CN102687857A - 一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法，它涉及一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法。本发明要解决现有益生菌在通过胃肠道的过程中存活率低，达不到益生效果的问题。方法：将大豆分离蛋白溶液调至等电点，离心弃掉清蛋白补入等体积的水，调pH至9.0加入德氏乳杆菌和果胶溶液，得到载德氏乳杆菌的大豆分离蛋白/果胶微胶囊；将壳聚糖溶解于2%醋酸溶液中，调pH值至4.2-4.8加入果胶溶液，将上述微胶囊加入到壳聚糖果胶溶液中，即得。本发明产品避免益生菌受到胃内高酸度环境和胆盐的破坏，使到达肠道的活菌数达到10⁷cfu/mL以上。本发明应用于益生菌的微胶囊制备领域。

Description

一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法。

背景技术

小肠是人体的主要吸收器官，各种益生菌（素）经过口服以后要到达小肠部位，才能发挥作用，因此，维持肠道系统功能的稳定和使益生菌能够最大限度地到达小肠部位是促进人体健康的必要条件之一。益生菌在人体中的存活和增殖能力对益生作用有着重要影响，益生菌制品中的菌体代谢应该稳定，活性较强，通过上消化道后有大量存活，进入肠道后发挥益生作用。

目前益生菌（素）在应用过程中存在着不同的问题，归结起来体现在：这些菌体一般通过口服进入胃肠道，在人体胃内保留时间一般为2小时左右，在这段时间内胃内各种酶及胃酸环境对菌体的活性会产生不同程度的负面影响，甚至会导致菌体死亡；

益生菌食品中益生菌的活性是产品质量的一个重要指标，日本发酵和乳酸饮料协会标准要求鲜乳制品中应有10⁷cfu/mL活性益生菌，只有这样高的数量才能补偿益生菌在胃和肠道中所下降的数量。然而，由于益生菌的自身生长特性及周围环境因素的影响，导致进入市场的产品中活菌含量很低。Lank aputhra和shah发现,嗜酸乳杆菌和双歧杆菌在酸性和胆盐的环境中存活量较低，因此如何提高到达肠道的益生菌活菌数量已成为研究的热点课题。国内外目前主要在以下几个方面进行研究：选择耐酸和耐胆盐的菌株、选择合适的接种量、二步发酵法、抗性调整、添加微量营养物质、添加抗坏血酸、选择合适的包装容器等等。目前，发酵乳制品中使用的发酵剂大多是采用冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥等技术生产的粉状产品，但是，这些产品在牛奶中是完全释放的，使其通过胃肠道的过程中得不到保护。

发明内容

本发明目的是为了解决现有益生菌在通过胃肠道的过程中存活率低，达不到益生效果的问题，而提供一种载乳酸菌大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法。

本发明的一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法是按以下步骤实现：一、将德氏乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在30℃~37℃下恒温培养16~24h，得菌种培养液，然后在4000~6000r/min的转速下离心5~10min，弃去培养液后，补入与弃去培养液等体积的无菌水混合均匀，得德氏乳杆菌菌体浓度为10¹⁰CFU/mL的菌悬液；二、用浓度为1mol/L HCl将质量百分比浓度为6%~11%的大豆分离蛋白水溶液的pH调至4.2~4.8，在1500~6000r/min转速下离心5~10min，弃上清液，补入与上清液等体积的蒸馏水混合均匀后，用浓度为1mol/L NaOH调pH至7~12，得大豆蛋白溶液；三、将步骤二得到的大豆蛋白溶液与步骤一得到的菌悬液按体积比为1~5:1的比例混合均匀，得混合液；将混合液与质量百分含量为0.5%~1.5%的果胶溶液按体积比为50~80:1的比例混合，然后在室温下搅拌混匀，在300~1300r/min的转速下用浓度为1mol/L NaOH调节pH至4.2~4.8，即得大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液；四、将壳聚糖溶解在质量百分含量为1%~3%的醋酸溶液中，搅拌混合均匀，得浓度为2~8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，然后在2000~6000r/min的转速下离心5~10min，收集上清液，向上清液中加入质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液，即得壳聚糖/果胶溶液；五、将步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液以0.5~3mL/min的速度滴加到步骤四得到的壳聚糖/果胶溶液中，边滴加边搅拌，然后在1000~3000r/min的条件下离心5~10min，离心后收集沉淀，即得载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊；其中，步骤四所述的质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液与上清液的体积比为1：1~8，步骤五所述的步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液与壳聚糖/果胶溶液的体积比为1:1。

本发明的有益效果：

本发明所得微胶囊具有可控靶向释放作用，避免益生菌接触胃内高酸度环境和胆盐的破坏，使到达肠道的活菌数达到10⁷cfu/mL以上，从而发挥益生菌的益生性能。

本发明的微胶囊的壁材为食品级成分，在制备过程中不使用交联剂，壳聚糖本身具有粘膜粘附能力，所以通过不同壁材组分比例的变化既可以实现益生菌的可控靶向释放，又可以使释放的微胶囊在释放的位点停留较长时间3~24小时或更长时间，以发挥菌群调节和益生的作用。

本发明将菌体制备成微胶囊的形式予以保护，使其经口服以后可以避开胃内的不利条件，最大量地到达肠道部位；本发明利用可食性的材料（大豆蛋白、果胶、壳聚糖）作为微胶囊壁材，这些材料不但成膜性好，具有生物兼容性、易降解的特点，更重要的是它是pH值依赖型的材料，即果胶在pH2.5-3.5之间能够固化，该pH范围正是人进食后胃内的酸性条件；在中性或者弱碱性及肠道酶的作用下果胶溶解，大豆分离蛋白也被破坏，从而释放出活性成分。壳聚糖作为一种天然的生物大分子，具有生物可降解性、生物兼容性、低毒性、良好的黏附性和成膜能力，因而被广泛应用于生物医学、制药工业和医疗卫生中。同时，壳聚糖具有一定的亲水性，可在盐酸、醋酸等低pH值水溶液及酸性消化液中膨胀形成凝胶，从而阻止药物的扩散和溶出。依赖此特性，可以通过控制溶液浓度、pH等因素，制备具有不同缓释效果的微囊，并提高可降解物质（如蛋白质）的生物活性或者通过上皮层增强对亲水性物质的吸收能力。本发明利用壳聚糖作为复合微胶囊外层壁材，充分发挥了壳聚糖的良好成膜能力及粘膜黏附特性，能够在小肠粘膜表面定植，更适合作为制备肠道靶向微胶囊材料。

通过扫描电镜观察结果表明，本发明制得的乳酸菌大豆分离蛋白微胶囊、大豆分离蛋白/壳聚糖复合微胶囊具有良好的成囊性，大豆分离蛋白微胶囊对乳杆菌的包埋数为9.8×10⁹CFU/mL，大豆蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊包埋的乳酸菌经过胃液、胆汁、肠液处理后，活菌数达到10⁷CFU/mL，而裸菌经过相同条件处理后，平均活菌数为10⁴CFU/mL~10⁵CFU/mL。

本发明的大豆蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊具有降低胃肠道内环境对乳酸菌的破坏程度，提高益生菌的存活率。

附图说明

图1为大豆分离蛋白（SPI）空白微胶囊SEM图；

图2为大豆分离蛋白（SPI）-壳聚糖（Chitosan）复合微胶囊SEM图；

图3为大豆分离蛋白（SPI）微胶囊包裹菌体内部形态SEM图；

图4为大豆分离蛋白（SPI）溶液的浓度对微胶囊包埋率的影响曲线图；

图5为pH对微胶囊包埋率的影响曲线图；

图6为搅拌速度对微胶囊包埋率的影响曲线图；

图7为菌悬液与大豆蛋白液的比例对微胶囊包埋率的影响曲线图；

图8为壳聚糖溶液浓度对包埋率的影响曲线图；

图9为大豆分离蛋白（SPI）微胶囊与壳聚糖溶液的体积比对包埋率的影响曲线图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法是按以下步骤实现：一、将德氏乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在30℃~37℃下恒温培养16~24h，得菌种培养液，然后在4000~6000r/min的转速下离心5~10min，弃去培养液后，补入与弃去培养液等体积的无菌水混合均匀，得德氏乳杆菌菌体浓度为10¹⁰CFU/mL的菌悬液；二、用浓度为1mol/L HCl将质量百分比浓度为6%~11%的大豆分离蛋白水溶液的pH调至4.2~4.8，在1500~6000r/min转速下离心5~10min，弃上清液，补入与上清液等体积的蒸馏水混合均匀后，用浓度为1mol/LNaOH调pH至7~12，得大豆蛋白溶液；三、将步骤二得到的大豆蛋白溶液与步骤一得到的菌悬液按体积比为1~5:1的比例混合均匀，得混合液；将混合液与质量百分含量为0.5%~1.5%的果胶溶液按体积比为50~80:1的比例混合，然后在室温下搅拌混匀，在300~1300r/min的转速下用浓度为1mol/L NaOH调节pH至4.2~4.8，即得大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液；四、将壳聚糖溶解在质量百分含量为1%~3%的醋酸溶液中，搅拌混合均匀，得浓度为2~8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，然后在2000~6000r/min的转速下离心5~10min，收集上清液，向上清液中加入质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液，即得壳聚糖/果胶溶液；五、将步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液以0.5~3mL/min的速度滴加到步骤四得到的壳聚糖/果胶溶液中，边滴加边搅拌，然后在1000~3000r/min的条件下离心5~10min，离心后收集沉淀，即得载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊；其中，步骤四所述的质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液与上清液的体积比为1：1~8，步骤五所述的步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液与壳聚糖/果胶溶液的体积比为1:1。

本实施方式所得微胶囊具有可控靶向释放作用，避免益生菌接触胃内高酸度环境和胆盐的破坏，使到达肠道的活菌数达到10⁷cfu/mL以上，从而发挥益生菌的益生性能。

本实施方式的微胶囊的壁材为食品级成分，在制备过程中不使用交联剂，壳聚糖本身具有粘膜粘附能力，所以通过不同壁材组分比例的变化既可以实现益生菌的可控靶向释放，又可以使释放的微胶囊在释放的位点停留较长时间3~24小时或更长时间，以发挥菌群调节和益生的作用。

本实施方式将菌体制备成微胶囊的形式予以保护，使其经口服以后可以避开胃内的不利条件，最大量地到达肠道部位；本发明利用可食性的材料（大豆蛋白、果胶、壳聚糖）作为微胶囊壁材，这些材料不但成膜性好，具有生物兼容性、易降解的特点，更重要的是它是pH值依赖型的材料，即果胶在pH2.5-3.5之间能够固化，该pH范围正是人进食后胃内的酸性条件；在中性或者弱碱性及肠道酶的作用下果胶溶解，大豆分离蛋白也被破坏，从而释放出活性成分。壳聚糖作为一种天然的生物大分子，具有生物可降解性、生物兼容性、低毒性、良好的黏附性和成膜能力，因而被广泛应用于生物医学、制药工业和医疗卫生中。同时，壳聚糖具有一定的亲水性，可在盐酸、醋酸等低pH值水溶液及酸性消化液中膨胀形成凝胶，从而阻止药物的扩散和溶出。依赖此特性，可以通过控制溶液浓度、pH等因素，制备具有不同缓释效果的微囊，并提高可降解物质（如蛋白质）的生物活性或者通过上皮层增强对亲水性物质的吸收能力。本发明利用壳聚糖作为复合微胶囊外层壁材，充分发挥了壳聚糖的良好成膜能力及粘膜黏附特性，能够在小肠粘膜表面定植，更适合作为制备肠道靶向微胶囊材料。

通过扫描电镜观察结果表明，本实施方式制得的乳酸菌大豆分离蛋白微胶囊、大豆分离蛋白/壳聚糖复合微胶囊具有良好的成囊性，大豆分离蛋白微胶囊对乳杆菌的包埋数为9.8×10⁹CFU/mL，大豆蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊包埋的乳酸菌经过胃液、胆汁、肠液处理后，活菌数达到10⁷CFU/mL，而裸菌经过相同条件处理后，平均活菌数为10⁴CFU/mL~10⁵CFU/mL。

本实施方式的大豆蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊具有降低胃肠道内环境对乳酸菌的破坏程度，提高益生菌的存活率。

通过以下试验验证本发明的效果：

本试验的载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法按以下步骤实现：一、将德氏乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃下恒温培养15h，得菌种培养液，经5000r/min离心15min，弃去培养液后，补入无菌水制得德氏乳杆菌菌体浓度为10¹⁰CFU/mL菌悬液；二、配制质量百分含量为9%的大豆分离蛋白（SPI）溶液，调节步骤一制得的菌悬液pH至4.5（大豆蛋白等电点），在2000r/min转速下离心5min，弃上清液，补入等体积水混合均匀后，调pH至9.0，使大豆球蛋白充分溶解，得大豆蛋白溶液；三、将步骤二得到的大豆蛋白溶液与步骤一得到的菌悬液按体积比为1:1的比例混合均匀，得混合液；将混合液与质量百分含量为1%的果胶溶液按体积比为1：8的比例混合，然后在室温下搅拌混匀，在700r/min转速下迅速调节pH至4.5，使溶解状态的大豆分离蛋白迅速成囊将菌体包裹起来，即得大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液；四、将壳聚糖溶解在质量百分含量为2%的醋酸溶液中，在磁力搅拌下使其充分溶解形成4mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，然后在4000r/min的转速下离心5min，收集上清液，向上清液中加入质量百分含量为1%的果胶溶液，即得壳聚糖/果胶溶液；五、将步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液以5mL/min的速度滴加到步骤四得到的壳聚糖/果胶溶液中，边滴加边搅拌，然后在3000r/min的条件下离心5min，即得载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊。

本试验所得乳酸菌大豆分离蛋白微胶囊、大豆分离蛋白/壳聚糖复合微胶囊进行冷冻干燥后即得缓释微球粉末。

本试验步骤一中所使用的微生物材料德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)从中国科学院微生物研究所购买，全称为德氏乳杆菌保加利亚亚种，保藏编号：CGMCC编号为1.1480。

本试验步骤二所使用的大豆分离蛋白购自哈高科大豆食品有限责任公司，以牛血清清蛋白为标准溶液绘制标准曲线，计算大豆球蛋白的含量。

对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊进行以下性能分析：

1)电镜扫描

对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊进行电镜扫描，观察微胶囊的包裹状态，结果如图3所示，同时以大豆分离蛋白-果胶微胶囊和大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖溶液复合微胶囊为对照，进行电镜扫描观察，其结果如图1和图2所示，空白大豆分离蛋白（SPI）微胶囊表面较平滑，由于微胶囊是空的，微胶囊有一定程度的凹陷现象，包菌的大豆分离蛋白（SPI）微胶囊外面又裹了一层壳聚糖的大豆分离蛋白（SPI）-壳聚糖（Chitosan）复合微胶囊，由于冷冻干燥脱水，可以看到微胶囊表面出现一些裂纹，几乎看不到表面有菌体，大多数菌体已被包裹在大豆分离蛋白（SPI）微胶囊与壳聚糖溶液之间夹层中；图3是大豆分离蛋白（SPI）微胶囊包裹菌体研碎后的内部结构，可以看到微胶囊内部有大量成串的菌体存在，说明大豆分离蛋白（SPI）微胶囊的包埋效果较好。

2）SPI溶液的浓度对包埋率的影响表征

在pH值为9，搅拌速率700rpm，菌悬液与大豆蛋白液体积比为1:2的条件下，考察大豆蛋白浓度（6%、7%、8%、9%、10%和11%）对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶包埋率的影响；结果如图4所示，由图4可知，当大豆蛋白（SPI）溶液浓度在10%时，包埋率较高达到70.3%，之后随浓度的升高，包埋率随之下降。但大豆蛋白（SPI）溶液浓度越高，在碱性条件下粘性越强，在与益生菌混合时，容易造成搅拌不均匀，形成的微胶囊大小不一，形态不均匀。所以最终选择大豆蛋白（SPI）溶液浓度为9%，包埋率达到67.08%。

3）pH对微胶囊包埋率的影响的表征

在大豆蛋白（SPI）溶液浓度为9%，搅拌速率700rpm，菌悬液与大豆蛋白（SPI）溶液体积比1:2的条件下，考察pH（7、8、9、10、11和12）对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊包埋率的影响；结果如图5所示，由图5可知，在低pH范围内随着pH的升高，大豆蛋白（SPI）微胶囊的包埋率也随之升高，当pH为9时包埋率最高达到67.08%，之后随着pH的升高，包埋率反而下降。随着pH的升高，同大豆蛋白（SPI）溶液的粘度越大，与菌液混合时搅拌不均匀，且对乳酸菌有一定的伤害作用，致使包埋率下降，所以选择pH=9.0为最佳包埋pH。

4）搅拌速度对微胶囊包埋率的影响的表征

在大豆蛋白（SPI）溶液浓度9%，pH值为9，菌悬液与大豆蛋白（SPI）溶液体积比为1:2的条件下，考察搅拌速率（300rpm、500rpm、700rpm、900rpm、1100rpm和1300rpm）对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊包埋率的影响；结果如图6所示，由图6可知，随着转速的增大，包埋率随之降低，然后又升高，在700r/min下包埋率最高达到67.08%。在显微镜下观察微胶囊的形态，随着转速的升高，微胶囊的直径变小，致使包埋率下降。当在700r/min条件下，微胶囊大小适中，而且均匀，所以选择700r/min为最佳转速。

5）菌悬液与大豆蛋白液的比例对微胶囊包埋率的影响的表征

在大豆蛋白（SPI）溶液浓度9%，pH值9，搅拌速率700rpm的条件下，考察菌悬液与大豆蛋白（SPI）溶液的比例（2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5）对本试验得到的载乳酸菌的大豆分离蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊包埋率的影响；结果如图7所示，由图7可知，随着SPI溶液比例的增大，包埋率随之增大，当菌悬液:SPI溶液=1:1时，包埋率最高，达到68%左右，但大豆蛋白（SPI）溶液比例进一步增大时，包埋率反而随之降低，当大豆蛋白（SPI）溶液比例较大，菌悬液较少时，单个微胶囊中包埋菌悬液较少，浪费原料；当大豆蛋白（SPI）溶液比例较小，菌悬液较多时，有部分菌悬液游离在微胶囊外，造成了包埋率较低。所以菌悬液与大豆蛋白（SPI）溶液最佳比例为1:1。

6）壳聚糖溶液浓度对包埋率的影响的表征

如图8所示，随着壳聚糖浓度的升高，包埋率随之升高，当达到4mg/mL时包埋率达到99.02%。随着壳聚糖溶液浓度的进一步增大，包埋率反而降低。随着壳聚糖浓度的增大，粘性越来越强，能将大豆蛋白（SPI）微胶囊表面的益生菌进一步包埋，致使包埋率大幅度的提高，当溶液浓度达到5mg/mL时，由于粘度太大，大豆蛋白（SPI）微胶囊与壳聚糖溶液混合不均匀，发生粘连，出现成团现象，造成包埋率下降。所以选取壳聚糖浓度4mg/mL为最佳条件。

7）SPI微胶囊与壳聚糖溶液的体积比对包埋率的影响的表征

结果如图9所示，随着壳聚糖溶液与大豆蛋白（SPI）微胶囊体积比的升高，包埋率也随之升高。这是因为随着壳聚糖体积的升高，壳聚糖包裹在大豆蛋白（SPI）微胶囊表面越充分，进一步将益生菌包裹在夹层中。当达到1:1后基本处于平衡，壳聚糖溶液体积的增加不会进一步提高包埋率，而且胶囊之间发生粘连，形成胶囊形态较差，所以选择壳聚糖溶液(v):SPI微胶囊(v)=1:1。

8）大豆分离蛋白-果胶复合物与菌悬液比对微胶囊包埋、释放影响的表征

在大豆蛋白（SPI）溶液浓度为9%，果胶溶液浓度为1%，大豆蛋白（SPI）溶液与果胶溶液比例为7：1的体积比混合的条件下进行验证，如表1所示，经模拟胃液处理2h，胆汁20min，肠液处理2h后，裸菌下降了2个数量级，即到达肠液的菌群数量为10⁴cfu/mL，大豆分离蛋白-果胶复合微胶囊微胶囊的菌体浓度在经过相同条件处理后均达到了10⁷cfu/mL。

表1大豆分离蛋白-果胶复合物与菌悬液比对微胶囊包埋、释放影响（×10⁶cfu）

(SPI+P):菌(v/v)	裸菌	2:1	1:1
				包埋数		300	381
胃液（2h）	1.70	18	26
				胆（20min）	0.02	5.0	13
肠液（2h）	0.0105	21.6	16.9

9）大豆分离蛋白与果胶比例对微胶囊包埋、释放影响的表征

在大豆蛋白（SPI）浓度为9%，果胶浓度为1%的条件下，考察了大豆蛋白（SPI）与果胶不同的体积比，结果如表2所示，通过大豆分离蛋白与果胶的不同比例比较，就包埋情况来说，二者比例为8：1和9:1的微胶囊效果最好;就肠液释放情况来说5:1效果为较好。综合考虑，由于大豆分离蛋白与果胶比例未引起肠液释放中数量级的变化（即影响不明显），而8:1的包埋效果明显较好，所以选用大豆分离蛋白与果胶比例为8:1的微胶囊。

表2大豆分离蛋白与果胶比例对微胶囊包埋、释放影响（×10⁶cfu）

表3中果胶与壳聚糖不同比例下微胶囊经人工模拟胃液、胆汁、肠液处理后的释放数的比较可以得出：经胃液处理后果胶与壳聚糖比例为20:1时微胶囊的释放数最好，其次为5:1,15：1,10:1。而在胆汁、肠液中果胶：壳聚糖比例为10:1时的释放效果最好，减少了益生菌在上消化道的释放，有效到达并靶向定位于肠道中。当壳聚糖在果胶—壳聚糖复合物中的比例增加时，即当果胶：壳聚糖为1∶1,1:2,1:3时微胶囊的释放效果很低，壳聚糖浓度过高会影响微胶囊的释放效果。综合考虑，果胶与壳聚糖的比例为10:1时，微胶囊的释放效果最好。

表3大豆蛋白-果胶-壳聚糖复合微胶囊经人工模拟胃液、胆汁、肠液处理后的释放数

综上所述，载德氏乳杆菌大豆分离蛋白-果胶复合微胶囊相比无果胶的载德氏乳杆菌大豆分离蛋白微胶囊，在人工模拟胃液、胆汁和肠液中有更好的释放效果，且对德氏乳杆菌有更好的保护效果，使其浓度提高两个数量级。经过单因素实验的探索优化条件为果胶浓度1.0mg/mL，大豆分离蛋白浓度为9%，大豆分离蛋白与果胶之比为7:1～9:1，大豆分离蛋白-果胶复合物与菌悬液之比为1:1。果胶与壳聚糖的比例为10:1时，微胶囊对试验菌的包埋效果最好，在胃液及胆汁中对试验菌有很好的保护作用并在肠液中有很好的释放效果。

Claims (3)

1.一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法，其特征在于载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖微胶囊的制备方法是按以下步骤实现：一、将德氏乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在30℃~37℃下恒温培养16~24h，得菌种培养液，然后在4000~6000r/min的转速下离心5~10min，弃去培养液后，补入与弃去培养液等体积的无菌水混合均匀，得德氏乳杆菌菌体浓度为10¹⁰CFU/mL的菌悬液；二、用浓度为1mol/LHCl将质量百分比浓度为6%~11%的大豆分离蛋白水溶液的pH调至4.2~4.8，在1500~6000r/min转速下离心5~10min，弃上清液，补入与上清液等体积的蒸馏水混合均匀后，用浓度为1mol/L NaOH调pH至7~12，得大豆蛋白溶液；三、将步骤二得到的大豆蛋白溶液与步骤一得到的菌悬液按体积比为1~5:1的比例混合均匀，得混合液；将混合液与质量百分含量为0.5%~1.5%的果胶溶液按体积比为50~80:1的比例混合，然后在室温下搅拌混匀，在300~1300r/min的转速下用浓度为1mol/L NaOH调节pH至4.2~4.8，即得大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液；四、将壳聚糖溶解在质量百分含量为1%~3%的醋酸溶液中，搅拌混合均匀，得浓度为2~8mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，然后在2000~6000r/min的转速下离心5~10min，收集上清液，向上清液中加入质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液，即得壳聚糖/果胶溶液；五、将步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液以0.5~3mL/min的速度滴加到步骤四得到的壳聚糖/果胶溶液中，边滴加边搅拌，然后在1000~3000r/min的条件下离心5~10min，离心后收集沉淀，即得载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊；其中，步骤四所述的质量百分含量为0.1%~1%的果胶溶液与上清液的体积比为1：1~8，步骤五所述的步骤三得到的大豆分离蛋白/果胶微胶囊溶液与壳聚糖/果胶溶液的体积比为1:1。

2.根据权利要求1所述的一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中所述的MRS液体培养基是通过以下方法制备的：将10g的牛肉膏、10g的蛋白胨、酵的母膏、2g的K₂HPO₄、2g的柠檬酸二胺、5g的CH₃COONa、20g的葡萄糖、0.58g的MgSO₄·7H₂O、0.205g的MnSO₄和0.5mL的吐温80加入蒸馏水并定容至1000mL，121℃灭菌15min，调节pH值至6.2~6.4。

3.根据权利要求1所述的一种载乳酸菌的大豆分离蛋白/果胶/壳聚糖复合微胶囊的制备方法，其特征在于步骤四所述的果胶溶液为高甲氧基果胶溶液。

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