CN107125767B - 一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法及应用 - Google Patents
一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法及应用，它涉及一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法及应用。本发明的目的是为了解决益生菌易受胃液、肠液、胆汁的破坏，使活菌数降低，影响保健效果的问题，本发明方法为：短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌菌体离心弃上清，沉淀并定容，再加入果胶溶液然后滴入CaCl2溶液中，得到的湿微粒子，静止固化，过滤，冲洗微粒子表面，然后与冻干保护剂混合均匀，冷冻干燥。本发明可作为降脂产品进行应用。本发明利用果胶包裹益生菌使心材免受贮藏环境及胃液、肠液和胆汁破坏，使活菌经过胃肠道时得到保护。本发明应用于益生菌领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法及 应用。
背景技术
双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道中的主要天然菌群，长久以来的研究证明，双歧杆菌对 人体的生理作用远远超过许多菌种。发酵乳杆菌是乳酸杆菌之一，在传统发酵食品中分布 广泛且是生物体内正常菌群。其菌落表面光滑，不透明且形态多呈圆顶状。植物乳杆菌作 为乳杆菌科中的乳酸菌属的一种，广泛存在于传统的发酵制品中，如酸菜、泡菜、熏制红 肠及发酵奶中。其菌落形态多为圆形，表面光滑，外观呈白色或浅黄色。对生物体有多种益生作用，目前在发酵食品领域，工业乳酸生产以及保健品领域都有广泛的应用。有研究表明，植物乳杆菌有抑制肠道内致病菌生长的作用，从而维持肠道菌群平衡，维持机体健康。但这些益生菌易受胃液、肠液、胆汁的破坏，使活菌数降低，影响保健效果。
发明内容
本发明的目的是为了解决益生菌易受胃液、肠液、胆汁的破坏，使活菌数降低，影响 保健效果的问题，提供了一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制 备方法及应用。
本发明一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法按以下 步骤实现：
一、将活化的植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃下富集培养48h，得到植物乳杆菌培养液；将活化的发酵乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在厌氧条件37℃下富 集培养24h，得到发酵乳杆菌培养液；将活化的短双歧杆菌接种到MRS+L-半胱氨酸盐酸盐 的液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集培养48h，得到短双歧杆菌培养液；将得到的三 种菌种培养液分别离心、去上清，得到短双歧杆菌的菌体沉淀、发酵乳杆菌的菌体沉淀和 植物乳杆菌的菌体沉淀；
二、将短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌的菌体沉淀等质量混合，然后用无菌生 理盐水定容至5mL，得到复合浓缩菌液；
三、将果胶溶液等体积加入到复合浓缩菌液中，并在漩涡振荡器上振荡至混合均匀， 得到混合液；用注射器吸取混合液，通过针头将混合液滴入浓度为100-500mmol/L的无菌 CaCl2溶液中，得到湿的微粒子；
四、将湿的微粒子置于4℃冰箱静止固化0.5-4h，然后过滤，再用无菌水冲洗胶囊表面， 得到冲洗后的微粒子；
五、将冲洗后的微粒子与冻干保护剂按照质量体积比为(1-5)g:(1-8)mL的比例混合均 匀，然后放入-20℃的冰箱预冻2h，再用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得短双歧杆菌、 发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子。
本发明的有益效果：本发明利用果胶包裹益生菌使心材免受贮藏环境及胃液、肠液和 胆汁破坏，使微粒子中包埋的活菌经过胃肠道时得到保护，从而可以顺利到达肠道，尤其 是结肠。将益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的贮藏稳定性，还可为厌氧菌株阻隔外界 的高氧环境；并且以低甲氧基果胶作为微粒子壁材，对三菌复合混菌都有很好的包埋效果， 微粒子的包埋率达99％以上。本发明所得三菌复合微粒子贮藏一段时间以后，其中的活 菌数要明显的高于裸菌菌粉对照，可见益生菌微粒子可以显著地提高产品中的活菌数量， 且三菌复合微粒子相对单一菌株微粒子减重效果更加显著。
附图说明
图1为实施例1中湿微粒子的图片；
图2为实施例1中冷冻干燥后微粒子的图片；
图3为实施例1中短双歧杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌三菌复合微粒子贮藏稳定性 图；其中x为-20℃、y为4℃、z为室温；
图4为实施例1中裸菌贮藏稳定性图；其中x为-20℃、y为4℃、z为室温；
图5为实施例1血清中甘油三脂(TG)的含量测定图；
图6为实施例1血清中总胆固醇(TC)的含量测定图；
图7为实施例1血清中高密度脂蛋白(HDL)的含量测定图；
图8为实施例1小鼠肝脏的HE染色图；其中a为空白组、b为高脂对照组、c为高 脂阳性对照组、d为短双歧杆菌微粒子组、e为两菌复合微粒子组、f为三菌复合微粒子 组；
图9为实施例1小鼠小肠的HE染色图；其中a为空白组、b为高脂对照组、c为高 脂阳性对照组、d为短双歧杆菌微粒子组、e为两菌复合微粒子组、f为三菌复合微粒子 组；
图10为实施例1小鼠脂肪的HE染色图；其中a为空白组、b为高脂对照组、c为高 脂阳性对照组、d为短双歧杆菌微粒子组、e为两菌复合微粒子组、f为三菌复合微粒子 组。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微 粒子的制备方法按以下步骤实现：
一、将活化的植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃下富集培养48h，得到植物乳杆菌培养液；将活化的发酵乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在厌氧条件37℃下富 集培养24h，得到发酵乳杆菌培养液；将活化的短双歧杆菌接种到MRS+L-半胱氨酸盐酸盐 的液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集培养48h，得到短双歧杆菌培养液；将得到的三 种菌种培养液分别离心、去上清，得到短双歧杆菌的菌体沉淀、发酵乳杆菌的菌体沉淀和 植物乳杆菌的菌体沉淀；
二、将短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌的菌体沉淀等质量混合，然后用无菌生 理盐水定容至5mL，得到复合浓缩菌液；
三、将果胶溶液等体积加入到复合浓缩菌液中，并在漩涡振荡器上振荡至混合均匀， 得到混合液；用注射器吸取混合液，通过针头将混合液滴入浓度为100-500mmol/L的无菌 CaCl2溶液中，得到湿的微粒子；
四、将湿的微粒子置于4℃冰箱静止固化0.5-4h，然后过滤，再用无菌水冲洗胶囊表面， 得到冲洗后的微粒子；
五、将冲洗后的微粒子与冻干保护剂按照质量体积比为(1-5)g:(1-8)mL的比例混合均 匀，然后放入-20℃的冰箱预冻2h，再用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得短双歧杆菌、 发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子。
本实施方式步骤一中活化的植物乳杆菌、活化的发酵乳杆菌和活化的短双歧杆菌的接 种量均为8％。
本实施方式中的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌种编号：CICC 6182，发酵乳杆 菌(Lactobacillus fermentum subsp.bulgarics)菌种编号：CGMCC1.1880，和植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)：菌种编号：AS1.557，均购于中国科学院微生物研究所菌种保藏 中心。
本实施方式中MRS液体培养基的配方为：2.0g磷酸氢二钾，2.0g柠檬酸三胺，5.0g无水乙酸钠，0.25g硫酸锰，0.58g硫酸镁，20.0g葡萄糖，10.0g蛋白胨，10.0g牛肉膏，5.0g酵母浸膏，0.5gL-半胱氨酸盐酸盐，1.0ml吐温80，pH调至6.8，加1L蒸馏水，121℃高压 蒸汽灭菌20min。MRS+L-半胱氨酸盐酸盐的液体培养基配方为：MRS液体培养基+5mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐.
本实施方式选用的针头型号、混合液滴入无菌CaCl2溶液中滴加的高度以及漩涡振荡 器旋转速度决定微粒子的大小。本实施方式制备的湿微粒子外观颜色呈白色，冻干后的微 粒子呈淡黄色，形状一致，直径为0.5-3mm左右，多呈球形，湿微粒子圆润饱满表面光滑， 流动性良好，冻干后微粒子之间不存在粘连成块现象。
本实施方式的有益效果：本实施方式利用果胶包裹益生菌使心材免受贮藏环境及胃 液、肠液和胆汁破坏，使微粒子中包埋的活菌经过胃肠道时得到保护，从而可以顺利到达 肠道，尤其是结肠。将益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的贮藏稳定性，还可为厌氧菌 株阻隔外界的高氧环境；并且以低甲氧基果胶作为微粒子壁材，对三菌复合混菌都有很好 的包埋效果，微粒子的包埋率达99％以上。本实施方式所得三菌复合微粒子贮藏一段时间以后，其中的活菌数要明显的高于裸菌菌粉对照，可见益生菌微粒子可以显著地提高产品中的活菌数量，且三菌复合微粒子相对单一菌株微粒子减重效果更加显著。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中活化的短双歧杆 菌的活化方法为：a、取0.5mL已灭菌的TPY液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，得到菌体悬浮液；b、将菌体悬浮液移植于TPY斜面培养基上，在37℃下厌氧培养48h；c、 挑选菌落在TPY固体培养基上三区划线，37℃下厌氧培养48h；重复步骤c操作三次， 短双歧杆菌即可充分活化。其它与具体实施方式一相同。
本实施方式中TPY液体培养基配方为：10.0g酪蛋白胨，5.0g大豆蛋白胨，2.5g酵母粉，5.0g葡萄糖，2.0g磷酸氢二钾，0.5g氯化镁，0.15g氯化钙，0.25g硫酸锌，0.1g氯化 铁，0.5gL-半胱氨酸盐酸盐，1.0ml吐温80，pH调至6.5，加1L蒸馏水，121℃高压蒸汽 灭菌20min。
TPY固体培养基配方为：TPY液体培养基+20g/L琼脂。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤一中活化的 发酵乳杆菌的活化方法为：a、利用接菌环挑取菌种接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧培养12h；b、挑取菌落接种于MRS固体培养基上三区划线，37℃厌氧培养12h，重复 步骤b操作三次，发酵乳杆菌即可充分活化。其它与具体实施方式一或二之一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中活化的 植物乳杆菌的活化方法为：a、利用接菌环挑取菌种接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧培养48h；b、挑取菌落接种于MRS固体培养基上三区划线，37℃厌氧培养48h，重复 步骤b操作三次，植物乳杆菌即可充分活化。其它与具体实施方式一至三之一相同。
本实施方式中MRS固体培养基的配方为：在上述MRS液体培养基中加入20g/L琼 脂得到MRS固体培养基。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三所述的果 胶溶液的质量浓度为1-5g/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三所述的漩 涡振荡器的转速为100-500r/min。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三所述的注 射器为1、2.5、5或10mL的注射器。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三所述的将 混合液滴入无菌CaCl2溶液中滴加的高度为距无菌CaCl2溶液液面5～10cm。其它与具体 实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：所述的三菌复合 微粒子的直径为0.2-3mm。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微 粒子的应用是指可作为降脂产品进行应用。
实施例1、本实施例一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制 备方法按以下步骤实现：一、短双歧杆菌的活化：a、取0.5mL已灭菌的TPY液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状态。b、吸取全部菌体悬浮液，移植于TPY斜面培养基上，在37℃下厌氧培养48h。c、挑选长势好的菌落在TPY固体培养基上 三区划线，37℃下厌氧培养48h。步骤c重复三次，短双歧杆菌即可充分活化；发酵乳杆菌 的活化：a、利用接菌环挑取实验室保藏菌种微量，接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧 培养12h。b、挑取长势好的菌落于MRS固体培养基上三区划线，37℃厌氧培养12h。步骤 b重复三次，发酵乳杆菌即可充分活化；植物乳杆菌活化过程为：a、利用接菌环挑取菌种 接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧培养48h；b、挑取菌落接种于MRS固体培养基上三 区划线，37℃厌氧培养48h，重复步骤b操作三次，植物乳杆菌即可充分活化。
二、将活化的植物乳杆菌按8％的接种量接种到MRS液体培养基中，在37℃下富集培 养48h，得到植物乳杆菌培养液；将活化的发酵乳杆菌按8％的接种量接种到MRS液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集培养24h，得到发酵乳杆菌培养液；将活化的短双歧杆菌 按8％的接种量接种到MRS+L-半胱氨酸盐酸盐的液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集 培养48h，得到短双歧杆菌培养液；将得到的三种菌种培养液分别离心、去上清，得到短 双歧杆菌的菌体沉淀、发酵乳杆菌的菌体沉淀和植物乳杆菌的菌体沉淀；
三、将短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌的菌体沉淀等质量混合，然后用无菌生 理盐水定容至5mL，得到复合浓缩菌液；
四、将果胶溶液等体积加入到复合浓缩菌液中，并在漩涡振荡器上振荡至混合均匀， 得到混合液；用注射器吸取混合液，通过针头将混合液滴入浓度为100-500mmol/L的无菌 CaCl2溶液中，得到湿的微粒子；
五、将湿的微粒子置于4℃冰箱静止固化0.5-4h，然后用纱布过滤，再用无菌水冲洗胶 囊表面，得到冲洗后的微粒子；
六、将冲洗后的微粒子与冻干保护剂按照质量体积比为(1-5)g:(1-8)L的比例混合均 匀，然后放入-20℃的冰箱预冻2h，再用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得短双歧杆菌、 发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子。
收集步骤四的滤液及冲洗液混合液，进行包埋率的测试，经测试微粒子的包埋率达 99％以上。
对本实施例获得的短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子进行体外模 拟人体胃肠道试验，具体操作为：
(1)模拟胃液释放
对照组：分别取1ml短双歧杆菌菌液或三菌混合菌液加入到30mL的模拟胃液中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡2h后，吸取100uL混合液，梯度稀释后选取适当浓度 涂板计数。
试验组：分别取0.1g短双歧杆菌微粒子或三菌复合微粒子加入到30mL的模拟胃液中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡2h后，500r/min离心5min，收集上清，选取 适当稀释度涂板计数。
(2)模拟胆汁液释放
对照组：将上述胃液处理2h后的短双歧杆菌菌液或三菌混合菌液在4000r/min下离 心15min，收集沉淀菌体。然后取30mL的模拟胆汁加入收集菌体中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡20min后，吸取100uL混合液，选取适当稀释度涂板计数。
试验组：取30ml模拟胆汁加入经上述胃液处理2h后的短双歧杆菌微粒子或三菌复合微粒子中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡20min后，500r/min离心5min，收集 上清，选取适当稀释度涂板计数。
(3)模拟肠液释放
对照组：将上述胆汁处理20min后的短双歧杆菌菌液或三菌混合菌液4000r/min离心 15min，收集沉淀菌体。然后取30mL的模拟小肠溶液加入该沉淀菌体中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡2h后，吸取100uL混合液，选取适当稀释度涂板计数。
试验组：取30ml模拟小肠溶液加入经上述胆汁处理20min后的短双歧杆菌微粒子或 三菌复合微粒子中，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡2h后，500r/min离心5min， 收集上清，选取适当稀释度涂板计数。
试验结果如表1所示：经过模拟胃液、胆汁、肠液处理后，短双歧杆菌裸菌和短双歧杆菌微粒子的菌体数量分别下降了4.82,1.76lgcfu/g；三菌复合裸菌和三菌复合微粒子的菌体数量分别下降了4.82,1.74lgcfu/g。试验结果说明，低甲氧基果胶作为壁材对微粒子内的短双歧杆菌等益生菌具有良好的保护效果。
表1模拟胃肠道释放试验结果(lg cfu/g)
对本实施例获得的短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子进行稳定性 试验，具体操作为：将制备好的短双歧杆菌微粒子和三菌复合微粒子，分别取适量进行分 装，将分装好的两种微粒子分别置于-20℃、4℃、室温条件下保存。在试验的0、7、14、21...84天时，分别取置于不同温度条件下的两种样品各0.1g加入30mLpH8.0的EDTA溶液中，在37℃条件下于摇床中180rpm/min振荡2h后，取适当稀释度涂平板计数微粒子中的 活菌数。冻干后的裸菌作为对照，处理条件与微粒子相同。试验周期结束后，以横坐标为 天数、纵坐标为活菌数的对数作图，观察菌数的变化趋势(见图3和图4)，由图3和图4 可知，在-20℃下保藏84d后，短双歧杆菌微粒子、三菌复合微粒子中的活菌数分别下降了 0.94，0.74lg cfu/g，短双歧杆菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌数分别下降1.46，1.35lg cfu/g； 在4℃下保藏84d后，短双歧杆菌微粒子、三菌复合微粒子中的活菌数分别下降了1.42，1.46lgcfu/g，短双歧杆菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌数分别下降2.10，2.29lgcfu/g；在室温 下保藏84d后，短双歧杆菌微粒子、三菌复合微粒子中的活菌数分别下降了3.29，3.33lgcfu/g，短双歧杆菌裸菌、三菌混合裸菌中活菌数分别下降4.11，4.02lgcfu/g。由此可见，在相同的贮存条件下，微粒子中的活菌数显著地高于裸菌菌粉的活菌数量。
对本实施例获得的短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子进行功能性 验证：
将试验小鼠置于动物饲养室，首先适应性饲养一周，期间12h光照，12h黑暗，自由饮食饮水，将48只小鼠随机分为6组，每组8只，然后连续喂养普通饲料或高脂饲料4周 来建立小鼠肥胖模型，建模成功后第五周开始按照以下方案进行分组：
A：空白组(喂以普通饲料)
B：高脂对照组(喂以高脂饲料)
C：高脂阳性对照组(喂以高脂饲料加奥利司他)
D：短双歧杆菌微粒子组(喂以高脂饲料加短双歧杆菌微粒子)
E：两菌复合微粒子组(喂以高脂饲料加植物乳杆菌和发酵乳杆菌复合微粒子)
F：三菌复合微粒子组(喂以高脂饲料加三菌复合微粒子)
各组每只小鼠饲喂剂量为108cfu/d。
高脂阳性对照组奥利司他喂药量的计算公式为：dm＝dh/hw*k*mw
dm、dh分别代表小鼠每天的给药量、人每天的给药量；mw代表小鼠的体重，hw代 表人的体重，人的体重一般取70kg，小鼠给药时的体重取40g；k代表人与小鼠的换算系 数为9。以每只小鼠的给药容量0.8mL计算得到奥利司他的药物浓度应为1.5mg/mL。
1、进行血脂测定试，小鼠禁食12小时，自由饮水，采用摘眼球取血法，用不含热原和内毒素的1.5mL离心管收集血液，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离，将上层血清吸取放入微离心管中，做好标记置于-20℃冰箱中保存备用。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻后按照试剂盒使用说明书操作检测样品。血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)的含量测定(见图5、6和7)。如图5、图6和7所示， 高脂对照组小鼠血清含量极显著的高于饲喂普通饲料的空白组。高脂饮食组中，短双歧杆 菌微粒子组TG含量仅略低于高脂对照组，而阳性对照组(奥利司他)和两菌、三菌复合微粒 子组的TG含量要显著的低于高脂对照组。其中两菌、三菌复合微粒子组血清TG含量又低 于阳性对照组(奥利司他)，说明益生菌微粒子对高脂饮食肥胖小鼠发挥了降脂的效果，且复 合益生菌效果要优于单菌。
2、将小鼠粪便基因组DNA的提取，取出预先保存在-20℃冰箱的粪便样品，按照粪便 基因组DNA提取试剂盒操作，并对各组小鼠肠道菌群组成结构进行分析，应用PCA分析即主成分分析，主成分1(PC1：12.48％)和主成分2(7.77％)代表原有数据的20.25％ 的信息。6组共47只小鼠肠道菌群组成情况被PC1和PC2分在了4个不同的区域，空白组 (A)被PC1与其他各组显著分开，短双歧杆菌微粒子组(D)、两菌复合微粒子组(E)、三菌复 合微粒子组(F)中的绝大多数被PC2与其他各组分开，由此推断，主成分1为小鼠是否因为 饲喂了高脂饲料而引发了肥胖，主成分2为饲喂的微粒子种类(短双歧杆菌单菌微粒子； 植物乳杆菌和发酵乳杆菌两菌微粒子；短双歧杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌三菌微粒子)。 可以分析得出，空白组(A)的肠道菌群组成相比于高脂对照组(B)、高脂阳性对照组(C)、短 双歧杆菌微粒子组(D)、两菌复合微粒子组(E)、三菌复合微粒子组(F)整体上存在着显著的 差异，而其他五组的小鼠肠道菌群之间差异相对较小，但这五组之间也存在着明显的差异 分化趋势。由以上结果可知，高脂饲料的喂养使得小鼠肠道菌群的结构组成发生了明显的 变化，微粒子及奥利司他的干预也使得肥胖模型小鼠的肠道菌群出现不同程度的变化，所 有小鼠粪便样品中共有469个OTU，各组样品特有的OTU为8～16个；高脂饮食使得小鼠 肠道内厚壁菌门与拟杆菌门的比例升高，微胶囊的干预提高了乳杆菌属和双歧杆菌的相对 丰度，在高脂阳性对照组肠道内肠杆菌丰度为其它各组的5～21倍，而微胶囊组肠杆菌和变 形细菌的丰度则维持在正常水平。
3、对小鼠肝脏进行HE染色，见图8，放大倍数为100×。空白组如8(a)所示；高脂 对照组如图8(b)所示；高脂阳性对照组如8(c)所示；短双歧杆菌微粒子组如图8(d) 所示；两菌复合微粒子组如8(e)所示；三菌复合微粒子组如图8(f)所示。HE染色结 果清楚的表明，高脂肪饮食引起了肝脏脂肪球状结构变性和炎症细胞的浸润，而4周的益 生菌微粒子介入显著的改善了这些异常，其中三菌复合微粒子组效果优于其它组。
4、对小鼠小肠进行HE染色，见图9，空白组：如图9(a)所示，取材时外力引起 的绒毛排列紊乱，但小肠组织结构完整，无明显病变；高脂对照组：如图9(b)所示， 绒毛粘膜上皮细胞内可见大小不等的空泡，部分肠粘膜有崩解现象；高脂阳性对照组：肠 腔内肠黏膜有大量崩解，黏膜固有层内有少量的淋巴细胞浸润；高脂对照组：如图9(c) 所示，短双歧杆菌微粒子组：如图9(d)所示，两菌复合微粒子组：如图9(e)所示， 三菌复合微粒子组：如图9(f)所示，均未发现明显的病理变化。
5、对小鼠脂肪进行HE染色，见图10，HE染色结果清楚的表明，高脂肪饮食引起了肝脏脂肪球状结构变性和炎症细胞的浸润，而4周的益生菌微粒子介入显著的改善了这些异常，其中三菌复合微粒子组效果优于其它组。
由本实施例可知利用果胶包裹益生菌使心材免受贮藏环境及胃液、肠液和胆汁破坏， 使微粒子中包埋的活菌经过胃肠道时得到保护，从而可以顺利到达肠道，尤其是结肠。将 益生菌研制成微粒子可以增加益生菌的贮藏稳定性，还可为厌氧菌株阻隔外界的高氧环 境；并且以低甲氧基果胶作为微粒子壁材，对三菌复合混菌都有很好的包埋效果，微粒子 的包埋率达99％以上。本实施例所得三菌复合微粒子贮藏一段时间以后，其中的活菌数要明显的高于裸菌菌粉对照，可见益生菌微粒子可以显著地提高产品中的活菌数量，且三菌复合微粒子相对单一菌株微粒子减重效果更加显著。
Claims (9)
1.一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤实现：
一、将活化的植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃下富集培养48h，得到植物乳杆菌培养液；将活化的发酵乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集培养24h，得到发酵乳杆菌培养液；将活化的短双歧杆菌接种到MRS+L-半胱氨酸盐酸盐的液体培养基中，在厌氧条件37℃下富集培养48h，得到短双歧杆菌培养液；将得到的三种菌种培养液分别离心、去上清，得到短双歧杆菌的菌体沉淀、发酵乳杆菌的菌体沉淀和植物乳杆菌的菌体沉淀；
二、将短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌的菌体沉淀等质量混合，然后用无菌生理盐水定容至5mL，得到复合浓缩菌液；
三、将果胶溶液等体积加入到复合浓缩菌液中，并在漩涡振荡器上振荡至混合均匀，得到混合液；用注射器吸取混合液，通过针头将混合液滴入浓度为100-500mmol/L的无菌CaCl2溶液中，得到湿的微粒子；
四、将湿的微粒子置于4℃冰箱静止固化0.5-4h，然后过滤，再用无菌水冲洗胶囊表面，得到冲洗后的微粒子；
五、将冲洗后的微粒子与冻干保护剂按照质量体积比为(1-5)g:(1-8)mL的比例混合均匀，然后放入-20℃的冰箱预冻2h，再用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子；该三菌复合微粒子作为降脂产品进行应用。
2.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤一中活化的短双歧杆菌的活化方法为：a、取0.5mL已灭菌的TPY液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，得到菌体悬浮液；b、将菌体悬浮液移植于TPY斜面培养基上，在37℃下厌氧培养48h；c、挑选菌落在TPY固体培养基上三区划线，37℃下厌氧培养48h；重复步骤c操作三次，短双歧杆菌即可充分活化。
3.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤一中活化的发酵乳杆菌的活化方法为：a、利用接菌环挑取菌种接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧培养12h；b、挑取菌落接种于MRS固体培养基上三区划线，37℃厌氧培养12h，重复步骤b操作三次，发酵乳杆菌即可充分活化。
4.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤一中活化的植物乳杆菌的活化方法为：a、利用接菌环挑取菌种接种到MRS斜面培养基上，37℃厌氧培养48h；b、挑取菌落接种于MRS固体培养基上三区划线，37℃厌氧培养48h，重复步骤b操作三次，植物乳杆菌即可充分活化。
5.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤三所述的果胶溶液的质量浓度为1-5g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤三所述的漩涡振荡器的转速为100-500r/min。
7.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤三所述的注射器为1、2.5、5或10mL的注射器。
8.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于步骤三所述的将混合液滴入无菌CaCl2溶液中滴加的高度为距无菌CaCl2溶液液面5～10cm。
9.根据权利要求1所述的一种短双歧杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌三菌复合微粒子的制备方法，其特征在于所述的三菌复合微粒子的直径为0.2-3mm。
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