玉米浆干粉实验室对混合菌株发酵活菌数的影响：
在SQ-ZJ基础上，分别添加0.3％、0.5％、0.8％、1％、1.5％玉米浆干粉，对各培养基发酵液的活菌数进行测定，筛选组方。结果如图2所示，添加玉米浆干粉能很好的促进混合菌株活菌数的增加，随着玉米浆干粉添加量的增多，活菌数先增加后趋于稳定，玉米浆干粉添加量在0.8-1.5％时，活菌数稳定在33-35亿/ml 左右。
5、玉米浆干粉实验室发酵效果验证及组方调整：
对添加玉米浆干粉后的优化方进行验证，同时进一步优化组方中大豆蛋白胨、牛肉膏、低聚果糖的添加量，以获得成本低、发酵效果好的培养基组方，共设计9个组方，混合菌株发酵后测定各组方活菌数及统计其成本，结果如图3所示。结果显示：方6活菌数最高，达到45亿/ml，其次方7和方9，活菌数都在40亿以上；对比方6、方7、方9成本发现，方7成本最低，为0.345元/L，活菌数为41亿/ml；其次为方6，为0.69元/L，活菌数为45亿/ml。综合成本及活菌数，暂时选用方6、方7进行后续验证，分别命名为SQ1、SQ2。
SQ1方配方如下：玉米浆干粉1％，大豆蛋白胨1.2％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐 0.05％，pH6.8-7.0。
SQ2方配方如下：玉米浆干粉1.5％，牛肉膏0.6％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％， pH6.8-7.0。
实施例2，一种直投式双歧杆菌和乳酸杆菌的高密度混合培养和大生产发酵方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化培养：
分别将MRS及TPY斜面培养基用6mol/L氢氧化钠调节pH值6.5，在121℃下湿热灭菌15min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有植物乳杆菌、长双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置2h，然后在无菌操作台中用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将植物乳杆菌接种于MRS斜面培养基、将长双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于30℃培养48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次。
MRS及TPY培养基为通用培养基。
步骤二，一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的植物乳杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的长双歧杆菌菌种接种于 200ml的TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用食用油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于30℃培养48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用。
其中所述食用油为大豆油。
步骤三，二级种子液制备：
分别取步骤二制得的植物乳杆菌的MRS培养液和含长双歧杆菌的TPY培养液按1:1的体积比混合后混合培养液与二级种子培养基SQ1培养基再按3％的体积比接种到二级种子培养基SQ1培养基中；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下30℃培养24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用。
其中，筛选培养基SQ1各成分及质量分数如下：玉米浆干粉1％，大豆蛋白胨1.2％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。
SQ1方配制方法：取玉米浆干粉10g，大豆蛋白胨12g，低聚果糖2g，葡萄糖 5g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.15g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，加水定容至1000毫升，调节pH6.8-7.0，121℃灭菌15分钟。
所述玉米浆干粉的制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代TPY配方中的氮源，购买于市售产品。
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2％的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1 培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于30℃培养16h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐。
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，30℃培养16h，每2h镜检菌体形态，于6h补料 1％(与发酵液的重量比)葡萄糖和1％的玉米浆干粉(与发酵液的重量比)一次，发酵过程中当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH 值稳定在6.0-6.5。发酵结束后发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速10000rpm离心2h，获取菌泥；
其中，筛选培养基SQ2各组分及质量分数如下：玉米浆干粉1.5％，牛肉膏0.6％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合并加水溶解制得。
SQ2方配制方法：取玉米浆干粉15g，牛肉膏6g，低聚果糖2g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.15g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，加水定容至1000毫升，pH6.8-7.0，121℃灭菌15分钟。
补料成分为葡萄糖和玉米浆干粉，发酵过程中当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH值稳定在6.0-6.5，从而解除乳酸的反馈抑制作用。
在另一个实施例中，步骤一至步骤四与实施例2方法相同，在步骤五中采用 SQ1培养基，即将步骤四制得的小罐发酵液转接大罐培养基SQ1培养基中，其他步骤与实施例2相同，验证两种不同培养基以及现有的TPY培养基作为大罐培养基的发酵结果。实验结果如图4所示。
通过测定1T大罐不同培养基的发酵效果，结果显示，小罐采用SQ1组方时，大罐采用SQ1组方活菌数稍高于SQ2组方，但两者差异不显著；然而均远高于TPY 培养基的活菌数，本发明提供的培养基组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10 倍以上。综合考虑其生产成本，后期大罐生产采用SQ2组方。通过组方优化及生产方法调整，双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵液体活菌数可达1010cfu/ml。
实施例3，一种直投式双歧杆菌和乳酸杆菌的高密度混合培养和大生产发酵方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化培养：
分别将MRS及TPY斜面培养基pH值调节至7.0，在121℃下湿热灭菌30min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置3h，然后在无菌操作台中用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将鼠李糖乳杆菌接种于 MRS斜面培养基、将乳双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于 37℃培养24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次。
步骤二，一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的鼠李糖乳杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的乳双歧杆菌菌种接种于 200ml的TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用大豆油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于37℃培养24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用。
步骤三，二级种子液制备：
分别取步骤二制得的含鼠李糖乳杆菌的MRS培养液和含乳双歧杆菌的TPY 培养液按1:1体积比混合，混合培养液跟二级种子培养基SQ1培养基再按4％的体积比接种到二级种子培养基SQ1培养基中；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下37℃培养18h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用。
其中本实施例中所述二级种子培养基为筛选培养基SQ1，配方与实施例2相同；所述玉米浆干粉与实施例2相同。
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按4％的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1 培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于37℃培养12h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐。
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按3％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，37℃培养12h，每2h镜检菌体形态，于6h补料 3％(与发酵液的重量比)葡萄糖和2％的玉米浆干粉(与发酵液的重量比)一次，发酵过程中当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH 值稳定在6.0-6.5。发酵结束后发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000rpm离心2.5h，获取菌泥；
本实施例中所述1T大罐培养基为筛选培养基SQ2，配方与实施例2相同，所述补料过程与实施例2相同。
实施例4，一种复合发酵菌粉的冻干包埋方法，包括以下步骤：
步骤A，制备保护剂，保护剂配方如下：蔗糖5％、奶粉15％、甘油1％、抗坏血酸钠3％、硫酸亚铁0.5％、海藻糖7.6％、谷氨酸钠2％、低聚木糖6％、甘露糖醇2.7％，115℃灭菌15min，将灭菌的保护剂与实施例2步骤五中车间1T 大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:1比例混匀，静置30min，得到菌泥混合液。
其中保护剂中添加对菌体具有保护作用的功能性糖、糖醇及抗氧化成分。
步骤B，冻干菌泥，将步骤A中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻 2h，然后在-40℃、真空冷冻干燥机中真空度30pa条件下冷冻干燥48h，制备得到混合冻干菌粉。
步骤C，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为4％的抗性淀粉中，200rpm下搅拌20min后，得到混合液。
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:1的比例加入到质量分数为2％海藻酸钠和4％大豆蛋白混合溶液中，300rpm下采用磁力搅拌器搅拌20min，得混合菌胶。
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:2的比例加入到含2％span80和0.2％吐温-80的植物油中，在1000rpm下乳化20min后快速加入到2％的氯化钙溶液中，静置30min后，4℃以3000rpm离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9％的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F，冷冻干燥：将制备好的微胶囊于置于冰箱中于-20℃预冻6h后，在 -50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
实施例5，一种复合发酵菌粉的冻干包埋方法，包括以下步骤：
步骤A，制备保护剂，保护剂配方如下：蔗糖5％、奶粉15％、甘油1％、抗坏血酸钠3％、硫酸亚铁0.5％、海藻糖7.6％、谷氨酸钠2％、低聚木糖6％、甘露糖醇2.7％，混合后于115℃灭菌15min，将灭菌的保护剂与实施例3步骤五中车间1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:1比例混匀，静置60min，得到菌泥混合液。
其中保护剂中添加对菌体具有保护作用的功能性糖、糖醇及抗氧化成分。
步骤B，冻干菌泥，冻干机厂家为上海富龙科技股份有限公司，将步骤A 中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻5h，然后在-40℃、真空冷冻干燥机中真空度20pa条件下冷冻干燥48h，制备得到混合冻干菌粉。
步骤C，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为6％的抗性淀粉中，400rpm下搅拌20min后，得到混合液。
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:2的比例加入到质量分数为3％海藻酸钠和4％大豆蛋白混合溶液中，600rpm下搅拌15min，得混合菌胶。
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:3的比例加入到含2％span80和0.2％吐温-80的植物油中，在1500rpm下离心乳化15min后快速加入到4％的氯化钙溶液中，静置60min后，于4℃以3000rpm速度离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9％的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F，冷冻干燥：将制备好的微胶囊于置于冰箱中于-20℃预冻8h后，在 -50℃、真空度20pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
在另一个典型实施例中，所述步骤A中保护剂的配方如下：蔗糖2％、奶粉 5％、甘油3％、抗坏血酸钠1％、硫酸亚铁0.1％、海藻糖5％、谷氨酸钠4％、低聚木糖3％、甘露糖醇5％，将以上成分混合后于121℃灭菌30min，将灭菌的保护剂与实施例3步骤五中车间1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:3比例混匀，静置60min，得到菌泥混合液。
步骤B中，将步骤A中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻2h，然后在-40℃、真空冷冻干燥机中真空度30pa条件下冷冻干燥48h，制备得到混合冻干菌粉。
步骤C中，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为 4％的抗性淀粉中，200rpm下搅拌20min后，得到混合液。
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:1的比例加入到质量分数为3％海藻酸钠和4％大豆蛋白混合溶液中，300rpm下搅拌20min，得混合菌胶。
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:2的比例加入到含2％span80和0.2％吐温-80的植物油中，在1000rpm下离心乳化20min后快速加入到2％的氯化钙溶液中，静置30min后，于4℃以3000rpm速度离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9％的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F中，将步骤E制备好的微胶囊于置于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
实施例6，包埋稳定性验证：
1、耐胃酸性
将实施例4制得的微胶囊1g置于9mL的人工胃液中，人工胃液pH值为2.5，于37℃厌氧处理，分别于0、1、2、3h采用梯度稀释法进行活菌计数，以实施例4制得的未经包埋的冻干菌粉进行对照，分析两者对人工胃液的耐受性差异。实验结果如图5所示，可见，当处于pH2.5的人工胃液中时，冻干粉和微胶囊随着时间的延长，活菌数逐渐下降，但微胶囊的活菌数要比冻干粉下降缓慢。
2、耐胆盐性
配制质量分数0.3％的胆盐溶液模拟人工胆盐，将实施例4制得的1g微胶囊置于9mL的胆盐溶液中，37℃厌氧处理，分别于0、1、2、3h采用梯度稀释法进行活菌计数，以实施例4制得的未经包埋的冻干菌粉进行对照，分析两者对人工胆盐的耐受性差异。实验结果如图6所示，可见，当胆盐浓度为0.3％时，处理3h后，冻干粉的存活率仅有15％，但微胶囊菌粉的存活率为40％，显著高于冻干菌粉的存活率。可见混合菌株菌粉经微胶囊化后，可以提高菌体对高浓度胆盐的耐受程度。
3、肠溶性
将实施例5制得的1g微胶囊置于9mL的人工肠液，37℃震荡处理1h，每10min 进行一次活菌梯度计数，分析微胶囊在人工肠液中的肠溶情况。实验结果如图7 所示，微胶囊在人工肠液中处理10min后开始迅速释放菌体，40min后基本保持不变，释放率可达84.5％，可断定该微胶囊在人工肠液中已基本崩解完全，说明该方法制得的微胶囊具有较好的肠溶性，能够使活菌较快的从海藻酸钠体系中释放出来，从而发挥益生功能。
4、常温贮藏特性：
将实施例4制备的冻干菌粉和微胶囊在恒温37℃、相对湿度为10-20％的条件下储存2个月，每10d取样一次进行梯度计数，研究菌体在此过程中的存活情况。实验结果如图8所示，冻干粉在30d时活菌数下降2个数量级，60d后下降4个数量级，但活菌数依旧大于107cfu/g；微胶囊菌粉在存放30d后活菌数下降1个数量级，存放60d后活菌数下降3个数量级，活菌数大于108cfu/g，说明菌粉经过包埋后活菌数下降速度显著减慢，由于存放温度较高，对菌粉的损失率影响较大，在低温条件下菌粉更为稳定。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化培养：
分别将MRS及TPY斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有乳酸杆菌、双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置2-3h，然后在无菌操作台中用75%的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将乳酸杆菌接种于MRS斜面培养基、将双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次；
步骤二，一级菌种培养：
在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的乳酸杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的双歧杆菌菌种接种于200ml的TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用食用油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
步骤三，二级种子液制备：
分别取步骤二制得的含乳酸杆菌的MRS培养液和含双歧杆菌的TPY培养液，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比1:（1~2）混合后，接种到二级种子培养基SQ1培养基中，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液混合液占二级种子培养基体积比为3-4%；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；
所述二级种子培养基SQ1培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5%，大豆蛋白胨0-1.8%，低聚果糖0-1%，葡萄糖0.5-1%，磷酸氢二钾0.4-1.35%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.015-0.02%，L-半胱氨酸盐酸盐0.05%，将以上组分混合后加水溶解制得；
步骤四，车间200L小罐培养：
取步骤三制得的二级种子液，按2-8%的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；
步骤五，车间1T大罐发酵培养：
按2-3%的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接到SQ1培养基或者大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，30-37℃培养12-16h，每2h镜检菌体形态，于6h补充发酵液重量1-2%的葡萄糖和0.5-1%的玉米浆干粉一次，发酵期间控制pH值稳定在6.0-6.5；发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2~2.5h，获取菌泥；
所述1T大罐培养基SQ2培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5%，牛肉膏0-1%，低聚果糖0-1%，葡萄糖0.5-1%，磷酸氢二钾0.4-1.35%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.015-0.02%，L-半胱氨酸盐酸盐0.05%，将以上组分混合后加水溶解制得；
补料成分为葡萄糖和玉米浆干粉；
步骤一和步骤二中所述乳酸杆菌选自植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的一种，所述双歧杆菌选自长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的一种；
步骤三中共培养菌株为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌中的任何一种与长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的任何一种共培养。
2.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，步骤二中所述食用油为大豆油。
3.根据权利要求2所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，所述步骤三中玉米浆干粉采用玉米制备，所述玉米浆干粉的制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉。
4.根据权利要求3所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，步骤五中将步骤四制得的小罐发酵液转接到大罐培养基SQ2培养基中进行大罐发酵培养。
5.根据权利要求4所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，步骤五中发酵过程中当培养液的pH值降至6.0时，流加6mol/L NaOH溶液使培养液的pH值稳定在6.0-6.5。
6.一种复合发酵菌粉的冻干包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，制备保护剂，保护剂配方如下：蔗糖2-5%、奶粉5-15%、甘油1-3%、抗坏血酸钠1-3%、硫酸亚铁0.1-0.5%、海藻糖5-8%、谷氨酸钠2-4%、低聚木糖3-6%、甘露糖醇2-5%，混合后，115-121℃灭菌15-30min，将灭菌的保护剂与权利要求1~5任一项步骤五中车间1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:（1~3）比例混匀，静置30-60min，得到菌泥混合液；
步骤B，冻干菌泥，将步骤A中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻2-5h，然后在-50～-40℃、真空冷冻干燥机中真空度20-30pa条件下冷冻干燥24-48h，制备得到混合冻干菌粉；
步骤C，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为4-6%的抗性淀粉中，200-400rpm下搅拌20min后，得到混合液；
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:（1~2）的比例加入到质量分数为2-3%海藻酸钠和2-4%大豆蛋白混合溶液中，300-600rpm下搅拌15-20min，得混合菌胶；
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:（2~3）的比例加入到含1-2% span80和0.2-0.5%吐温-80的植物油中，在1000-1500rpm下离心乳化15-20min后快速加入到2-4%的氯化钙溶液中，静置30-60min后，于4℃以3000rpm速度离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9%的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F，冷冻干燥：将制备好的微胶囊置于冰箱中，于-20℃预冻6-8h后，在-50～-40℃、真空度20-30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
7.根据权利要求6所述的一种复合发酵菌粉的冻干包埋方法，包括以下步骤：
步骤A，制备保护剂，保护剂配方如下：蔗糖5%、奶粉15%、甘油1%、抗坏血酸钠3%、硫酸亚铁0.5%、海藻糖7.6%、谷氨酸钠2%、低聚木糖6%和甘露糖醇2.7%，混合后，115℃灭菌15min，将灭菌的保护剂与权利要求1~5任一项中步骤五中车间1T大罐发酵培养得到的菌泥按重量1:1比例混匀，静置30min，得到菌泥混合液；
步骤B，冻干菌泥，将步骤A中所得到的菌泥混合液，在-20℃条件下预冻2h，然后在-40℃、真空冷冻干燥机中真空度30pa条件下冷冻干燥48h，制备得到混合冻干菌粉；
步骤C，将步骤B中的获得的混合冻干菌粉，称取1g加入到质量分数为4%的抗性淀粉中，200rpm下搅拌20min后，得到混合液；
步骤D，将步骤C得到的混合液，按1:1的比例加入到质量分数为3%海藻酸钠和4%大豆蛋白混合溶液中，300rpm下搅拌20min，得混合菌胶；
步骤E，将步骤D得到的混合菌胶按1:2的比例加入到含2% span80和0.2%吐温-80的大豆油中，在1000rpm下离心乳化20min后快速加入到4%的氯化钙溶液中，静置30min后，于4℃以3000rpm速度离心10min得微胶囊，用质量分数为0.9%的无菌生理盐水洗涤，被洗涤物与生理盐水重量比为1:9；
步骤F，冷冻干燥：将制备好的微胶囊于置于冰箱中于-20℃预冻6h后，在-50℃、真空度30pa真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后获得终产品。
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