CN112956697B - 鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备方法 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法，包括以下步骤：将质量浓度4％～12％的乳清蛋白溶液加热处理，将浓度为106～108CFU/mL的悬浮在生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液振荡均匀后与处理后乳清蛋白溶液混合，将水和大豆油添加到所得的乳清蛋白/菌液的混合液中，得复合液Ⅰ；将氯化钙和葡萄糖酸内酯添加到复合液Ⅰ中，将所得的复合液Ⅱ加热乳化；然后再离心取沉淀，得到微湿胶囊；将微湿胶囊进行冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉。该方法通过包埋鼠李糖乳杆菌ZFM231制成微胶囊，使其生物学功效得到有效保持。

Description

鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备方法
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种将鼠李糖乳杆菌制成微胶囊以延长其存活期的方法。
背景技术
由于益生菌在人体健康中具有关键性作用，近年来已被广泛应用于多种产品中，且被越来越多的人认可。益生菌必须通过胃环境并以大量的活菌到达肠道并定居于肠黏膜上才能通过改变肠道菌群平衡而对人体产生有利影响发挥其生理功能。然而，有很多活性益生菌在进入肠道前就已经因胃酸和胆汁作用而失活，因此在宿主体内存活增殖的能力较低，很大程度上影响了他们的益生效果。因此在肠道的存活率也就成为益生菌功效的另一个重要指标。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)属于乳杆菌属益生菌，具有缓解乳糖不耐症、调节肠道菌群平衡、抑制有害菌生长、降低胆固醇、提高机体的免疫力等作用。但鼠李糖乳杆菌进入人体消化道后会由于胃酸、胆汁的作用使得到达肠道的活菌数不足以在机体发挥自身的功效。而微胶囊化的鼠李糖乳杆菌可以与外界不利环境分开，提高菌体在消化道的存活率，有利于在肠道内定植。
申请号202010028764.7的发明《鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法和所用菌》告知了保藏编号为：CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231；该菌株具有良好的产胞外多糖能力，所产胞外多糖具有良好的调节肠道菌群平衡、降血脂、抗氧化等生物活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过包埋鼠李糖乳杆菌ZFM231制成微胶囊，使其生物学功效得到有效保持的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法，制备获得悬浮在生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液(先进行鼠李糖乳杆菌的活化，再制备菌液)；还包括以下步骤：
①、将质量浓度4％～12％的乳清蛋白溶液先于45±5℃恒温加热2±0.2h，再于80±5℃加热30±5min；然后于4±1℃放置12±2小时，得处理后乳清蛋白溶液；
上述加热均为在磁力搅拌器中进行(转速为800±100r/min)；
②、将浓度为106～108CFU/mL的悬浮在0.9％生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液振荡均匀后与处理后乳清蛋白溶液以体积比1：(17±1)混合，得乳清蛋白/菌液的混合液；
上述混合在磁力搅拌器中进行；
③、将水和大豆油添加到上述步骤②所得的乳清蛋白/菌液的混合液中，得复合液Ⅰ；乳清蛋白/菌液的混合液的体积是水和大豆油体积之和的3.5±0.5倍；水：大豆油＝1:1～1:5的体积比；
即，乳清蛋白/菌液的混合液：(水+大豆油)＝3～4:1的体积比；
④、将氯化钙和葡萄糖酸内酯(GDL)添加到步骤③得到的复合液Ⅰ中，得复合液Ⅱ；
氯化钙与复合液的用量比为：0.01g/100ml；氯化钙：葡萄糖酸内酯(GDL)＝1:35～45(优选1:40)的质量比；
⑤、将步骤④得到的复合液Ⅱ进行加热乳化：
200～1000r/min的速度在40±2℃条件下进行加热乳化，乳化时间为1～5h；然后再离心(转速为8000r/min时，离心6～8min后)取沉淀，得到微湿胶囊；
⑥、将微湿胶囊进行冷冻干燥得到鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉。
作为本发明的利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法的改进：
所述步骤⑤为：
配制浓度为0.1g/mL果胶溶液作为冻干保护剂，然后先在步骤④得到的复合液Ⅱ中加入冻干保护剂，然后再进行加热乳化；复合液Ⅱ：冻干保护剂＝2：3～5的体积比。
作为本发明的利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法的进一步改进：
步骤①中，乳清蛋白溶液质量浓度8％；
步骤③中，水与大豆油的体积比以1:4；
步骤⑤中，转速为800r/min、乳化时间为3h。
作为本发明的利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法的进一步改进：
步骤①中，乳清蛋白溶液质量浓度8％；
步骤③中，水与大豆油的体积比以1:4；
步骤⑤中，转速为800r/min、乳化时间为3h；复合液Ⅱ：冻干保护剂＝2：4的体积比。
作为本发明的利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法的进一步改进：
鼠李糖乳杆菌菌液所用菌为CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231。
本发明在发明过程中，为了获取优选工艺参数，曾进行了如下的实验：
实验1、鼠李糖乳杆菌生长曲线测定
菌株悬浮于0.9％生理盐水中制备106～108CFU/mL悬浮液并活化，将活化后的菌株以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃的恒温培养箱中厌氧培养，间隔2h取适量菌悬液，在波长条件为490nm下，测定吸光度，根据所得数据进行鼠李糖乳杆菌菌株的生长曲线绘制。
图1表明菌株在2-24h处于对数生长期。24h后生长速度稍微降低了一点，但不明显，表明菌株进入稳定期。在益生菌微胶囊的制作中，应选择对数生长期中后期或者稳定期的菌液是最佳的。因此，本发明选取的菌株培养时间为24h，并对菌体进行离心保存。
实验2、微胶囊包埋率计算(为常规计算法)
称取微胶囊(微湿胶囊/微胶囊冻干粉)0.2g，加到2ml的浓度为0.5mol/L的柠檬酸钠溶液中，旋涡震荡至胶囊颗粒有所溶解后放入恒温震荡培养箱37℃，180r/min，震荡1h后，取1mL的匀浆液进行10倍系列稀释，取100μL涂布于MRS固体培养基上，37℃恒温培养箱培养48h后进行活菌计数。计算包埋率参照张国芳,王婷婷,刘丽波等.内源乳化法制备干酪乳杆菌微胶囊，中国乳品工业,2017,45(3):15-20.方法。
包埋率(％)的计算公式如下：
Figure BDA0002973672750000031
改变乳清蛋白溶液的浓度，对应所得的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的包埋率的对比如图2所示；
改变水油比，水和大豆油的总体积用量保持不变，对应所得的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的包埋率的对比如图3所示；
改变步骤⑤的搅拌速度，对应所得的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的包埋率的对比如图4所示；改变乳化时间，对应所得的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的包埋率的对比如图5所示。
根据图2、图3、图4、图5鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的最优包埋工艺为乳清蛋白添加量8％、转速为800r/min、乳化时间为3h和水油比为1：4。
本发明所得鼠李糖乳杆菌微胶囊可用于发酵乳制品、奶粉、饮料、保健品、药品等领域。
本发明中，乳清蛋白微胶囊包埋高鼠李糖乳杆菌生物活性包括模拟胃液中的耐受性，模拟肠液中的释放性及微胶囊包埋率，微胶囊粒径及储藏稳定性。
本发明具有如下技术优势：
利用果胶和乳清蛋白双层微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌，能有效提高鼠李糖乳杆菌ZFM231的存活率。经过28天的储藏，未包埋的鼠李糖乳杆菌活菌数由8.89log(CFU/mL)减少到4.5log(CFU/mL)，活菌数下降了4.4个数量级；经过包埋的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊活菌数由8.82log(CFU/mL)减少到5.96log(CFU/mL)，活菌数下降了2.9个数量级；而微胶囊冻干粉的活菌数由8.78log(CFU/mL)减少到7.32log(CFU/mL)，活菌数仅下降1.5个数量级。经由包埋和冷冻干燥处理的微胶囊活菌数下降程度明显比未处理过的鼠李糖乳杆菌小。
通过以乳清蛋白包裹鼠李糖乳杆菌形成营养保护层，再借助带电量大、负电荷聚阴离子果胶与乳清蛋白发生交联凝聚反应，形成在胃中不消化、耐酸性能更好的双层微胶囊。该双层微胶囊既可发挥乳清蛋白高营养价值、又可利用外层凝胶起到对益生菌的保护作用避免其在胃中被水解。果胶和乳清蛋白双层微胶囊在大肠中可部分发酵或全部发酵而被降解成多糖、寡糖、胶类物质，这些物质还可作为益生菌的促进因子，发挥益生元的作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是鼠李糖乳杆菌生长曲线的测定；
图2是不同乳清蛋白浓度对微胶囊包埋率的影响；
图3是不同水油比对微胶囊包埋率的影响；
图4是搅拌速度对微胶囊包埋率的影响；
图5是不同乳化时间对微胶囊包埋率的影响；
图6是鼠李糖乳杆菌微胶囊在模拟胃液中的活菌数变化；
图7是鼠李糖乳杆菌微胶囊在模拟肠液中的活菌数变化；
图8是鼠李糖乳杆菌微胶囊在4℃下的储藏稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明中：
MRS液体培养基、MRS固体培养基(MRS液体培养基的基础上加入1.5％的琼脂)，使用前需要高温灭菌(121℃灭菌15min)，均为常规技术。
Lactobacillus rhamnosus ZJM231，即为CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231。
实施例1-1、乳清蛋白粉微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌，依次进行以下步骤：
1)、制备鼠李糖乳杆菌菌液：
①、活化菌株：从-80℃取出Lactobacillus rhamnosus ZJM231冻存管，置于常温解冻待用。
在超净台中将MRS固体培养基摇晃均匀后缓慢倒入培养皿中，等培养基凝固后将培养皿盖上盖子并倒置。取接种环蘸取解冻的冻存管液，然后用平板划线法在MRS固体培养基上划线活化菌株。将划好线的菌株放置于37℃恒温培养箱中兼性厌氧培养48h。
②、一代液体培养：培养48h后，将上一步得到的培养皿取出，在超净台中用接种环挑取一个长势良好的菌落放置于MRS液体培养基中并在37℃恒温培养箱中厌氧培养24h。挑选剩余的长势好的培养皿置于4℃保存，为保持其活性，1个月转接一次。
③、进一步以2％(v/v)接种量接于MRS液体培养基中进行培养(37℃恒温培养箱中厌氧培养24h)。活化3代后，在4℃下以8000r/min的条件下离心10分钟，使用生理盐水洗涤离心后的菌泥，离心三次收集细菌备用。将50％灭菌甘油与活化的菌液以3：2混合，可置于-80℃进行长期的保藏。
将菌株悬浮于0.9％(质量％)生理盐水中制备106～108CFU/mL悬浮液并活化，将活化后的菌株以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃的恒温培养箱中厌氧培养24h，间隔2h取适量菌悬液，在波长条件为490nm下，测定吸光度，根据所得数据进行鼠李糖乳杆菌菌株的生长曲线绘制。
2)、微胶囊的制备方法：
①、使用内源乳化冷凝法制备鼠李糖乳杆菌微湿胶囊：
方法如下：
A、将质量浓度为8％的乳清蛋白溶液置于恒温加热磁力搅拌器中，以800r/min的搅拌速度在45℃下恒温加热2h。迅速转移至恒温80℃的磁力搅拌器加热30min，然后冰水浴冷却后放入4℃的冰箱，过夜(12±2小时)；
B、将悬浮在生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液(106-108CFU/mL)振荡均匀后，与处理好的乳清蛋白溶液以1：17(体积比)的菌胶比置于磁力搅拌器中均匀搅拌，得乳清蛋白/菌液的混合液；
C、将水和大豆油添加到上述步骤B所得的乳清蛋白/菌液的混合液中，得复合液Ⅰ；乳清蛋白/菌液的混合液：(水+大豆油)＝3.5:1的体积比；水：大豆油＝1:4的体积比，
D、将氯化钙和葡萄糖酸内酯(GDL)添加到步骤C得到的复合液Ⅰ中，得复合液Ⅱ；
氯化钙与复合液Ⅰ的料液比为0.01g/100ml(即，氯化钙的添加量为复合液Ⅰ的0.01％)，葡萄糖酸内酯与复合液Ⅰ的料液比为0.4g/100ml(即，葡萄糖酸内酯的添加量为复合液Ⅰ的0.4％)；
因此，氯化钙：葡萄糖酸内酯＝1:40的重量比；
E、将步骤D得到的复合液Ⅱ以800r/min的速度于40℃进行加热乳化，乳化时间为3h。然后在8000r/min下离心6-8min，离心所得沉淀，为鼠李糖乳杆菌微胶囊(微湿胶囊)；
按此方法制备鼠李糖乳杆菌微胶囊，鼠李糖乳杆菌包埋率为85.97％。
包埋率的计算法按照实验2。
实施例1-2、即相对于实施例1-1作如下改变：乳清蛋白液的质量浓度6％，水：大豆油＝1:3，其余等同实施例1-1，包埋率为71.68％。
实施例1-3、即相对于实施例1-1作如下改变：步骤E的搅拌速度1000r/min，水：大豆油＝1:3，其余等同实施例1-1，包埋率为65.23％。
实施例1-4、即相对于实施例1-1作如下改变：步骤E的搅拌速度1000r/min，乳化时间2h；其余等同实施例1-1，包埋率为65.05％。
实施例1-5、即相对于实施例1-1作如下改变：乳清蛋白液的质量浓度10％，步骤E的搅拌速度600r/min，其余等同实施例1-1，包埋率为70.43％。
实施例2-1、鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉的制备
选用0.1g/mL的果胶水溶液作为冻干保护剂，所述果胶为食品级高酯果胶；
步骤E为：将实施例1-1步骤D得到的复合液Ⅱ先与冻干保护剂(0.1g/mL的果胶水溶液)按照体积比2：4混合，然后按照实施例1-1步骤E操作，离心后，得到微湿胶囊。
再进行如下的步骤F、微湿胶囊冷冻干燥：
将步骤E得到的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊放入平皿中，在-20℃的冰箱中冷冻8小时，冷冻完全后放入冷冻干燥机，-50℃冷冻16h，得到鼠李糖乳杆菌微胶囊的冻干粉。
制得的鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉包埋率77.71％。
实施例2-2、相对于实施例2-1作如下改变：复合液Ⅱ与冻干保护剂(0.1g/mL的果胶水溶液)的体积比为2：3；其余等同于实施例2-1，得到鼠李糖乳杆菌微胶囊的冻干粉，冻干粉的包埋率66.93％。
实施例2-3、相对于实施例2-1作如下改变：复合液Ⅱ与冻干保护剂(0.1g/mL的果胶水溶液)的体积比为2：5；其余等同于实施例2-1，得到鼠李糖乳杆菌微胶囊的冻干粉，冻干粉的包埋率72.24％。
实施例2-4、将实施例1-1所得的鼠李糖乳杆菌微胶囊(微湿胶囊)直接进行实施例2-1所述的“步骤F、微湿胶囊冷冻干燥”，制得的鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉包埋率仅仅为42.83％。
实验3、微胶囊在模拟胃液中的耐受性
A.模拟胃液：将浓盐酸配制成0.1mol/L的稀盐酸，然后加入10g的胃蛋白酶，将其混合均匀后转移至1000mL容量瓶，加水定容至刻度线。调节模拟胃液的PH至2.0，使用经过高压灭菌的0.22μm的滤膜进行过滤除菌。
B.取实施例2-1的1g微胶囊冻干粉置于人工胃液10ml中，用振荡器震荡均匀，放入恒温摇床中(200r/min，37±1℃)震荡，在0min、30min、60min、90min、120min分别取样1mL，对样品进行梯度稀释，用平板计数法测定平均数，每组平行三次实验取平均值。取未被包埋的鼠李糖乳杆菌做对照试验。
由图6可知无论是包埋的还是未被包埋的鼠李糖乳杆菌经胃液处理后，活菌数有所降低，且与时间呈负相关关系。未包埋的鼠李糖乳杆菌经模拟胃液处理90min后，活菌数从8.89降到了3.9log(CFU/mL)，下降了5个对数值。而经过包埋的鼠李糖乳杆菌，在经过胃液处理90min后，活菌数从8.78降到了5.82log(CFU/mL)，下降了3个对数值，直至120min后仍然有5.31log(CFU/mL)的菌体存活下来。包埋后的鼠李糖乳杆菌明显提高了其在模拟胃液中的存活率，这样可以使其通过胃环境到达肠道，提高其益生作用。
实验4、微胶囊在模拟肠液中的释放性
A.模拟肠液：取磷酸二氢钾6.8g，加入适量水使其溶解，用0.1mol/L NaOH溶液调节PH至7.4。取胰酶10g，加适量水溶解。将两种溶液混合均匀后，加水定容至1000mL容量瓶中，使用经过高压灭菌的0.22μm的滤膜进行过滤除菌；作为模拟人工肠液。
B.取实施例2-1的1g微胶囊冻干粉置于50mL人工肠液中，用振荡器震荡均匀，放入恒温摇床中(200r/min，37±1℃)震荡，在0min、30min、60min、90min、120min分别取样1mL，对样品进行梯度稀释，用平板计数法测定平均数，每组平行三次实验取平均值。取未被包埋的鼠李糖乳杆菌做对照试验。
由图7可知，随着微胶囊在模拟肠液处理的时间延长，微胶囊包埋的鼠李糖乳杆菌会连续释放，微胶囊在模拟肠液中处理60min后，菌体的存活率变化不大，在7.36log(CFU/mL)左右，表明本研究中的微胶囊肠溶性较好。60min之后，鼠李糖乳杆菌就会被连续地释放出来，它为微胶囊的益生作用奠定了基础。
实验5、微胶囊的储藏稳定性
将实施例1-1制备的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊和实施例2-1制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉和未进行包埋的鼠李糖乳杆菌置于4℃的条件下保藏，分别在0d、7d、14d、21d、24d取样，参照实验2中的方法对微胶囊中的活菌进行计数，取初始菌悬液(未进行包埋的鼠李糖乳杆菌)做对照试验。如图8所示，不管是包埋的鼠李糖乳杆菌还是未包埋的鼠李糖乳杆菌的活菌数都会随着储藏时间的增加而减少。未包埋的鼠李糖乳杆菌经过28天的储藏期活菌数由8.89log(CFU/mL)减少到4.5log(CFU/mL)，活菌数下降了4.4个数量级。经过包埋的鼠李糖乳杆菌微湿胶囊储藏期活菌数由8.82log(CFU/mL)减少到5.96log(CFU/mL)，活菌数下降了2.9个数量级。而微胶囊冻干粉的活菌数由8.78log(CFU/mL)减少到7.32log(CFU/mL)，活菌数下降了1.5个数量级。经由包埋和冷冻干燥处理的微胶囊活菌数下降程度明显比未处理过的鼠李糖乳杆菌小。由此可以看出，鼠李糖乳杆菌本身对储藏环境的要求较高，储藏稳定性较差，而经过包埋后的微湿胶囊和微胶囊冻干粉会提高其在储藏环境中的稳定性。
对比试验1、将实施例2-1中作为冻干保护剂的“果胶水溶液”改成“海藻酸钠水溶液”和“刺云实胶水溶液”、浓度保持不变，仍为0.1g/mL，其余等同于实施例2-1。
按照上述实验6进行检测，“海藻酸钠”为保护剂包埋率为：52.45％，“刺云实胶”为保护剂包埋率为56.96％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法，制备获得悬浮在生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液；其特征是还包括以下步骤：
①、将质量浓度8％的乳清蛋白溶液先于45±5℃恒温加热2±0.2h，再于80±5℃加热30±5min；然后于4±1℃放置12±2小时，得处理后乳清蛋白溶液；
②、将浓度为106～108CFU/mL的悬浮在生理盐水中的鼠李糖乳杆菌菌液振荡均匀后与处理后乳清蛋白溶液以体积比1：(17±1)混合，得乳清蛋白/菌液的混合液；
③、将水和大豆油添加到上述步骤②所得的乳清蛋白/菌液的混合液中，得复合液Ⅰ；乳清蛋白/菌液的混合液的体积是水和大豆油体积之和的3.5±0.5倍；水：大豆油＝1:4的体积比；
④、将氯化钙和葡萄糖酸内酯添加到步骤③得到的复合液Ⅰ中，得复合液Ⅱ；
氯化钙与复合液的用量比为：0.01g/100ml；氯化钙：葡萄糖酸内酯＝1:35～45的质量比；
⑤、将步骤④得到的复合液Ⅱ进行加热乳化：
配制浓度为0.1g/mL果胶溶液作为冻干保护剂，先在步骤④得到的复合液Ⅱ中加入冻干保护剂，复合液Ⅱ：冻干保护剂＝2：4的体积比，再于800r/min的速度在40±2℃条件下进行加热乳化，乳化时间为3h；然后再离心取沉淀，得到微湿胶囊；
⑥、将微湿胶囊进行冷冻干燥，得到鼠李糖乳杆菌微胶囊冻干粉。
2.根据权利要求1所述的利用乳清蛋白微胶囊包埋鼠李糖乳杆菌的方法，其特征是：鼠李糖乳杆菌菌液所用菌为CCTCC NO:M 2019883的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)ZFM231。
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