CN110755403A - 一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；本发明制备工艺简单、高效，制备出的动物双歧杆菌微胶囊，能很好的耐受胃酸及胆盐，且肠溶性好，能在肠道中迅速繁殖。该微胶囊动物双歧杆菌口服后在胃部不解囊，最终顺利到达小肠，通过竞争性拮抗作用紧密结合肠粘膜上皮细胞，在肠道中生长、繁殖，直接补充正常生理细菌，抑制肠道中潜在危害致病菌，调整肠道的菌群平衡，提高机体免疫力。

Description

一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法
技术领域
本发明涉及医药制造领域，具体涉及一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法。
背景技术
益生菌，1989年由英国学者Fuller定义为：一种通过调节和改善肠道微生态平衡，从而对宿主发挥有益作用的微生物添加物，因益生菌具有优越的生理功能而被广泛关注。
研究发现，益生菌发挥益生功能需要摄入106-107g-1，同时其活性还会受到菌种自身生存能力、酸性环境、氧气和温度等因素的影响，于是，科学家们为了保持益生菌的活性提出了很多方法，而微胶囊则是公认的最为高效保持益生菌活力的方法。
但是现在的很多方法制备得到的微胶囊，耐胃酸、胆盐和肠溶性效果不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备工艺简单高效、耐受胃酸及胆盐，且肠溶性好的口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；具体步骤如下：
(1)动物双歧杆菌菌悬液的制备：
a.菌种的活化及发酵
将保存在冰箱中的菌种接种到固体培养基上，在37℃培养箱中厌氧培养22-24h，选取单菌落接种到液体培养基中，37℃培养箱中厌氧培养22-24h，活化好的菌种以1％-2％的接种量接种到液体培养基中，37℃环境下培养15-24h；
b.将培养好的菌液在高速旋转条件下进行离心处理，弃上清液，无菌生理盐水重悬，完成菌悬液的制备；
(2)水相的配制：制备质量浓度为1％-2％海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌，充分溶解后灭菌，加入菌悬液，混合均匀；
(3)油相的配制：制备含1％-5％span-80的植物油，搅拌均匀；
(4)油包水型乳液的制备：将水相加入至油相，搅拌器搅拌至均匀稳定的乳白色油包水乳液，反应温度为25-37℃；
(5)固化：加入质量浓度为3％-8％CaCl2溶液，进行搅拌固化；
(6)离心洗涤：在5000r/min转速下离心5-10min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2-3次，得到微胶囊沉淀；
(7)冷冻干燥：将收集的微胶囊沉淀以1：3的比例加入到冻干保护剂中，搅拌均匀，置于冻干机中冻干，冷冻干燥结束后收集微胶囊动物双歧杆菌菌粉，在2-8℃环境下保存，即完成了口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备。
进一步的，所述步骤(1)中的高速旋转的转速为5000r/min，离心时间为5-10min。
进一步的，所述步骤(4)中的转速为150-300r/min，搅拌时间为30min-1h。
进一步的，所述步骤(5)中的CaCl2溶液添加量占总量的20％-50％。
进一步的，所述步骤(5)中的搅拌转速为150-300r/min，搅拌固化时间为2-3h，反应温度为25-37℃。
进一步的，所述步骤(7)中的冻干保护剂包括1％-10％蔗糖、2％-10％脱脂奶粉，余量为水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制备工艺简单、高效，制备出的动物双歧杆菌微胶囊，能很好的耐受胃酸及胆盐，且肠溶性好，能在肠道中迅速繁殖。该微胶囊动物双歧杆菌口服后在胃部不解囊，最终顺利到达小肠，通过竞争性拮抗作用紧密结合肠粘膜上皮细胞，在肠道中生长、繁殖，直接补充正常生理细菌，抑制肠道中潜在危害致病菌，调整肠道的菌群平衡，提高机体免疫力。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示为本发明的制备工艺流程图。
实施例1
一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；具体步骤如下：
(1)动物双歧杆菌菌悬液的制备：
a.菌种的活化及发酵
将保存在冰箱中的菌种接种到固体培养基上，在37℃培养箱中厌氧培养22h，选取单菌落接种到液体培养基中，37℃培养箱中厌氧培养22h，活化好的菌种以1％的接种量接种到液体培养基中，37℃环境下培养15h；
b.将培养好的菌液在高速旋转条件下进行离心处理，弃上清液，无菌生理盐水重悬，完成菌悬液的制备，高速旋转的转速为5000r/min，离心时间为5min。
(2)水相的配制：制备质量浓度为1％海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌，充分溶解后灭菌，加入菌悬液，混合均匀。
(3)油相的配制：制备含5％span-80的植物油，搅拌均匀；
(4)油包水型乳液的制备：将水相加入至油相，搅拌器搅拌至均匀稳定的乳白色油包水乳液，反应温度为25℃，转速为150r/min，搅拌时间为30min。
(5)固化：加入质量浓度为3％CaCl2溶液，进行搅拌固化；CaCl2溶液添加量占总量的50％，搅拌转速为150r/min，搅拌固化时间为2h，反应温度为25℃。
(6)离心洗涤：在5000r/min转速下离心5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，得到微胶囊沉淀；
(7)冷冻干燥：将收集的微胶囊沉淀以1：3的比例加入到冻干保护剂中，冻干保护剂包括1％蔗糖、10％脱脂奶粉，余量为水，搅拌均匀，置于冻干机中冻干，冷冻干燥结束后收集微胶囊动物双歧杆菌菌粉，在2℃环境下保存，即完成了口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备。
实施例2
一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；具体步骤如下：
(1)动物双歧杆菌菌悬液的制备：
a.菌种的活化及发酵
将保存在冰箱中的菌种接种到固体培养基上，在37℃培养箱中厌氧培养24h，选取单菌落接种到液体培养基中，37℃培养箱中厌氧培养24h，活化好的菌种以2％的接种量接种到液体培养基中，37℃环境下培养24h；
b.将培养好的菌液在高速旋转条件下进行离心处理，弃上清液，无菌生理盐水重悬，完成菌悬液的制备，高速旋转的转速为5000r/min，离心时间为10min。
(2)水相的配制：制备质量浓度为2％海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌，充分溶解后灭菌，加入菌悬液，混合均匀。
(3)油相的配制：制备含1％span-80的植物油，搅拌均匀；
(4)油包水型乳液的制备：将水相加入至油相，搅拌器搅拌至均匀稳定的乳白色油包水乳液，反应温度为37℃，转速为300r/min，搅拌时间为1h。
(5)固化：加入质量浓度为8％CaCl2溶液，进行搅拌固化；CaCl2溶液添加量占总量的20％，搅拌转速为300r/min，搅拌固化时间为3h，反应温度为37℃。
(6)离心洗涤：在5000r/min转速下离心10min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次，得到微胶囊沉淀；
(7)冷冻干燥：将收集的微胶囊沉淀以1：3的比例加入到冻干保护剂中，冻干保护剂包括10％蔗糖、2％脱脂奶粉，余量为水，搅拌均匀，置于冻干机中冻干，冷冻干燥结束后收集微胶囊动物双歧杆菌菌粉，在8℃环境下保存，即完成了口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备。
实施例3
一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；具体步骤如下：
(1)动物双歧杆菌菌悬液的制备：
a.菌种的活化及发酵
将保存在冰箱中的菌种接种到固体培养基上，在37℃培养箱中厌氧培养23h，选取单菌落接种到液体培养基中，37℃培养箱中厌氧培养23h，活化好的菌种以1％-2％的接种量接种到液体培养基中，37℃环境下培养19h；
b.将培养好的菌液在高速旋转条件下进行离心处理，弃上清液，无菌生理盐水重悬，完成菌悬液的制备，高速旋转的转速为5000r/min，离心时间为5-10min。
(2)水相的配制：制备质量浓度为1.5％海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌，充分溶解后灭菌，加入菌悬液，混合均匀。
(3)油相的配制：制备含3％span-80的植物油，搅拌均匀；
(4)油包水型乳液的制备：将水相加入至油相，搅拌器搅拌至均匀稳定的乳白色油包水乳液，反应温度为32℃，转速为220r/min，搅拌时间为45min。
(5)固化：加入质量浓度为5.5％CaCl2溶液，进行搅拌固化；CaCl2溶液添加量占总量的35％，搅拌转速为225r/min，搅拌固化时间为2.5h，反应温度为32℃。
(6)离心洗涤：在5000r/min转速下离心7.5min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，得到微胶囊沉淀；
(7)冷冻干燥：将收集的微胶囊沉淀以1：3的比例加入到冻干保护剂中，冻干保护剂包括5.5％蔗糖、6％脱脂奶粉，余量为水，搅拌均匀，置于冻干机中冻干，冷冻干燥结束后收集微胶囊动物双歧杆菌菌粉，在5℃环境下保存，即完成了口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备。
实施例4
口服式动物双歧杆菌微胶囊耐酸耐胆盐及肠溶性试验
1.试验材料
已制备好的口服式动物双歧杆菌微胶囊冻干粉。
人工模拟胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL，胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释至1000mL，即得。
人工模拟胆液：称取3.00g胆盐3号，充分溶解，加水稀释至100mL，即得。
人工模拟肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，即得。
破囊液：磷酸盐缓冲液，调pH7.4。
2.试验过程
Figure BDA0002241917600000071
3.试验结果
Figure BDA0002241917600000081
Figure BDA0002241917600000082
Figure BDA0002241917600000083
Figure BDA0002241917600000091
由上表可知，本发明制备得到的动物双歧杆菌微胶囊，能够有效的耐受胃酸及胆盐，且肠溶性好。
本发明制备工艺简单、高效，制备出的动物双歧杆菌微胶囊，能很好的耐受胃酸及胆盐，且肠溶性好，能在肠道中迅速繁殖。该动物双歧杆菌微胶囊口服后在胃部不解囊，最终顺利到达小肠，通过竞争性拮抗作用紧密结合肠粘膜上皮细胞，在肠道中生长、繁殖，直接补充正常生理细菌，抑制肠道中潜在危害致病菌，调整肠道的菌群平衡，提高机体免疫力。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：经过动物双歧杆菌菌悬液的制备、水相的配制、油相的配制、油包水型乳液的制备、固化、离心洗涤和冷冻干燥步骤，完成口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法；具体步骤如下：
(1)动物双歧杆菌菌悬液的制备：
a.菌种的活化及发酵
将保存在冰箱中的菌种接种到固体培养基上，在37℃培养箱中厌氧培养22-24h，选取单菌落接种到液体培养基中，37℃培养箱中厌氧培养22-24h，活化好的菌种以1％-2％的接种量接种到液体培养基中，37℃环境下培养15-24h；
b.将培养好的菌液在高速旋转条件下进行离心处理，弃上清液，无菌生理盐水重悬，完成菌悬液的制备；
(2)水相的配制：制备质量浓度为1％-2％海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌，充分溶解后灭菌，加入菌悬液，混合均匀；
(3)油相的配制：制备含1％-5％span-80的植物油，搅拌均匀；
(4)油包水型乳液的制备：将水相加入至油相，搅拌器搅拌至均匀稳定的乳白色油包水乳液，反应温度为25-37℃；
(5)固化：加入质量浓度为3％-8％CaCl2溶液，进行搅拌固化；
(6)离心洗涤：在5000r/min转速下离心5-10min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤2-3次，得到微胶囊沉淀；
(7)冷冻干燥：将收集的微胶囊沉淀以1：3的比例加入到冻干保护剂中，搅拌均匀，置于冻干机中冻干，冷冻干燥结束后收集微胶囊动物双歧杆菌菌粉，在2-8℃环境下保存，即完成了口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备。
2.根据权利要求1所述的一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的高速旋转的转速为5000r/min，离心时间为5-10min。
3.根据权利要求1所述的一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的转速为150-300r/min，搅拌时间为30min-1h。
4.根据权利要求1所述的一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的CaCl2溶液添加量占总量的20％-50％。
5.根据权利要求1所述的一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的搅拌转速为150-300r/min，搅拌固化时间为2-3h，反应温度为25-37℃。
6.根据权利要求1所述的一种口服式动物双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中的冻干保护剂包括1％-10％蔗糖、2％-10％脱脂奶粉，余量为水。
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