CN111534435B - 一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌冻干存活率和耐酸性的冻干保护剂，此冻干保护剂的成分包含成分A和成分B，其中，成分A为海藻酸钠、酪蛋白酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种或一种以上，成分B为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖醇或棉子糖中的一种或一种以上；使用此冻干保护剂制备双歧杆菌冻干粉时，双歧杆菌的冻干存活率高达65.68％，并且，将使用此冻干保护剂制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达36.92％。
Description
技术领域
本发明涉及一种可提高双歧杆菌耐酸性的冻干保护剂及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
双歧杆菌是人和动物肠道中重要的益生菌，具有抑制致病菌生长、调节肠道微生态平衡、增强营养、提高免疫力、抗肿瘤和延缓衰老等重要的生理功能。然而，双歧杆菌专性厌氧，对氧气、pH、温度、湿度等外界不良环境因素极为敏感，并且，双歧杆菌多不能抵抗人体胃部的低pH(人体胃部的pH值大约是1.8～3.0)，人服用双歧杆菌后，难以保证有足够多的活菌能够到达人体肠道而发挥其益生作用(人体小肠的pH值大约是6.8)。
微胶囊包埋技术可以一定程度上阻隔外界逆环境对双歧杆菌的伤害，对双歧杆菌菌体起到保护作用。目前，常见的微胶囊包埋技术主要有挤压法、乳化法与喷雾干燥法三种。其中，挤压法通常是先将胶体与双歧杆菌菌悬液混合，得到混合液，然后将混合液通过针孔或喷嘴挤出，以液滴形式滴入固化剂，得到双歧杆菌微胶囊。这种微胶囊包埋方法包埋效率低且制得的包埋产物粒径过大，不适用于大规模工业化生产。
乳化法主要是先将双歧杆菌菌悬液与包埋材料混合，得到混合液，然后将混合液注入油相并添加相应的乳化剂，搅拌形成乳液，最后在乳液中添加相应的固化剂，得到双歧杆菌微胶囊。与挤压法相比，乳化法包埋效率更高且包埋产物颗粒更小，但是，乳化法存在浪费油相的问题，并且，与挤压法相比，乳化法制得的包埋产物含水量高、不便贮藏。
除此以外，挤压法和乳化法由于工序较多，其包埋过程中双歧杆菌暴露于有氧环境过长，易引起菌体失活。
喷雾干燥法主要是先将双歧杆菌菌悬液与保护材料混合，得到混合液，然后将混合液进行喷雾干燥，得到双歧杆菌微胶囊。与乳化法相比，喷雾干燥法解决了包埋产物的贮藏问题，并且，喷雾干燥法的工艺更简单，但是，在喷雾干燥的过程中，双歧杆菌会受到高温影响，将会产生极大的活性损失。
因此，急需找到一种制备工艺简单，制备得到的双歧杆菌制剂耐酸、耐贮藏，且制备得到的双歧杆菌制剂中双歧杆菌存活率高的制备双歧杆菌制剂的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种制备工艺简单，制备得到的双歧杆菌制剂耐酸、耐贮藏，且制备得到的双歧杆菌制剂中双歧杆菌存活率高的制备双歧杆菌制剂的方法。
[技术方案]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂的成分包含成分A和成分B；所述成分A为海藻酸钠、酪蛋白酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种或一种以上；所述成分B为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖醇或棉子糖中的一种或一种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包含成分A 10g/L～150g/L和成分B100g/L～200g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包含成分A 10g/L和成分B200g/L
本发明还提供了一种制备双歧杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法为使用上述冻干保护剂制备双歧杆菌冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将双歧杆菌培养液离心，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水或缓冲液中，得到重悬液；将重悬液与上述冻干保护剂混合，得到混合液；将混合液进行真空冷冻干燥，得到双歧杆菌冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为1～2:1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为1:1。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为1～2:3～7。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为2:5。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液的pH为6.0～6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述重悬液的pH为6.5。
在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥在冷冻干燥机内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4～6h；所述一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持20～30h；所述二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持10～20h。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌包括两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及动物双歧杆菌。
本发明还提供了一种双歧杆菌冻干粉，所述双歧杆菌冻干粉是使用上述方法制备得到的。
本发明还提供了上述冻干保护剂或上述方法在冻干双歧杆菌中的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌冻干存活率和耐酸性的冻干保护剂，此冻干保护剂的成分包含成分A和成分B，其中，成分A为海藻酸钠、酪蛋白酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种或一种以上，成分B为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖醇或棉子糖中的一种或一种以上；使用此冻干保护剂制备双歧杆菌冻干粉时，双歧杆菌的冻干存活率高达65.68％，并且，将使用此冻干保护剂制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达36.92％。
(2)本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌冻干存活率和耐酸性的制备青春双歧杆菌冻干粉的方法，此方法为使用成分包含成分A和成分B的冻干保护剂制备双歧杆菌冻干粉，其中，成分A为海藻酸钠、酪蛋白酸钠或羧甲基纤维素钠中的一种或一种以上，成分B为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖醇或棉子糖中的一种或一种以上；使用此方法制备双歧杆菌冻干粉时，双歧杆菌的冻干存活率高达65.68％，将使用此方法制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达36.92％，使用此方法制备得到的双歧杆菌冻干粉含水量低，耐贮藏，并且，使用此方法制备双歧杆菌冻干粉时，制备工艺十分简单。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的鼠李糖、海藻酸钠、酪蛋白酸钠、羧甲基纤维素钠、碳酸钙、氯化钠、阿拉伯糖、棉子糖、山梨糖醇、甘露糖、山梨糖醇、木糖购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的胃蛋白酶购自上海生工生物工程股份有限公司；下述实施例中涉及的两歧双歧杆菌记载于公开号为CN106834187A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCCNO.13632；下述实施例中涉及的青春双歧杆菌记载于公开号为CN110331118A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No:60706；下述实施例中涉及的短双歧杆菌记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC No.11828；下述实施例中涉及的长双歧杆菌记载于公开号为CN107893044A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC NO.15032；下述实施例中涉及的婴儿双歧杆菌记载于公开号为CN109055269A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60387；下述实施例中涉及的假小链双歧杆菌记载于公开号为CN106148230A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC No.12603。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS-L固体培养基：酵母粉5g/L、无水乙酸钠5g/L、牛肉膏10g/L、无水葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、七水合硫酸镁0.1g/L、三水合磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、吐温-801g/L、琼脂20g/L、半胱氨酸盐酸盐1g/L。
MRS-L液体培养基：酵母粉5g/L、无水乙酸钠5g/L、牛肉膏10g/L、无水葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、七水合硫酸镁0.1g/L、三水合磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、吐温-801g/L、半胱氨酸盐酸盐1g/L。
CYS缓冲液：L-半胱氨酸磷酸盐0.5g/L、磷酸氢二钠6.0g/L、磷酸二氢钾4.5g/L、氯化钠4.0g/L、吐温800.6g/L、pH6.8～7.0。
模拟胃液：胃蛋白酶3.2g/L、氯化钠2g/L，pH3.0。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
双歧杆菌活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
双歧杆菌冻干存活率的检测方法：在真空冷冻干燥前测定混合液中双歧杆菌活菌数作为为冻干前活菌浓度，在真空冷冻干燥后，将两歧双歧杆菌冻干粉用无菌水复溶至真空冷冻干燥前体积，得到复溶液，测定复溶液中双歧杆菌活菌数作为冻干后活菌浓度，根据测定结果计算双歧杆菌冻干存活率，计算公式如下：
双歧杆菌经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率的检测方法：称取冻干菌粉0.01g，加入1mL无菌生理盐水复溶，得到复溶液，测定复溶液中双歧杆菌活菌数作为0.01g冻干菌粉酸处理前总活菌数；称取双歧杆菌冻干粉0.01g加入10mL模拟胃液中，37℃严格厌氧条件下培养2h后取样，测定样本中双歧杆菌活菌数作为0.01g冻干菌粉酸处理后总活菌数，根据测定结果计算双歧杆菌经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率，计算公式如下：
实施例1：两歧双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
方案一：按照表1的配方配置冻干保护剂1～7；用接种环蘸取保菌管中的两歧双歧杆菌菌液在MRS-L固体培养基上划线，于37℃恒温培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS-L液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到种子液；将种子液按4％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS-L液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到菌液；将菌液8000g下离心20min，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水中，得到重悬液；以重悬液作为空白对照，将重悬液的pH调节至6.5后(通过质量体积分数为3％的NaOH溶液调节pH)将重悬液分别与冻干保护剂1～7混合，得到混合液1～7；将混合液1～7进行冷冻干燥，得到两歧双歧杆菌冻干粉1～7；其中，菌泥与生理盐水的质量比为1:1；重悬液与冻干保护剂的体积比为2:5；冷冻干燥在冷冻干燥机(购自西班牙泰事达公司)内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。
方案二：用接种环蘸取保菌管中的两歧双歧杆菌菌液在MRS-L固体培养基上划线，于37℃恒温培养24h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS-L液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到种子液；将种子液按4％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS-L液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到菌液；将菌液8000g下离心20min，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水中，得到重悬液；将重悬液的pH调节至6.5后(通过质量体积分数为3％的NaOH溶液调节pH)将重悬液分别与冻干保护剂2混合，得到混合液A；先在混合液A中加入碳酸钙使碳酸钙与混合液A中海藻酸钠的质量比为2:1，然后在混合液A中加入大豆油使混合液A与大豆油的体积比为1:2，500rpm搅拌15min，得到混合液B；在混合液B中加入大豆油(含冰醋酸，冰醋酸与混合液B中碳酸钙的摩尔比为2:1)使混合液B中所含的混合液A与大豆油的终体积比为1:3，500rpm搅拌30min，得到混合液C；在混合液C中加入浓度为0.02mol/L的醋酸盐缓冲溶液(pH5.5)至终浓度为0.01mol/L，500rpm搅拌5min，得到混合液D；将混合液D冰浴静置30min，待微胶囊沉降后，500g离心3min，收集沉淀；将沉淀用生理盐水洗涤后，得到两歧双歧杆菌微胶囊；其中，菌泥与生理盐水的质量比为1:1；重悬液与冻干保护剂2的体积比为2:5。
检测两歧双歧杆菌冻干粉1～7和两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的活菌数，并且，计算两歧双歧杆菌冻干粉1～7和两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表2)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的两歧双歧杆菌冻干粉1～7和两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的两歧双歧杆菌冻干粉1～7和两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的存活率(检测结果见表2)。
由表1-2可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的两歧双歧杆菌冻干粉中两歧双歧杆菌的冻干存活率高达65.68±1.26％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达36.92±1.34％；而制备两歧双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了鼠李糖，但两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的冻干存活率仅有10.95±1.56％，并且，将两歧双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有12.82±2.34％。
表1冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 鼠李糖100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+鼠李糖100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+鼠李糖100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+鼠李糖100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表2两歧双歧杆菌冻干粉1～7和两歧双歧杆菌微胶囊中两歧双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
实施例2：青春双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将两歧双歧杆菌替换为青春双歧杆菌、将鼠李糖替换为阿拉伯糖，得到青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊(冻干保护剂配方见表3)。
检测青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的活菌数，并且，计算青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表4)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的存活率(检测结果见表4)。
由表3-4可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的青春双歧杆菌冻干粉中青春双歧杆菌的冻干存活率高达38.66±4.73％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达25.74±1.92％；而制备青春双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了阿拉伯糖，但青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的冻干存活率仅有14.46±0.89％，并且，将青春双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有10.48±0.68％。
表3冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 阿拉伯糖100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+阿拉伯糖100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+阿拉伯糖100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+阿拉伯糖100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表4青春双歧杆菌冻干粉1～7和青春双歧杆菌微胶囊中青春双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
实施例3：短双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将两歧双歧杆菌替换为短双歧杆菌、将鼠李糖替换为棉子糖，得到短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊(冻干保护剂配方见表5)。
检测短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的活菌数，并且，计算短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表6)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的存活率(检测结果见表6)。
由表5-6可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的短双歧杆菌冻干粉中短双歧杆菌的冻干存活率高达47.58±2.38％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达29.47±1.28％；而制备短双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了棉子糖，但短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的冻干存活率仅有13.95±0.38％，并且，将短双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有7.81±0.64％。
表5冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 棉子糖100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+棉子糖100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+棉子糖100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+棉子糖100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表6短双歧杆菌冻干粉1～7和短双歧杆菌微胶囊中短双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
实施例4：长双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将两歧双歧杆菌替换为长双歧杆菌、将鼠李糖替换为山梨糖醇，得到长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊(冻干保护剂配方见表7)。
检测长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的活菌数，并且，计算长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表8)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的存活率(检测结果见表8)。
由表7-8可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的长双歧杆菌冻干粉中长双歧杆菌的冻干存活率高达48.28±3.72％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达24.29±0.43％；而制备长双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了山梨糖醇，但长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的冻干存活率仅有8.28±0.28％，并且，将长双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有8.34±0.27％。
表7冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表8长双歧杆菌冻干粉1～7和长双歧杆菌微胶囊中长双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
实施例5：婴儿双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将两歧双歧杆菌替换为婴儿双歧杆菌、将鼠李糖替换为甘露糖，得到婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊(冻干保护剂配方见表9)。
检测婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的活菌数，并且，计算婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表10)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的存活率(检测结果见表10)。
由表9-10可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的婴儿双歧杆菌冻干粉中婴儿双歧杆菌的冻干存活率高达45.64±1.84％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达27.74±0.48％；而制备婴儿双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了甘露糖，但婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的冻干存活率仅有12.37±2.62％，并且，将婴儿双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有5.40±0.75％。
表9冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 甘露糖100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+甘露糖100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+甘露糖100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+甘露糖100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表10婴儿双歧杆菌冻干粉1～7和婴儿双歧杆菌微胶囊中婴儿双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
实施例6：假小链双歧杆菌冻干粉的制备
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将两歧双歧杆菌替换为假小链双歧杆菌、将鼠李糖替换为山梨糖醇，得到假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊(冻干保护剂配方见表11)。
检测假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的活菌数，并且，计算假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的冻干存活率(检测结果见表12)。
检测经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的活菌数，并且，计算经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的存活率(检测结果见表12)。
由表11-12可知，使用冻干保护剂2～4制备得到的假小链双歧杆菌冻干粉中假小链双歧杆菌的冻干存活率高达37.63±2.73％，并且，将使用冻干保护剂2～4制备得到的双歧杆菌冻干粉用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率高达23.17±1.49％；而制备假小链双歧杆菌微胶囊时虽然也使用了山梨糖醇，但假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的冻干存活率仅有8.95±0.47％，并且，将假小链双歧杆菌微胶囊用pH为3.0的模拟胃液处理2h后，双歧杆菌存活率仅有4.63±0.32％。
表11冻干保护剂1～7的配方
| 组别 | 配方 |
| 冻干保护剂1 | 山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂2 | 海藻酸钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂3 | 酪蛋白酸钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂4 | 羧甲基纤维素钠10g/L+山梨糖醇100g/L |
| 冻干保护剂5 | 海藻酸钠10g/L |
| 冻干保护剂6 | 酪蛋白酸钠10g/L |
| 冻干保护剂7 | 羧甲基纤维素钠10g/L |
表12假小链双歧杆菌冻干粉1～7和假小链双歧杆菌微胶囊中假小链双歧杆菌的冻干存活率以及经pH为3.0的模拟胃液处理2h后的存活率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种制备双歧杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述方法为将双歧杆菌培养液离心，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水或缓冲液中，所述菌泥与生理盐水或缓冲液的质量比为1～2:1～2，得到重悬液；将重悬液与冻干保护剂混合，所述重悬液与冻干保护剂的体积比为1～2:3～7，得到混合液；将混合液进行真空冷冻干燥，得到双歧杆菌冻干粉；
所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌（ Bifidobacterium bifidum ） 时，所述冻干保护剂为：海藻酸钠和鼠李糖、或酪蛋白酸钠和鼠李糖，或羧甲基纤维素钠和鼠李糖；
所述双歧杆菌为短双歧杆菌( Bifidobacterium breve ） 时，所述冻干保护剂为：海藻酸钠和棉子糖、或酪蛋白酸钠和棉子糖，或羧甲基纤维素钠和棉子糖；
所述双歧杆菌为长双歧杆菌( Bifidobacterium longum ） 时，所述冻干保护剂为：海藻酸钠和山梨糖醇、或酪蛋白酸钠和山梨糖醇，或羧甲基纤维素钠和山梨糖醇；
所述双歧杆菌为婴儿双歧杆菌( Bifidobacterium infantis ） 时，所述冻干保护剂为：海藻酸钠和甘露糖、或酪蛋白酸钠和甘露糖，或羧甲基纤维素钠和甘露糖；
所述双歧杆菌为假小链双歧杆菌( Bifidobacterium pseudochains ） 时，所述冻干保护剂为：海藻酸钠和山梨糖醇、或酪蛋白酸钠和山梨糖醇，或羧甲基纤维素钠和山梨糖醇。
2.如权利要求1所述的一种制备双歧杆菌冻干粉的方法，其特征在于，所述重悬液的pH为6.0～6.5。
3.一种双歧杆菌冻干粉，其特征在于，所述双歧杆菌冻干粉是使用权利要求1所述的方法制备得到的。
4.权利要求1或2所述的方法在冻干双歧杆菌中的应用。
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