CN103614332B

CN103614332B - 一种提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法

Info

Publication number: CN103614332B
Application number: CN201310566253.0A
Authority: CN
Inventors: 陈卫; 田丰伟; 胡斌; 赵建新; 张灏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: CN103614332A

Abstract

本发明公开了一种提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法，通过在培养体系中添加0.2%‑0.6%大豆磷脂，提高乳酸菌菌体的胆盐耐受能力。在MRS培养体系中添加0.6%的大豆磷脂，可将植物乳杆菌N13在0.3%胆盐环境中的存活率由20.9%提高到67.5%。在M17培养体系中添加0.6%的大豆磷脂，可将乳酸乳球菌NZ9000在0.3%胆盐环境中的存活率由32.1%提高到73.5%。在酸乳应用体系中，添加0.4%的食品级大豆磷脂，可以将发酵乳酸菌种在0.3%胆盐环境中的存活率由55.8%提高到72.3%，且改善了酸乳质构、没有不良风味，有很好应用前景。

Description

一种提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法

技术领域：

本发明涉及一种提高乳酸菌耐受能力的方法，具体的说是一种提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法。

背景技术：

乳酸菌是一类能发酵糖类经厌氧代谢主要产物为乳酸的一类细菌的总称，主要有乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、片球菌属和乳球菌属。乳酸菌是益生菌的主要来源，很多乳酸菌都具有潜在益生功能，它们可以维持肠道微生态平衡，促进机体健康，已报道的益生功能有缓解腹泻症状、降低胆固醇，改善肝脏功能，增强免疫功能，延缓衰老等。具有潜在益生功能的乳酸菌发挥益生功能的前提是：必须能够以存活的状态通过人体胃肠道。因此，常规益生菌筛选方法通过体外胆盐耐受实验淘汰胆盐耐受能力低的乳酸菌。在这一筛选淘汰过程中，必然会损失部分具有优良益生功能的菌株，造成生物资源浪费。另外，胆盐耐受能力强的益生菌在通过胃肠道时依然要损失一定的活菌数，影响益生功能效价。因此，开发提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法既是发掘生物资源的需要，也是提高功能效价的途径。然而，在现有食品生产应用中，除微胶囊技术外，尚无有效的乳酸菌耐胆盐保护方法。而乳酸菌微胶囊的添加，需对常规生产工艺进行改进和革新，还需增加对食品级壁材的安全性评价。该技术应用所带来的生产成本增加，限制了其在食品生产领域的应用。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种可提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

在常规乳酸菌液体培养基体系中添加大豆磷脂，所述大豆磷脂在液体培养基中的添加量为0.2%-0.6%（w/v）。乳酸菌培养体系为固体或粉末体系时，大豆磷脂添加量为0.6%。

该方法可应用于提高乳杆菌属和乳球菌属的乳酸菌胆盐耐受能力，且菌体生长良好并不发生菌种变化；在发酵液态乳原料体系中添加食品级大豆磷脂，所述食品级大豆磷脂在液态乳原料中添加量为0.2%-0.4%（w/v），优选0.4%。该方法可提高发酵乳制品中乳酸菌的胆盐耐受能力，且不影响产品原有风味、口感，甚至可以改善产品质构。

本发明所具有的优点：

本发明通过在培养体系中添加0.2%-0.6%的大豆磷脂，可以提高乳酸菌通过人体胃肠道时对胆盐的耐受能力，增加存活率。此外，食品级大豆磷脂是《GB2760-211食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中允许、“按生产需要适量使用”的食品添加剂，该发明可直接应用于乳酸菌发酵乳制品生产中，添加工艺简单，原辅料成本低廉、易于推广应用。

具体实施方式

实施例1

(1)培养体系制备

所述培养体系为常规乳杆菌培养基MRS液体肉汤，添加大豆磷脂后115℃灭菌20分钟。所述大豆磷脂添加量为0.6%（w/v），来自北京鸿瑞嘉盛公司。

(2)乳酸菌菌种及培养

所述乳酸菌菌种为植物乳杆菌N13，常规乳酸菌培养方法活化后接种至添加有0.6%大豆磷脂的MRS肉汤培养基中，接种量为2%（v/v），37℃厌氧培养24h。

(3)菌体胆盐耐受能力测试

离心收集培养完成的菌体，离心条件为8000g，10min。将收集的菌体重悬于含有0.3%（w/v）胆盐的MRS肉汤培养基中室温处理60min。倾注平板法计数处理前后的活菌数，并计算存活率。存活率=Lg(N_t)/Lg(N₀)×100%，（N_t为胆盐处理60min后每毫升菌液含活菌数量，N₀为胆盐处理前每毫升菌液含活菌数量）。另外，以未添加大豆磷脂的MRS肉汤培养体系作为对照组，计算对照组菌体胆盐处理存活率。

(4)测试结果

实验组（MRS+大豆磷脂）培养完成后菌体浓度为6.78×10⁸cfu/ml，对照组（MRS）培养完成后菌体浓度为6.52×10⁸cfu/ml，实验组与对照组培养效果相近，表明在MRS液体肉汤中添加0.6%大豆磷脂并未影响菌体生长。

实验组菌体在0.3%胆盐中处理60min后存活率为67.5%，而对照组菌体存活率为20.9%，由此可见，在MRS肉汤培养体系中添加0.6%大豆磷脂，植物乳杆菌N13的菌体胆盐耐受能力得到了显著提高。

实施例2

1.培养体系制备

所述培养体系为常规乳球菌培养基M17液体肉汤，添加大豆磷脂后115℃灭菌20分钟。所述大豆磷脂添加量为0.6%（w/v），来自北京鸿瑞嘉盛公司。

2.乳酸菌菌种及培养

所述乳酸菌菌种为乳酸乳球菌NZ9000，常规乳酸菌培养方法活化后接种至添加有0.6%大豆磷脂的M17肉汤培养基中，接种量为2%（v/v），37℃厌氧培养24h。

3.菌体胆盐耐受能力测试

离心收集培养完成的菌体，离心条件为8000g，10min。将收集的菌体重悬于含有0.3%（w/v）胆盐的M17肉汤培养基中室温处理60min。倾注平板法计数处理前后的活菌数，并计算存活率。存活率=Lg(N_t)/Lg(N₀)×100%，（N_t为胆盐处理60min后每毫升菌液含活菌数量，N₀为胆盐处理前每毫升菌液含活菌数量）。另外，以未添加大豆磷脂的M17肉汤培养体系作为对照组，计算对照组菌体胆盐处理存活率。

4.测试结果

实验组（M17+大豆磷脂）培养完成后菌体浓度为7.33×10⁸cfu/ml，对照组（M17）培养完成后菌体浓度为7.24×10⁸cfu/ml，实验组与对照组培养效果相近，表明在M17液体肉汤中添加0.6%大豆磷脂并未影响菌体生长。

实验组菌体在0.3%胆盐中处理60min后存活率为73.5%，而对照组菌体存活率为32.1%，由此可见，在M17肉汤培养体系中添加0.6%大豆磷脂，乳酸乳球菌NZ9000的菌体胆盐耐受能力得到了显著提高。

实施例3

2）培养体系制备

所述培养体系为添加有5%（w/v）蔗糖的全脂复原乳，添加食品级大豆磷脂后用组织粉碎机在95℃高速剪切10min，再用均质机均质，使得大豆磷脂与全脂乳形成稳定乳化体系。95℃巴士杀菌10分钟。所述蔗糖来自中粮集团生产的幼砂糖。所述全脂复原乳由雀巢全脂乳粉按12%（w/v）比例加水复原所得。所述食品级大豆磷脂添加量为0.4%（w/v），来自北京鸿瑞嘉盛公司。

3）乳酸菌菌种及培养

所述乳酸菌菌种为酸乳直投式发酵剂，来自杜邦丹尼斯克公司，接种量为0.3%（w/w），42℃培养5h。

4）菌体胆盐耐受能力测试

将发酵完成的酸乳与0.6%（w/v）胆盐水溶液等体积混合，在室温处理60min。用MRS固体培养基倾注平板法计数处理前后的活菌数，并计算存活率。存活率=Lg(N_t)/Lg(N₀)×100%，（N_t为胆盐处理60min后每毫升菌液含活菌数量，N₀为胆盐处理前每毫升菌液含活菌数量）。另外，以未添加大豆磷脂的含糖全脂复原乳培养体系作为对照组，计算对照组菌体胆盐处理存活率。

5）酸乳豆腥味测试和脱水收缩性测试

所述食品级大豆磷脂具有一定的豆腥味，其合理的添加量应不会对酸乳的风味产生影响。因此需测试酸乳的豆腥味，鉴评小组由5名女性、5名男性大学生自愿者组成，年龄在20-23岁，10名志愿者为经常饮用发酵乳且全部分成员接受过《食品感官鉴评》课程的培训。操作过程为：首先轻轻搅动酸乳，通过嗅闻判定气味强度；接着，品尝样品，评价风味；最后，吞咽样品10s后，评价余味。以市售原味酸乳和原味豆浆为标准，其豆腥味分别记为0和10，评价实验组酸乳的豆腥味。另外，以未添加大豆磷脂的含糖全脂复原乳培养体系作为对照组，评价其豆腥味。

所述食品级大豆磷脂是一种乳化剂，能够提高食品体系的稳定性。脱水收缩性是酸乳质构稳定性的重要指标，因此测试此指标反映食品级大豆磷脂的添加对酸乳质构的影响。称取15.0g酸乳样品，置于带有滤纸的漏斗中，20℃放置90min，收集滤液并称重。脱水收缩性（%）=（滤液重g/样品重量g）×100%，脱水收缩性越低，酸乳体系质构越稳定。另外，以未添加大豆磷脂的含糖全脂复原乳培养体系作为对照组，评价其脱水收缩性。

6）测试结果

实验组（含糖全脂乳+食品级大豆磷脂）发酵剂菌体在0.3%胆盐中处理60min后存活率为72.3%，而对照组菌体存活率为55.8%，由此可见，在含糖全脂乳培养体系中添加0.4%食品级大豆磷脂，发酵剂乳酸菌的菌体胆盐耐受能力得到了显著提高。

实验组（含糖全脂乳+食品级大豆磷脂）酸乳其豆腥味评分为2，脱水收缩率为48.13%，对照组酸乳其豆腥味评分为0，脱水收缩率为54.27%。由此可见，在含糖全脂乳培养体系中添加0.4%食品级大豆磷脂，并未对酸乳风味产生明显影响，而且还提高了酸乳体系质构的稳定性。

实施例4

7）培养体系制备

所述培养体系为常规乳杆菌培养基MRS液体肉汤和乳球菌培养基M17液体肉汤，添加大豆磷脂后115℃灭菌20分钟。所述大豆磷脂添加量为0.6%（w/v），来自北京鸿瑞嘉盛公司。

2.乳酸菌菌种及培养

所述乳酸菌菌种为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，常规乳酸菌培养方法活化后分别接种至添加有0.6%大豆磷脂的MRS肉汤培养基和M17肉汤培养基中，接种量为2%（v/v），37℃厌氧培养24h。

3.冻干直投式酸乳发酵剂的制备

将培养完成的菌液在4℃，离心力为8000×g的条件下离心10min，去上清，菌泥用无菌生理盐水洗涤2次后，以1:1的菌数比例混合，加入等体积的保护剂溶液，保护剂成分的浓度分别为海藻糖10%(w/v)、谷氨酸钠2%(w/v)、大豆磷脂0.6%(w/v)和脱脂乳10%(w/v)，将含有保护剂的菌悬液分别分装在无菌西林瓶中，每瓶1mL，盖上无菌橡胶塞，放入-70℃超低温冰箱中进行预冻，预冻时间4h。将预冻好的菌体，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-50℃，真空度为4Pa，时间为48h。冷冻干燥结束后，进行真空压盖，样品备用。

4.菌体冻干后存活率和胆盐耐受能力测试

将冻干后的菌粉用无菌生理盐水复水至冻干前相同体积，利用MRS倾注平板计数法检测冻干前后菌体数量，冻干存活率=NA/NB×100%计算存活率，（NA为冻干后每毫升菌液含活菌数量，NB为冻干前每毫升菌液含活菌数量）。另外，以未添加大豆磷脂的保护剂配方作为对照组，计算对照组菌体冻干存活率。

在复水后的冻干菌体中加入等体积的含有0.6%（w/v）胆盐的MRS肉汤培养基中室温处理60min。倾注MRS平板法计数处理前后的活菌数，并计算耐胆盐存活率。耐胆盐存活率=Lg(Nt)/Lg(N0)×100%，（Nt为胆盐处理60min后每毫升菌液含活菌数量，N0为胆盐处理前每毫升菌液含活菌数量）。另外，以未添加大豆磷脂的MRS肉汤培养体系作为对照组，计算对照组菌体胆盐处理存活率。

5.测试结果

冻干菌粉实验组（保护剂+食品级大豆磷脂）冻干存活率为96.3%，而对照组（仅含有保护剂）存活率为90.2%。冻干菌粉实验组菌体（培养体系中添加食品级大豆磷脂）在0.3%胆盐中处理60min后存活率为83.8%，而对照组菌（培养体系中未添加食品级大豆磷脂）体存活率为45.8%，由此可见，在培养体系和冻干保护剂中添加食品级大豆磷脂，不但能够提高发酵剂菌体的胆盐耐受能力，还能提高菌体在冷冻干燥过程中的存活率。

Claims

1.一种提高乳酸菌胆盐耐受能力的方法，其特征在于：在乳酸菌培养体系中加入0.2％-0.6％(w/v)大豆磷脂；其中大豆磷脂的总磷脂含量不低于95％，HLB值为7。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳酸菌培养体系为固体或粉末体系时，大豆磷脂添加量为0.6％。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于：在乳酸菌食品培养体系中添加0.2％-0.4％食品级大豆磷脂。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于：所述食品级大豆磷脂添加量为0.4％。