CN101323850A

CN101323850A - 瑞士乳杆菌微胶囊及其制备与应用

Info

Publication number: CN101323850A
Application number: CNA2008100539613A
Authority: CN
Inventors: 王艳萍; 许女
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2008-07-28
Filing date: 2008-07-28
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2028-07-28
Also published as: CN101323850B

Abstract

本发明提供了瑞士乳杆菌微胶囊及其制备与应用，涉及了一种瑞士乳杆菌的包埋技术。其目的是将瑞士乳杆菌实现微胶囊化，解决以往单层或双层包埋中包埋效率和包埋产率低的问题。其技术方案是分别利用大豆分离蛋白，微孔淀粉，海藻酸钠作为微胶囊化的一，二，三层壁材，首次对瑞士乳杆菌进行三层包埋；其中，在制作菌悬液的过程中，采用经过正交优化的保护剂，提高了冷冻干燥后存活率。本发明的微胶囊，耐热性，耐酸性强，解决了胃酸，消化酶和抗生素等对活性杆菌引起的灭活问题，到达大肠释放，调节肠道菌群平恒。且发酵牛奶的重复利用性好。本发明所用的瑞士乳杆菌，丰富了益生菌微胶囊的品种是一种很好的膳食补充剂。

Description

瑞士乳杆菌微胶囊及其制备与应用

发明领域

本发明提供了瑞士乳杆菌微胶囊及其制备与应用，属于生物技术领域，涉及瑞士乳杆菌微胶囊及其制备方法与应用。

背景技术

益生菌是一种通过改善肠道微生物平衡从而对宿主施加有益影响的微生物添加物，它们对机体有多种其它正常生理菌群无法比拟的生理作用。例如：改善肠道功能，抵抗肠道病原菌，促进乳糖消化，抗癌，抗过敏，调节免疫系统，降血脂，降血压，抵抗泌尿系统感染等功效。

瑞士乳杆菌属于益生菌，可分离自人体肠道内、酸乳、制干酪的引子或干酪，瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解活性，能水解乳蛋白产生多种生物活性肽，例如可以产生高浓度的具有抗高血压作用的二肽，三肽，其发酵乳具有抗高血压、抑制肿瘤、降低胆固醇等作用，还能分泌胞外多糖，改善乳制品的质地。瑞士乳杆菌，可以作为一种天然产品使用，或用于制药业的新的有效微生物，越来越被人们认识、接受，追求。但是，瑞士乳杆菌抗高温，抗酸，抗逆，抗噬菌体侵染等性能比较差，容易失活。瑞士乳杆菌在应用中存在一些问题，主要表现在：

当瑞士乳杆菌代替抗生素作为一种绿色添加剂添加到饲料中时，由于饲料中存在大量微量元素，金属离子，维生素等，会引起一系列的氧化还原反应，酸碱反应等抑制菌体的活力。

当瑞士乳杆菌作为一种膳食补充剂时，胃液的pH为2.5，大多数菌体被灭活，只有百万分之一的活菌可以到达肠道，发挥正常的生理保健功能。而现有的益生菌保健品，一般来说菌体都没有经过微胶囊包埋，只是加入保护剂，冻干成粉，直接包装为冲剂，或用一般的胶囊壁材将没有经过微胶囊化的菌粉直接包装，制作成大胶囊，这里所用的一般的胶囊壁材，或者使得乳酸菌在肠道内不能迅速释放，定植，不利于抑制有害菌的生长，从而不能有效地调节机体肠道菌群的平恒；或者，在胃里释放，因为菌体未经微胶囊化，所以很快被胃液中的酸，消化酶，抗生素灭活，不能顺利地到达肠道。

另外，当前应用乳酸菌进行生产发酵时，存在以下问题。传统的发酵过程，都是利用乳酸菌的自由细胞进行批次发酵，菌体抵抗噬菌体侵染能力比较差，菌体质粒保持稳定性也不强，且菌体和代谢产物难以分离，菌体不能重复利用，产品的后酸化问题也比较严重，而微胶囊化的乳酸菌可以克服以上问题，但是到目前为止，并没有利用微胶囊化的乳酸菌进行生产发酵。

发明内容

要解决的问题：

为了克服瑞士乳杆菌的抗高温，抗酸，抗逆等性能差的问题，和在应用瑞士乳杆菌生产发酵中，自由菌体细胞引起的菌体抵抗噬菌体侵染能力差，菌体质粒保持稳定性不强，菌体和代谢产物难以分离，菌体不能重复利用，产品的后酸化等问题，急需要对乳酸菌进行微胶囊化。

技术方案：

本发明首次对瑞士乳杆菌实现了三层包埋，特有的三层包埋技术克服了以往单层包埋或双层包埋的缺点，提高了包埋效率和包埋产率，使活性菌能顺利地通过了人体胃和小肠，到达大肠释放，从而有效的解决了胃酸，消化酶和抗生素等对活性杆菌引起的灭活问题。另外，本发明在制作菌悬液的过程中，用的是经过实验正交优化的保护剂配方(10％的脱脂奶95％，海藻糖1.5％，甘油0.5％，山梨醇2％，麦芽糊精1％)，克服了以往研究中用生理盐水或脱脂奶制作菌悬液，冷冻干燥存活率低的问题。

针对上述问题，瑞士乳杆菌微胶囊分别利用大豆分离蛋白，微孔淀粉，海藻酸钠作为菌体微胶囊化的第一层包埋材料，第二层包埋材料，第三层包埋材料，对瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus CICC6024)，进行三层包埋；

其具体制备方法是：首先制备菌悬液，即将活化后的瑞士乳杆菌菌种接入优化的MRS增殖培养基，利用流加碱中和培养的方法对菌体进行增殖培养，至稳定期前期，再经离心分离收集菌体，在菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，制备菌悬液，使菌体的浓度达到10¹⁰cfu/mL；然后对菌体进行三层包埋，即在上述制备的菌悬液中加入与菌悬液等体积的第一层包埋材料，包埋材料选用4％大豆分离蛋白溶液，常温下，200rpm/min搅拌20min至均匀，再等体积加入第二层包埋材料，包埋材料选用4％的微孔淀粉溶液，200rpm/min搅拌20min至吸附，接着加入2倍溶液体积的第三层包埋材料，包埋材料选用2％的海藻酸钠溶液，200rpm/min搅拌30min搅拌均匀，将得到的混合液滴入2％的CaCl₂溶液中，固化30min成球；最后进行真空冷冻干燥，即将上述制得的微球用无菌水漂洗后放在-80℃的冰箱中预冻3h，在冷阱温度-51℃，真空度0.09毫巴，真空冷冻干燥24h，即制得瑞士乳杆菌微胶囊；

上述所用的瑞士乳杆菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为Lactobacillus helveticus CICC6024。

上述优化的MRS增殖培养基，重量百分比配方为：MRS 80％，番茄汁7.5％，麦芽汁11％，乳清粉1.5％。配制时各物料重量百分比为100％。

所用菌体冷冻干燥保护剂，重量百分比配方为：10％的脱脂奶95％，海藻糖1.5％，甘油0.5％，山梨醇2％，麦芽糊精1％。配制时各物料重量百分比为100％。

·瑞士乳杆菌微胶囊的制备方法是：

首先制备菌悬液，即将活化后的瑞士乳杆菌菌种接入优化的MRS增殖培养基，利用流加碱中和培养的方法对菌体进行增殖培养，至稳定期前期，再经离心分离收集菌体，在菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，制备菌悬液，使菌体的浓度达到10¹⁰cfu/mL；

然后对菌体进行三层包埋，即加入与菌悬液等体积的第一层包埋材料，包埋材料选用4％大豆分离蛋白溶液，常温下，200rpm/min搅拌20min至均匀，再等体积加入第二层包埋材料，包埋材料选用4％的微孔淀粉溶液，200rpm/min搅拌20min至吸附，接着加入2倍溶液体积的第三层包埋材料，包埋材料选用2％的海藻酸钠溶液，200rpm/min搅拌30min搅拌均匀，将得到的混合液滴入2％的CaCl₂溶液中固化30min成球；

最后进行真空冷冻干燥，即将上述制得的微球用无菌水漂洗后放在-80℃的冰箱中预冻3h，在冷阱温度-51℃，真空度0.09毫巴，真空冷冻干燥18h～24h，即制得瑞士乳杆菌微胶囊。

瑞士乳杆菌微胶囊作为发酵剂重复发酵牛乳的应用，其方法是：

称取0.1g瑞士乳杆菌微胶囊，用孔径规格为≤0.2mm的不锈钢网篮包住，接种于100mL，经85℃加热30min的12％的全脂牛奶中，40℃恒温培养箱中进行牛乳发酵，待牛乳发较成熟后，将网篮提出，将其重新放入新鲜的牛奶中进行下一批次的发酵。

瑞士乳杆菌微胶囊在制作保健品上的应用

调节肠道菌群平衡，辅助治疗肠胃疾病的瑞士乳杆菌微胶囊保健品，其具体制作方法是：

按下述重量百分比配方称取各种物质：

瑞士乳杆菌微胶囊：50～70％，木瓜蛋白酶：2～3％，菠萝蛋白酶：2～3％，低聚果糖：5～10％谷氨酸钠：1～3％，酪酸：1～3％琉璃苣籽：0～5％，亚麻籽：0～5％，卵磷脂：5～10％，混合均匀，配制成冲剂，无菌充氮气包装，真空包装或放入全自动胶囊灌装封口机内，制成硬胶囊。配制时，各物料重量百分比为100％。

也可以在冲剂或硬胶囊的内容物中适当添加其它成分例如：复合维生素，低聚糖，蛋白水解物，植物，中草药提取物，多元醇等益生元物质，增强产品的保健功能。还可以将未经真空冷冻干燥的湿的瑞士乳杆菌微胶囊与富含多种保健功能的橄榄油，鱼油，小麦胚芽油，葡萄籽油混合，利用胶囊自动填充机进行填充，制成瑞士乳杆菌微胶囊软胶囊。

瑞士乳杆菌微胶囊在植物饮料制备中的应用，发酵苦菜制作苦菜保健饮料，具体制作方法是：

将新鲜苦菜经漂洗后，加入1倍体积的水，榨汁，再加入3倍苦菜汁体积的鲜奶，搅拌均匀后，巴氏灭菌，冷却到40℃，然后每100mL原料中接入0.006g瑞士乳杆菌微胶囊，40℃发酵6h～7h，再添加木糖醇，低聚糖，维生素E，铁粉使重量百分比含量分别为5％，5％，0.05％，0.05％，最后无菌包装。

也可以选取苦瓜，人参，蘑菇，花粉，中草药，茶叶等几种原材料，进行瑞士瑞杆菌微胶囊发酵。

性能测定：瑞士乳杆菌微胶囊产品的包埋效率和包埋产率的性能其具体方法是：

包埋效率＝1-(湿球微胶囊表面活菌数)/(湿球微胶囊完全破壁后的活菌数)×100％

包埋产率＝(湿球微胶囊完全破壁后的活菌数)/(加入的活菌数)×100％

产品干燥存活率＝(干燥后的产品微胶囊完全破壁后的活菌数)/(加入的活菌数)×100％

微胶囊表面活菌数的测定：将瑞士乳杆菌湿球微胶囊直接加入到生理盐水中，180r/min，搅拌30min，使表层及可泄露的菌体溶出，利用固体MRS培养基进行活菌计数。

微胶囊完全破壁后活菌数的测定：将瑞士乳杆菌湿球微胶囊或干燥后的产品微胶囊溶于0.2mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)中180r/min处理60min，完全溶解后，利用固体MRS培养基进行活菌计数。

测定结果为：包埋效率是91％，包埋产率95％，产品干燥存活率45％。

瑞士乳杆菌微胶囊的耐热性能

分别将微胶囊化的瑞士乳杆菌和未微胶囊化的瑞士乳杆菌粉置于50℃，55℃，60℃，65℃下，保温60min，然后测其菌体存活率，实验结果见表1。如表1所示，微胶囊化的瑞士乳杆菌具有很强的耐热性，其存活率远远高于未包埋菌体。

表1瑞士乳杆菌微胶囊的热稳定性试验

瑞士乳杆菌微胶囊的恒温储存性能

将3批瑞士乳杆菌微胶囊(I，II，III)和瑞士乳杆菌冻干粉(IV)经铂纸密封，于37℃恒温培养箱中放置3个月，I，II，IV每个月取样0.1g利用磷酸盐缓冲液完全破壁测其菌体存活率。III一直储存到3个月才测其活菌数，测其菌体存活率，实验结果见表2。结果得出：瑞士乳杆菌微胶囊恒温储存条件下的存活率远远高于未经过微胶囊化的菌体。

表2瑞士乳杆菌微胶囊的恒温储存实验

瑞士乳杆菌微胶囊人工胃液和人工肠液中的溶解性能

模拟胃液：9mLHCI加入1000mL水中，调节pH至1.2：

模拟肠液：750mL模拟胃液中加入250mL0.2mol/L磷酸钠溶液，调节pH至6.8；

分别称取微胶囊0.1g，置于盛有100mL人工胃液，人工肠液的三角瓶中，于摇床中以37℃，180rpm/min进行崩解，于15min，30min，45min，60min时分别取样测其600nm下的透光率，再分别在60min，120min取样测人工胃液，人工肠液中的活菌数，并将胃液中未溶解的胶珠捞出，用磷酸盐缓冲液完全破壁后，测其活菌数，实验结果见图1和表3。

结果所示，微胶囊经过人工胃液处理60min后，透光率在95％以上，120min后在人工胃液中并未检测到活菌数，而将胃液中未溶解的胶珠捞出，用磷酸盐缓冲液完全破壁后，测其活菌数为8.0×10⁸cfu/g，表明微胶囊在人工胃液中是基本不溶解，不发生渗漏，且微胶囊化的乳酸菌具有较强的耐酸性。理想的乳酸菌微胶囊在十二指肠(pH 4.7～6.5)就开始崩解，本法所得的乳酸菌微胶囊在人工肠液中的崩解性能仍然以透光率衡量。由图1和表3得出，微胶囊用人工肠液处理后，立即崩解，50min后崩解完全，120min活菌计数得9.0×10⁸cfu/g。说明经过微胶囊化处理的瑞士乳杆菌具有很好的耐酸性，能安全地通过胃液，顺利地到达肠道，立即释放。

表3瑞士乳杆菌微胶囊在人工胃液和人工肠液中的溶解情况

瑞士乳杆菌微胶囊的耐胆盐性能

称取0.1g瑞士乳杆菌微胶囊，放入100mL0.5％牛胆盐溶液中，180r/min，37℃，60min，测其活菌数，结果微胶囊化的瑞士乳杆菌存活率为90％，而未包埋的菌存活率为证明25％，说明微胶囊化的菌耐胆盐的特性显著高于未包埋的菌。

瑞士乳杆菌微胶囊重复利用发酵牛乳性能

瑞士乳杆菌的微胶囊化不仅增强了其耐酸性，耐热性，耐胆盐性，储存稳定性，而且还体现在利用微胶囊化瑞士乳杆菌胶珠发酵牛乳的高重复利用率。实验方法为：称取0.1g瑞士乳杆菌微胶囊，用孔径规格为≤0.2mm的不锈钢网篮包住接种于100mL，85℃加热30min的12％的全脂牛奶中，40℃培养箱中进行牛乳发酵，待牛乳发较成熟后，将网篮提出，将其重新放入新鲜的牛奶中进行下一批次的发酵，结果如表4。由表4可知，在6次重复利用试验中，胶珠的凝乳时间、pH值、酸度等都比较接近，说明胶珠在这6次重复发酵的试验中，活性并没有降低，产酸能力和pH值都没有太多变化。第1，2次相对于后面几次，其凝乳时间稍长，这与胶珠溶涨，活化有关。在第7次发酵试验中，胶珠已经破裂，不可以再重复利用。因此，利用固定化乳酸菌微胶囊重复利用发酵牛乳这一特性，不仅可以防止制品在贮藏过程中的后酸化问题，而且可提高制作酸奶的方便性与时效性，延长菌种的存活力，并可重复使用，且不易污染，既经济又方便。

表4瑞士乳杆菌微胶囊重复利用发酵牛乳实验

有益效果

本发明提供了一种对瑞士乳杆菌微胶囊化的方法，首次对瑞士乳杆菌实现了三层包埋，该方法简单易行，包埋效率和包埋产率高。其中以大豆分离蛋白作为第一层包埋材料，为微胶囊化的菌体在肠道内迅速释放以后提供营养，有利于菌体的生长繁殖；以微孔淀粉作为第二层包埋材料，有利于释放后的菌体在肠道内定植，黏附，增殖，且微孔淀粉特有的孔状结构，是很好地包埋材料，有利于微胶囊化的菌体在肠道内迅速释放；以加工性能，包埋性能良好及安全性良好的海藻酸钠作为第三层包埋材料，使保健药物在肠道中停留和吸收时间大大延长，从而提高乳酸菌的保健疗效。本发明特有的三层包埋技术克服了以往单层包埋或双层包埋的缺点，提高了包埋效率和包埋产率。本发明制作菌悬液的过程中，采用的是经过实验正交优化的保护剂，相比以往研究中用生理盐水或10％的脱脂奶制作的菌悬液，冷冻干燥后活菌数从10⁷提高到10⁸。

本发明对瑞士乳杆菌进行了包埋，其耐热性，耐酸性，恒温储存稳定性都有了很大的提高，通过微胶囊在胃液中和在肠液中的溶解性试验，可知其能顺利地通过了人体胃和小肠，到达大肠释放，从而有效的解决了胃酸，消化酶和抗生素等对活性杆菌引起的灭活问题，且发酵牛乳的重复利用性好。

本发明提供的瑞士乳杆菌微胶囊，丰富了益生菌微胶囊的品种，且开发的瑞士乳杆菌微胶囊保健品为机体提供了一种很好的益生菌膳食补充剂，活菌数高，具有调节肠道菌群平衡，提高机体的免疫能力，降血压，降血脂等良好的益生功能。本发明产品无论在保健功能，加工性能和生产性能上，相比于现代技术都具有特别的优势，蕴藏着巨大的市场价值。

附图说明

图1微胶囊在人工胃液和人工肠液中的溶解情况

在图1中1表示微胶囊在人工胃液中的溶解情况曲线，2表示微胶囊在人工肠液中的溶解情况曲线。结果表明微胶囊在人工胃液中是基本不溶解，不发生渗漏，即微胶囊化的菌体具有较强的耐酸性。微胶囊用人工肠液处理后，立即崩解，50min后崩解完全。说明经过微胶囊化处理的菌体具有很好的耐酸性，能安全地通过胃液，顺利地到达肠道，立即释放。

具体实施方式

实施例1：

瑞士乳杆菌微胶囊的制备方法。

首先制备菌泥，即将由脱脂乳活化后的瑞士乳杆菌菌种，(瑞士乳杆菌菌种购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC6024)，按4％的接种量，接入优化的2000mLMRS增殖培养基，(MRS1600mL，番茄汁150mL，麦芽汁220mL，乳清粉30mL)利用20％的碳酸钠溶液每隔3h调节发酵液的PH值为6.2，对菌体进行增殖培养15h，至稳定期前期，再8000rpm/min，20min离心分离收集菌体.

在上述制得的菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂200mL(10％脱脂奶190mL，海藻糖3g，甘油1g，山梨醇4g，麦芽糊精2g)制备菌悬液，使菌体的浓度达到10¹⁰cfu/mL；然后对菌体进行三层包埋，即加入200mL 4％大豆分离蛋白溶液，25℃下，200rpm/min搅拌20min至均匀，再加入400mL 4％的微孔淀粉溶液，200rpm/min搅拌20min至吸附，接着加入1600mL 2％的海藻酸钠溶液，200rpm/min搅拌30min搅拌均匀，用5mL的注射器，6号针头吸取得到的混合液，滴入200mL的2％的CaCl₂溶液中，固化30min成球(直到CaCl₂溶液不能固化混合液成球时，更换新的CaCl₂溶液)，将胶珠捞出，无菌水洗涤，先在-80℃的冰箱中预冻3h，最后在冷阱温度-51℃，真空度0.09毫巴，真空冷冻干燥24h，即制得瑞士乳杆菌微胶囊；

表5制备瑞士乳杆菌微胶囊的菌悬液的保护剂筛选

应用实施例1

瑞士乳杆菌微胶囊重复多批次发酵的酸奶

称取0.1g瑞士乳杆菌微胶囊，用孔径规格为≤0.2mm的不锈钢网篮包住，接种于85℃加热30min的12％的全脂牛奶100mL中，40℃培养箱中进行牛乳发酵，待牛乳发酵成熟后，将网篮提出，将其重新放入新鲜的牛奶中进行下一批次的发酵。

由表4可知，在6次重复利用试验中，胶珠的凝乳时间、pH值、酸度等都比较接近，说明胶珠在这6次重复发酵的试验中，活性并没有降低，产酸能力和pH值都没有太多变化。第1，2次相对于后面几次，其凝乳时间稍长，这与胶珠溶涨，活化有关。在第7次发酵试验中，胶珠已经破裂，不可以再重复利用。因此，利用固定化乳酸菌微胶囊重复利用发酵牛乳这一特性，不仅可以防止制品在贮藏过程中的后酸化问题，而且可提高制作酸奶的方便性与时效性，延长菌种的存活力，并可重复使用，且不易污染，既经济又方便。

结果证明，经过6次重复回收微胶囊胶珠重复发酵牛奶，经检验发酵终点的各项指标都没有太多变化。第1，2次相对于后面几次，其凝乳时间稍长，这与胶珠溶涨，活化有关，而第7次回收的微胶囊化胶珠，组织松散，胶珠老化，与发酵乳分离的过程中破裂，渗漏，不可以再重复利用。因此，微胶囊化的瑞士乳杆菌重复发酵牛乳这一特性，不仅可以防止发酵乳制品在贮藏过程中的后酸化问题，而且可提高制作酸奶的方便性，时效性，延长菌种的存活力，且不易污染，既经济又方便。

应用实施例2：瑞士乳杆菌微胶囊在制作保健品上的应用

100g瑞士乳杆菌微胶囊保健品内容物，具体做法是：

分别称取瑞士乳杆菌微胶囊65g，木瓜蛋白酶2g，菠萝蛋白酶2g，低聚果糖10g，谷氨酸钠3g，酪酸3g，琉璃苣籽3g，亚麻籽2g，卵磷脂10g，混合均匀，配制干粉冲剂，无菌充氮气包装或真空包装。

应用实施例3：瑞士乳杆菌微胶囊在制作保健品上的应用

琉璃苣籽0g，亚麻籽0g其它同应用实施例2

应用实施例4：瑞士乳杆菌微胶囊在制作保健品上的应用

分别称取瑞士乳杆菌微胶囊70g，木瓜蛋白酶3g，菠萝蛋白酶3g，低聚果糖10g谷氨酸钠1g，酪酸1g，亚麻籽2g，卵磷脂10g，混合均匀，配制成干粉冲剂，无菌充氮气包装或真空包装。

应用实施例5：

瑞士乳杆菌微胶囊在植物饮料制备中的应用，发酵苦菜制作苦菜保健饮料，具体做法是：

500g新鲜苦菜经漂洗后，加1000mL的水，榨汁，加入3000mL的鲜奶，搅拌均匀后，巴氏灭菌，冷却到40℃，再添加200g木糖醇，200g低聚糖，2g维生素E，2g铁粉，接入0.18g瑞士乳杆菌微胶囊，然后40℃发酵6.5h，可以添加天然香精调合成不同口味，或保持原味，无菌包装。产品经检验活菌数达到10⁷以上，复合国家有关酸奶的标准，拥有独特的香气，营养丰富，保健功能强，具有良好的开发前景和市场价值。

Claims

1.瑞士乳杆菌微胶囊，其特征是：利用大豆分离蛋白作为第一层包埋材料，微孔淀粉作为第二层包埋材料，海藻酸钠作为第三层包埋材料，对瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，进行三层包埋；

瑞士乳杆菌微胶囊是这样制备的：首先制备菌悬液，即将活化后的瑞士乳杆菌菌种接入优化的MRS增殖培养基，利用流加碱中和培养的方法对菌体进行增殖培养，至稳定期前期，再经离心分离收集菌体，在菌泥中加入菌体冷冻干燥保护剂，制备菌悬液，使菌体的浓度达到10¹⁰cfu/mL；然后对菌体进行三层包埋，即在上述制备的菌悬液中加入与菌悬液等体积的第一层包埋材料，包埋材料选用4％大豆分离蛋白溶液，常温下，200rpm/min搅拌20min至均匀，再等体积加入第二层包埋材料，包埋材料选用4％的微孔淀粉溶液，200rpm/min搅拌20min至吸附，接着加入2倍溶液体积的第三层包埋材料，包埋材料选用2％的海藻酸钠溶液，200rpm/min搅拌30min搅拌均匀，将得到的混合液滴入2％的CaCl₂溶液中，固化30min成球；最后进行真空冷冻干燥，即将上述制得的微球用无菌水漂洗后放在-80℃的冰箱中预冻3h，在冷阱温度-51℃，真空度0.09毫巴，真空冷冻干燥18h～24h，即制得瑞士乳杆菌微胶囊；

上述优化的MRS增殖培养基，重量百分比配方为：MRS 80％，番茄汁7.5％，麦芽汁11％，乳清粉1.5％；

所用菌体冷冻干燥保护剂，重量百分比配方为：10％的脱脂奶95％，海藻糖1.5％，甘油0.5％，山梨醇2％，麦芽糊精1％。

2.权利要求1所述的瑞士乳杆菌微胶囊的制备方法是：

最后进行真空冷冻干燥，即将上述制得的微球用无菌水漂洗后放在-80℃的冰箱中预冻3h，在冷阱温度-51℃，真空度0.09毫巴，真空冷冻干燥24h，即制得瑞士乳杆菌微胶囊。

3.按照权利要求2所述的瑞士乳杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：在制备菌悬液中，增殖培养15h。

4.权利要求1所述的瑞士乳杆菌微胶囊作为发酵剂重复发酵牛乳的应用

称取0.1g瑞士乳杆菌微胶囊，用孔径规格为≤0.2mm的不锈钢网篮包住，接种于100mL，经85℃加热30min的12％的全脂牛奶中，40℃恒温培养箱中进行牛乳发酵，待牛乳发酵成熟后，将网篮提出，重新放入新鲜的牛奶中进行下一批次的发酵。

5.权利要求1所述的瑞士乳杆菌微胶囊在制作保健品上的应用

按下述重量百分比配方称取各种物质，

瑞士乳杆菌微胶囊：50％～70％，木瓜蛋白酶：2％～3％，菠萝蛋白酶：2％～3％，低聚果糖：5％～10％谷氨酸盐：1％～3％，酪酸：1％～3％琉璃苣籽：0％～5％，亚麻籽：0％～5％，卵磷脂：5％～10％，混合均匀，配制成冲剂，无菌充氮气包装，真空包装或放入全自动胶囊灌装封口机内，制成硬胶囊。

6.权利要求1所述的瑞士乳杆菌微胶囊在植物饮料制备中的应用，发酵苦菜制作苦菜保健饮料，具体做法是：

将新鲜苦菜经漂洗后，加入1倍体积的水，榨汁，再加入3倍苦菜汁体积的鲜奶，搅拌均匀后，巴氏灭菌，冷却到40℃，然后每100mL原料中接入0.006g瑞士乳杆菌微胶囊，40℃发酵6h～7h，再添加木糖醇，低聚糖，维生素E，铁粉，使重量百分比含量分别为5％，5％，0.05％，0.05％，最后无菌包装。