CN109619593A - 一种益生菌双层微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种益生菌双层微胶囊及其制备方法。本发明制备的益生菌双层微胶囊在胃和小肠不被溶解，到达大肠后20min内被降解，使益生菌体能更好地定植于肠道，进一步改善宿主的肠道环境，有益于肠道健康；本发明添加了抗性淀粉作为益生元，显著提高了菌体的生存率，增强了益生菌在胃肠道环境中的耐受力；本发明通过两次制囊，建立了具有多层体系的微胶囊，克服了现有单层微胶囊容易失水的缺点，增强了微胶囊的稳定性，使其在各种益生菌制品中能更好的发挥作用；本发明的微胶囊可以更好的保护菌体，延长菌体的贮存期至少一倍以上，在肠道的分散性和溶解性较好，且适宜于空气/液体多环境情况下的贮存和不同类型食品中的添加。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品技术领域，涉及一种益生菌双层微胶囊及其制备方法，涉及抗性淀粉作为益生元的作用效果。
背景技术
益生菌是一类定植于人或动物肠道，对宿主发挥有益作用的活性微生物的总称。常见的有乳酸菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌类，它们通过自身的发酵产生部分有机酸和大量的短链脂肪酸(SCFA)：如乙酸、丙酸和丁酸，有机酸的产生使得肠道处于酸性环境，可以有效地抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的生长；短链脂肪酸作为肠道能量的来源，对肠粘膜修复及结肠炎和结肠癌的预防起重要作用，益生菌的存在对于维持稳定的肠道微生态平衡至关重要。双岐杆菌是一类母乳喂养婴儿肠道中的主要天然菌丛，它对人体的生理作用远远超过乳酸菌，但是，双歧杆菌对营养的要求较高，还需要一些合适的生长因子促进其增值，所以，增强双歧杆菌的菌体活性在实际应用研究中具有重要意义。
抗性淀粉是20世纪发现的一类不被人体消化吸收的淀粉，作为微胶囊材料中的一种，抗性淀粉的B型结晶结构存在大量水通道，能够包埋这些敏感的化学物质，降低其消化率，从而作为一种稳定的运输工具帮助解决了食品工业中控制生物活性分子的释放，延长活性生物分子或化合物分子制品的货架期等技术难题。海藻酸钠作为一种常用的胶囊壁材，其内部单元堆积形成交联网络结构，其凝胶性质温和，而抗性淀粉与藻酸盐在胶凝过程中具有协同作用，可以强化固定细菌细胞。
为了解决益生菌环境不耐受性和稳定性差的问题，近年来，大量研究致力于通过微胶囊包裹益生菌体，并进行冷冻干燥达到长期保持菌体活性的目的。微胶囊技术是一种将颗粒分子封存在半透膜内来保存封闭生物结构的技术。在食品工业中，微胶囊技术用来保护敏感物质，如生物大分子(包括抗氧化剂、矿物质、维生素)和益生菌体，对保持益生菌活性的作用尤为明显，微胶囊技术可以提高益生菌的肠道活性和延长益生菌制品的货架期。
在目前的微胶囊制备方法中，喷雾法较为常见，肖志刚等(肖志刚,任海斌,曹慧英,等.以抗性淀粉为壁材制备的肠道益生菌微胶囊及其制备方法中国.CN105533684A.[P].2016.05.04)以抗性淀粉为壁材制备的肠道益生菌微胶囊采用喷雾干燥方法，但其所需设备成本较高，微胶囊粒径分布较广且不均匀，而且单层微胶囊易失水，贮藏时间较短。
发明内容
发明目的：针对现有技术中在益生菌微胶囊的发展过程中存在抗逆性较差、肠道定植性差、微胶囊易失水等问题，本发明提出了一种益生菌双层微胶囊的制备方法，是一种将抗性淀粉作为益生元，与益生菌同时包封于微胶囊的双层体系胶囊。
本发明还提供制备的益生菌双层微胶囊。
本发明提供的双层微胶囊，是将益生菌与抗性淀粉和乳清蛋白混合物作为芯材，选用海藻酸钠作为壁材，并进行二次制囊，此方法制备的双层微胶囊具有良好的稳定性，可以使益生菌到达肠道后释放，并且益生菌的存活期至少延长一倍以上，而且适宜于空气/液体多环境的贮存和不同类型食品中的添加。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种益生菌双层微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将益生菌接种到MRS液体培养基静置活化培养16h，然后接种到相同成分MRS液体培养基中，静置培养，离心，收集菌体并进行冷冻干燥；
(2)将冷冻干燥后的菌体用无菌水进行悬浮，并加入抗性淀粉和乳清蛋白混合均匀，得菌悬液，将碳酸钙添加进海藻酸钠溶液中，然后将菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液混合均匀，得菌胶液；
(3)取用菌胶液缓慢加入到含有1％(g/mL)司盘80的液体大豆油中，磁力搅拌；
(4)加入冰乙酸，继续搅拌得到微胶囊；
(5)将微胶囊用吐温80溶液和去离子水依次洗涤后，离心，收集沉淀，即为所制备湿微胶囊；
(6)将湿微胶囊进行冷冻干燥后得单层微胶囊；
(7)取步骤6中得到的单层微胶囊和抗性淀粉依次分散到海藻酸钠溶液中，通过注射器滴入浓度为0.5％(g/mL)氯化钙溶液中，离心，收集沉淀，冷冻干燥后得益生菌双层微胶囊。
作为优选，步骤(1)所述接种到相同成分MRS液体培养基中为按相同成分MRS液体培养基体积的3～5％进行接种。
其中，步骤(1)所述静置培养为37℃恒温静置培养16～18h使得活菌数达到1×1010cfu/g以上。
其中，步骤(1)所述益生菌为两歧双歧杆菌。
其中，步骤(2)所述抗性淀粉是通过复合酶-超声处理制备的RS3型抗性淀粉，制备方法如下：
a)配制质量分数为25％～45％的玉米淀粉乳，90℃水浴加热10min，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，按照6U/g(本发明均以玉米淀粉干重定义酶活单位)的酶量加入α淀粉酶，60℃水浴30min，然后，调节pH为4.5，按照6U/g的酶量加入普鲁兰酶，60℃水浴30min；
c)用超声波清洗仪在300W、60℃条件下处理10min，然后置于0℃老化24h；
d)将老化后的淀粉置于50℃恒温烘干，粉碎并过200目筛，备用。
作为优选，步骤(2)中所述将冷冻干燥后的菌体进行悬浮为按照菌体冻干粉与无菌水质量体积比为1:9～11g/mL进行悬浮，得菌悬液；所述抗性淀粉与无菌水质量体积比为0.5～1:10g/mL，取用抗性淀粉混悬于菌悬液中；所述乳清蛋白与无菌水质量体积比为0.5～1:10g/mL，取用乳清蛋白混悬于上述菌悬液中；碳酸钙与2％(g/mL)的海藻酸钠溶液质量体积比为0.5～1:50g/mL，取用碳酸钙混悬于2％的海藻酸钠溶液中；将上述添加抗性淀粉与乳清蛋白的菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液按体积比1:1的比例混合均匀，得菌胶液。
作为优选，步骤(3)中所述菌胶液与液体大豆油的体积比为1:2～2.5。
作为优选，步骤(4)中所述冰乙酸与步骤(3)中菌胶液的体积比为1～2:50。
作为优选，步骤(7)中所述单层微胶囊与海藻酸钠溶液质量体积比为1:10～12g/mL。
作为优选，步骤(7)中所述抗性淀粉与海藻酸钠溶液质量体积比为1:10～20g/mL。
作为优选，步骤(7)中所述海藻酸钠溶液浓度为1.0％～1.5％(g/mL)；所述氯化钙溶液浓度为0.5％g/mL。
本发明所述抗性淀粉，是经过复合酶-超声处理产生的RS3型抗性淀粉；所述芯材中的益生菌为两歧双歧杆菌但不局限于这一种。
本发明中MRS液体培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5。所选用的益生菌增值培养后得到的菌体活菌数达到1×1010cfu/g以上。
本发明所述材料如下：玉米淀粉，烟台东方蛋白科技有限公司产品；抗性淀粉为玉米抗性淀粉，自制；α～淀粉酶(BR，500U/mL)、普鲁兰酶(BR，1000U/mL)购自阿拉丁试剂有限公司。
机理：本发明所述的益生菌双层微胶囊的制备方法所制备的益生菌双层微胶囊芯材为益生菌菌悬液与抗性淀粉和乳清蛋白的混合物，抗性淀粉作为一种膳食纤维，在胃和小肠中不被消化，可以起到保护益生菌的作用，而且其良好的益生性可以促进肠道菌体增值；壁材为海藻酸钠与碳酸钙反应形成耐酸的保护层，在PH≤6时不溶解，在PH≥8时易溶解，满足肠溶性基本要求。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明制备的益生菌双层微胶囊在胃和小肠不被溶解，到达大肠后20min内被降解，使益生菌体能更好地定植于肠道，进一步改善宿主的肠道环境，有益于肠道健康；本发明添加了抗性淀粉作为益生元，一方面显著提高了菌体的生存率，增强了双歧杆菌在胃肠道环境中的耐受力，另一方面抗性淀粉颗粒间隙大，因此可以在保护菌体的同时得到粒径均匀、包埋率较高的微胶囊；本发明通过两次制囊，建立了具有多层体系的微胶囊，克服了现有单层微胶囊容易失水的缺点，增强了微胶囊的稳定性，使其在各种益生菌制品中能更好的发挥作用；本发明的微胶囊可以更好的保护菌体，延长菌体的贮存期至少一倍以上，在肠道的分散性和溶解性较好，且适宜于空气/液体多环境情况下的贮存和不同类型食品中的添加；本发明制备方法简单方便，所需设备成本较低，适合工业化生产。
附图说明
图1是微胶囊耐胃酸测试结果图；
图2是微胶囊肠道释放性测试结果图；
图3是微胶囊耐储藏性测试结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)复合酶-超声处理方法RS3型抗性淀粉的制备：
a)配制质量分数为25％的玉米淀粉乳，于90℃水浴10min，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，按照6U/g的酶量加入α淀粉酶，60℃水浴30min，然后，调节pH为4.5，按照6U/g的酶量加入普鲁兰酶，60℃水浴30min；
c)用超声波清洗仪在300W、60℃条件下处理10min，然后置于0℃老化24h；
d)将老化后的淀粉置于50℃烘干，粉碎并过200目筛，备用。
(2)益生菌双层微胶囊的制备：
1)将两歧双歧杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:CICC6166)接种到MRS液体培养基37℃静置活化培养16小时，然后按相同成分MRS液体培养基体积的3％接种到相同成分MRS液体培养基中(培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5)，37℃恒温静置培养16h，使得活菌数达到1×1010cfu/g以上，6000rpm离心10min，收集菌体并进行冷冻干燥，得菌体冻干粉；
2)取菌体冻干粉10g，加入90mL无菌水进行悬浮，并加入4.5g抗性淀粉和4.5g乳清蛋白混合均匀，得菌悬液；
3)配制2％g/mL的海藻酸钠溶液100mL，加入1.0g碳酸钙，将上述菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，搅拌均匀，得菌胶液；
4)取步骤3中得到的菌胶液50mL，缓慢加入到100mL含有1％(g/mL)司盘80的大豆油中，磁力搅拌30min进行乳化得到微胶囊；
5)加入1mL冰乙酸，继续搅拌30min使得钙离子释放并形成海藻酸钙微胶囊；
6)用1％(g/mL)的吐温80溶液和去离子水分别洗涤后，3000rpm离心收集沉淀，进行冷冻干燥，即得所制备单层微胶囊；
7)配制浓度为1.0％(g/mL)海藻酸钠溶液100mL，加入步骤6中所得10.0g单层微胶囊与10.0g抗性淀粉，混合均匀，通过注射器滴入浓度为0.5％(g/mL)氯化钙溶液中，3000rpm离心，收集沉淀，冷冻干燥后得益生菌双层微胶囊。
实施例2
复合酶-超声处理方法RS3型抗性淀粉的制备：
a)配制质量分数为35％的玉米淀粉乳，于90℃水浴10min，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，按照6U/g的酶量加入α淀粉酶，60℃水浴30min，然后，调节pH为4.5，按照6U/g的酶量加入普鲁兰酶，60℃水浴30min；
c)用超声波清洗仪在300W、60℃条件下处理10min，然后置于0℃老化24h；
d)将老化后的淀粉置于50℃烘干，粉碎并过200目筛，备用。
益生菌双层微胶囊的制备：
1)将两歧双歧杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:CICC6166)接种到MRS液体培养基静置活化培养16小时，然后按相同成分MRS液体培养基体积的4％接种到相同成分MRS液体培养基中(培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5)，37℃恒温静置培养17h，使得活菌数达到1×1010cfu/g以上，6000rpm离心10min，收集菌体并进行冷冻干燥；
2)取菌体冻干粉10g，用100mL无菌水进行悬浮，并加入7.5g抗性淀粉和7.5g乳清蛋白混合均匀，得菌悬液；
3)配制2％(g/mL)的海藻酸钠溶液100mL，加入1.5g碳酸钙，将上述菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，搅拌均匀，得菌胶液；
4)取步骤3中得到的菌胶液50mL，缓慢加入到112.5mL含有1％(g/mL)司盘80的大豆油中，磁力搅拌30min进行乳化得到微胶囊；
5)加入1.5mL冰乙酸，继续搅拌30min使得钙离子释放并形成海藻酸钙微胶囊；
6)用1％(g/mL)的吐温80溶液和去离子水分别洗涤，3000rpm离心收集沉淀，进行冷冻干燥，即得所制备单层微胶囊；
7)配制浓度为1.25％(g/mL)海藻酸钠溶液110mL，加入步骤6中所得10.0g单层微胶囊与7.5g抗性淀粉，混合均匀，通过注射器滴入浓度为0.5％(g/mL)氯化钙溶液中，3000rpm离心，收集沉淀，冷冻干燥后得益生菌双层微胶囊。
实施例3
复合酶-超声处理方法RS3型抗性淀粉的制备：
a)配制质量分数为45％的玉米淀粉乳，于90℃水浴10min，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，按照6U/g的酶量加入α淀粉酶，60℃水浴30min，然后，调节pH为4.5，按照6U/g的酶量加入普鲁兰酶，60℃水浴30min；
c)用超声波清洗仪在300W、60℃条件下处理10min，然后置于0℃老化24h；
d)将老化后的淀粉置于50℃烘干，粉碎并过200目筛，备用。
益生菌双层微胶囊的制备：
1)将两歧双歧杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:CICC6166)接种到MRS液体培养基静置活化培养16小时，然后按相同成分MRS液体培养基体积的5％接种到相同成分MRS液体培养基中(培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5)，37℃恒温静置培养18h，使得活菌数达到1×1010cfu/g以上，6000rpm离心10min，收集菌体并进行冷冻干燥；
2)取菌体冻干粉10.0g，用110mL无菌水进行悬浮，并加入11.0g抗性淀粉和11.0g乳清蛋白混合均匀，得菌悬液；
3)配制2％(g/mL)的海藻酸钠溶液100mL，加入2.0g碳酸钙，将上述菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，搅拌均匀，得菌胶液；
4)取混匀的菌胶液50mL，缓慢加入到125mL含有1％(g/mL)司盘80的大豆油中，磁力搅拌30min进行乳化得到微胶囊；
5)加入2mL冰乙酸，继续搅拌30min使得钙离子释放并形成海藻酸钙微胶囊；
6)用1％(g/mL)的吐温80溶液和去离子水分别洗涤，3000rpm离心收集沉淀，进行冷冻干燥，即得所制备单层微胶囊；
7)配制浓度为1.5％(g/mL)海藻酸钠溶液120mL，加入步骤6中所得10.0g单层微胶囊与6.0g抗性淀粉，混合均匀，通过注射器滴入浓度为0.5％(g/mL)氯化钙溶液中，3000rpm离心，收集沉淀，冷冻干燥后得益生菌双层微胶囊。
对比例1
参照王庆卫(王庆卫,钟芳,李玥.内源乳化法制备双歧杆菌微胶囊的研究[OL].中国科技论文在线.2014-03-07)通过乳化法制备了单层海藻酸钠微胶囊：将10mL菌悬液与20mL质量分数3.0％的海藻酸钠溶液混合，加入1g CaCO3搅拌均匀，然后按照1:2的水油比将此混悬液加入到大豆油中(含一定量的Span80)，机械搅拌形成W/O乳状液，15min后，加入20mL含有冰醋酸的大豆油，继续搅拌。30min后加入洗涤介质，搅拌10min，待凝胶成型的微胶囊都沉降到溶液底部后，吸去油相，用水洗涤微胶囊，直至无油相残留，1000rpm离心收集得到微胶囊。
对比例2
参照陈合(陈合,王野,贾亚丽,舒国伟,乳化法制备两歧双歧杆菌微胶囊,陕西科技大学学报,2013,31(1):78-81)通过喷雾法制备海藻酸钠微胶囊：将已活化的双歧杆菌菌种按5％的接种量分别在发酵培养24h后收集菌体，用生理盐水将其菌悬液调整为5.48×109cfu/mL，将菌悬液和海藻酸钠溶液均按1:10(w/v)混合，并加入0.4％的吐温80，乳化一段时间后分别用无菌压力喷嘴将乳化液喷入至于磁力搅拌器上的CaCl2溶液中，固化一段时间后，待湿胶囊形成后，用纱布过滤，然后再用生理盐水冲洗3次，初始微胶囊制备条件为2％海藻酸钠，2％CaCl2，乳化和固定化时间均为15min.
对比例3
参照马嫄(马嫄,段显萍,刘芸,龚丽.双层包埋制备嗜酸乳杆菌微胶囊及其应用.食品科学.2013,34(04):99-103)通过多孔淀粉作为壁材制备了海藻酸钠单层微胶囊：在无菌操作条件下，称取10g的多孔淀粉于烧杯中，加入108CFU/mL菌悬液50mL，用NaOH、HCl溶液调pH值，再在室温条件下振荡吸附数十分钟，至完全吸附，加入质量分数为2％的海藻酸钠溶液，搅拌均匀后挤入2％的无菌Ca Cl2溶液中，固化30min成膜。用3.5％CaCl2溶液浸泡10min进行硬化。过滤取得样品，用清水漂去表面的CaCl2残液，再用质量分数为0.85％的无菌生理盐水洗涤微胶囊表面菌体。在－40℃的超低温冰箱中预冻4h以上，再在冷冻干燥机中进行冻干处理24h，制得微胶囊。
对比例4
内源乳化法单层微胶囊的制备：
(1)复合酶-超声处理方法RS3型抗性淀粉的制备：
a)配制质量分数为35％的玉米淀粉乳，于90℃水浴10min，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，加入α淀粉酶0.3mL，60℃水浴30min，然后，调节pH为4.5，加入普鲁兰酶0.15mL，60℃水浴30min；
c)用超声波清洗仪在300W、60℃条件下处理10min，然后置于0℃老化24h；
d)将老化后的淀粉置于50℃烘干，粉碎并过200目筛，备用。
(2)双歧杆菌单层微胶囊的制备：
1)将两歧双歧杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:CICC6166)接种到MRS液体培养基37℃静置活化培养16小时，然后按相同成分MRS液体培养基体积的5％接种到相同成分MRS液体培养基中(培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5)，37℃恒温静置培养18h，使得活菌数达到1×1010cfu/g以上，6000rpm离心10min，收集菌体并进行冷冻干燥，得菌体冻干粉；
2)取菌体冻干粉10g，加入100mL无菌水进行悬浮，加入7.0g抗性淀粉和7.0g乳清蛋白混合均匀，形成菌悬液；
3)配制2％(g/mL)的海藻酸钠溶液100mL，加入1.5g碳酸钙，将上述菌悬液与海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，搅拌均匀，得菌胶液；
4)取步骤3中得到的菌胶液50mL，缓慢加入到100mL含有1％(g/mL)司盘80的大豆油中，磁力搅拌30min进行乳化；
5)加入1.5mL冰乙酸，继续搅拌30min使得钙离子释放并形成海藻酸钙微胶囊；
6)用1％(g/mL)的吐温80溶液和去离子水分别洗涤后，3000rpm离心收集沉淀，进行冷冻干燥，即得所制备单层微胶囊；
对比例5
李来酉，赵敏，张帆，等，通过2层包埋制备了双歧杆菌微胶囊，并添加明胶和果胶作为益生元：第1层包埋，离心收集的菌体制备成蛋白胨菌悬液，菌悬液与明胶、果胶混合，磁力搅拌30min；第2层包埋，将以上制备的菌胶液与海藻酸钠混合，放入植物油(内含乳化剂)中进行乳化，用注射器向其中喷洒0.5％氯化钙，进行成囊反应，反应完成后，向溶液中喷入0.2％壳聚糖，进一步固化。用上述浓度的氯化钙溶液及氯化钠溶液洗涤后，离心收集微胶囊。
对比例6
未添加抗性淀粉的双歧杆菌双层微胶囊的制备：
1)将两歧双歧杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号:CICC6166)接种到MRS液体培养基37℃静置活化培养16小时，然后按相同成分MRS液体培养基体积的5％接种到相同成分MRS液体培养基中(培养基成分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，调节pH为6.5)，37℃恒温静置培养18h，使得活菌数达到1×1010cfu/g以上，6000rpm离心10min，收集菌体并进行冷冻干燥，得菌体冻干粉；
2)取菌体冻干粉10g，加入100mL无菌水进行悬浮，加入7.0g乳清蛋白混合均匀，形成菌悬液；
3)配制2％(g/mL)的海藻酸钠溶液100mL，加入1.5g碳酸钙，将上述菌悬液与海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，搅拌均匀，得菌胶液；
4)取步骤3中得到的菌胶液50mL，缓慢加入到100mL含有1％(g/mL)司盘80的大豆油中，磁力搅拌30min进行乳化；
5)加入1.5mL冰乙酸，继续搅拌30min使得钙离子释放并形成海藻酸钙微胶囊；
6)用1％(g/mL)的吐温80溶液和去离子水分别洗涤后，3000rpm离心收集沉淀，进行冷冻干燥，即得所制备单层微胶囊；
7)配制浓度为0.5％(w/v)海藻酸钠溶液100mL，加入步骤6中所得单层微胶囊，混合均匀，通过注射器滴入浓度为0.5％(g/mL)氯化钙溶液中，3000rpm离心，收集沉淀，冷冻干燥后得未添加抗性淀粉的双歧杆菌双层微胶囊。
指标检测
对本发明的微胶囊进行如下性能测试：
A：颗粒直径和包埋率测试
取本发明实施例所得的双层微胶囊成品和对比例所得的微胶囊成品，置于扫描电子显微镜下观察其微观形貌并记录其粒径；取1g本发明实施例和对比例所得的微胶囊成品，分别加入10mL模拟肠液(质量浓度比为0.85％的NaCl溶液用0.01mol/L的NaOH调节PH为8.0，121℃高压灭菌20min后，加入1％的胰蛋白酶)中，37℃下震荡120min使菌体释放，进行梯度稀释并采用平板计数法测定活菌数，计算公式如下：
包埋率(％)＝微胶囊中活菌数量/初始活菌数×100％
B：耐胃酸测试
取1g本发明实施例和对比例所得的微胶囊成品，分别加入10mL模拟胃液(质量浓度比为0.85％的NaCl溶液用0.1mol/L的HCl调节PH为1.5，121℃高压灭菌20min后，加入1％的胃蛋白酶)中，37℃下震荡培养4h，每隔30min取样液1mL，加入模拟肠液中使菌体释放，进行梯度稀释并采用平板计数法测定活菌数。
C：肠道释放性测试
取1g本发明实施例和对比例所得的微胶囊成品，分别加入10mL模拟肠液(质量浓度比为0.85％的NaCl溶液用0.01mol/L的NaOH调节PH为8.0，121℃高压灭菌20min后，加入1％的胰蛋白酶)中，37℃下震荡培养4h，每隔30min取样液1mL，加入模拟肠液中使菌体释放，进行梯度稀释并采用平板计数法测定活菌数。
D：耐储藏性测试
将1g本发明实施例和对比例所得的双歧杆菌微胶囊置于37℃恒温培养箱中储藏29天，每隔4天分离出微胶囊，测定活菌数量。
E：食品添加口感检测
将实施例2所得的双歧杆菌双层微胶囊按照5g，10g，15g，20g的量分别添加到200g的成品酸奶和冰激凌中，混合后进行品尝并得出微胶囊的添加对酸奶和冰激凌口味的影响。
结果分析
A：测定实施例所得微胶囊的包埋率和颗粒直径，结果如下表1，对比例1-6的包埋率和颗粒直径不能达到2方面相对较好的程度，包埋率高的微胶囊的颗粒直径范围的离散程度较大，与对比例比较可知实施例中的微胶囊粒径分布均匀，且包埋率较高，实施例中的海藻酸钠浓度对微胶囊粒径和包封率的影响较大，海藻酸钠浓度过低时，胶囊材质较软，不易成型且包埋率偏低，海藻酸钠浓度过高时，粘度过高，胶囊材质过硬，使得粒径较大，本发明实施例2中1％的海藻酸钠浓度所制备的微胶囊包埋率较高且粒径分布均匀。
表1.微胶囊包埋率与粒径分布结果表
| 实施例 | 包埋率/％ | 颗粒直径/mm |
| 实施例1 | 83.4 | 1.0～3.0 |
| 实施例2 | 93.0 | 1.5～2.5 |
| 实施例3 | 89.4 | 0.5～3.0 |
| 对比例1 | 56.3 | 0.3～4.5 |
| 对比例2 | 66.0 | 0.5～4.0 |
| 对比例3 | 67.1 | 1.5～5.0 |
| 对比例4 | 82.0 | 0.6～3.0 |
| 对比例5 | 72.3 | 0.5～4.0 |
| 对比例6 | 93.3 | 0.8～2.0 |
B：耐胃酸测试
如图1所示，本发明实施例1～3和对比例1，对比例3和对比例4所得微胶囊耐胃酸测试，实施例所得微胶囊的耐胃酸效果明显优于对比例，双层相较于单层在酸性环境下对菌体表现出更加优越的保护性；对比例6与实施例比较可以看出，2h后添加有抗性淀粉的微胶囊的活菌数量具有明显优势，可见抗性淀粉的添加也在一定程度上体现了对菌体的保护作用，对比例5采用明胶和果胶作为益生元，益生效果不显著，综上，本发明所得双层微胶囊对胃酸表现出了更好的耐受性，使得菌体在胃液中更好地保持活性，从而进入肠道进一步发挥作用。
C：肠道释放性测试
如图2所示，本发明实施例1～3和对比例1～6所得微胶囊肠道释放性测试，在30min内微胶囊内菌体基本被释放，但对比例1，对比例2和对比例4虽然释放较快，菌体的死亡率较高；对比例6未添加益生元，菌体在释放后菌体死亡率较高，活菌数明显较低,；对比例3和对比例5采用其他益生元的效果与本发明相比较差；本发明的微胶囊到达大肠后20min内被降解且菌体存活率显著高于对比例，说明抗性淀粉作为一种优良的益生元促进益生菌体更好地定植于肠道，进一步改善宿主的肠道环境，有益于肠道健康。
D：耐储藏性测试
由图3可知，对比例1-6在5天以后均表现出不同程度的较快的菌体死亡，本发明实施例1～3所得双层微胶囊菌种活性表现出稳定的存活率，说明本发明微胶囊对益生菌体具有更加优越的保护作用，而抗性淀粉的存在更是促进了菌体的存活率，本发明微胶囊可以达到延长益生菌制品货架期的目的，且符合瑞士和国际乳联标准化委员会建议的益生菌产品中双岐杆菌活菌数大于107cfu/g或107cfu/mL的活性要求。
E：食品添加口感检测：
由表2可见，微胶囊的添加对于酸奶和冰淇淋口感并无不利影响，甚至适量的添加会帮助改善其口感。
表2.食品添加口感检测结果表
| 微胶囊的添加量/g | 酸奶口感 | 冰淇淋口感 |
| 5 | 口感优良 | 口感优良 |
| 10 | 口感优良 | 口感优良 |
| 15 | 口感良好 | 口感优良 |
| 20 | 口感良好 | 口感良好 |
Claims (10)
1.一种益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将益生菌接种到MRS液体培养基静置活化培养，然后接种到相同成分MRS液体培养基中，静置培养，离心，收集菌体并进行冷冻干燥；
(2)将冷冻干燥后的菌体用无菌水进行悬浮，并加入抗性淀粉和乳清蛋白混合均匀，得菌悬液，将碳酸钙添加进海藻酸钠溶液中，然后将菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液混合均匀，得菌胶液；
(3)取用菌胶液缓慢加入到含有司盘80的液体大豆油中，搅拌；
(4)加入冰乙酸，继续搅拌得到微胶囊；
(5)将微胶囊用吐温80溶液和去离子水依次洗涤后，离心，收集沉淀，即为所制备湿微胶囊；
(6)将湿微胶囊进行冷冻干燥后得单层微胶囊；
(7)取步骤6中得到的单层微胶囊和抗性淀粉依次分散到海藻酸钠溶液中，通过注射器滴入氯化钙溶液中，离心，收集沉淀，冷冻干燥后得益生菌双层微胶囊。
2.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述接种到相同成分MRS液体培养基中为按相同成分MRS液体培养基体积的3～5％进行接种。
3.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述静置培养条件为37℃恒温静置培养16～18h使得活菌数达到1×1010cfu/g以上。
4.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述益生菌为两歧双歧杆菌。
5.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述抗性淀粉是通过复合酶-超声处理制备的RS3型抗性淀粉，制备方法如下：
a)配制质量分数优选为25％～45％玉米淀粉乳，水浴加热，不断搅拌使得糊化完全；
b)调节pH为7.0，加入α淀粉酶，水浴，然后，调节pH为4.5，加入普鲁兰酶，水浴；
c)用超声波清洗仪处理，然后老化；
d)将老化后的淀粉置烘干，粉碎并过筛，备用。
6.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将冷冻干燥后的菌体用无菌水进行悬浮为按照菌体冻干粉与无菌水质量体积比为1:9～11g/mL进行悬浮，得菌悬液；所述抗性淀粉与无菌水质量体积比为0.5～1:10g/mL，取用抗性淀粉混悬于菌悬液中；所述乳清蛋白与无菌水质量体积比为0.5～1:10g/mL，取用乳清蛋白混悬于上述菌悬液中；碳酸钙与海藻酸钠溶液质量体积比为0.5～1:50g/mL，将添加抗性淀粉与乳清蛋白的菌悬液与含有碳酸钙的海藻酸钠溶液按等体积混合均匀，得菌胶液。
7.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述菌胶液与液体大豆油的体积比为1:2～2.5。
8.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述冰乙酸与步骤(3)中菌胶液的体积比为1～2:50。
9.根据权利要求1所述的益生菌双层微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述单层微胶囊与海藻酸钠溶液质量体积比为1:10～12g/mL；所述海藻酸钠溶液浓度为1.0％～1.5％g/mL；所述抗性淀粉与海藻酸钠溶液质量体积比为1:10～20g/mL。
10.一种权利要求1～9任意一项所述的益生菌双层微胶囊的制备方法所制备的益生菌双层微胶囊。
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