CN114223795A - 一种仔猪用益生菌饲料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仔猪用益生菌饲料的制备方法，包括：制备饲料混合料；制备益生菌制剂，益生菌制剂为四层包被结构，由内向外包括内层包被层、中间脂质包被层、阻隔膜和外部包被胶囊；制备改性明胶，取制得的12～18份改性明胶加入的去离子水中，搅拌加热，进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却，得到具有强粘附能力的明胶‑饲料胶状混合物；将明胶‑饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料。本发明用具有阻隔膜的益生菌制剂替代饲料中抗生素的添加，饲料与益生菌之间具有良好的粘接效果，益生菌制剂还具有定点释放和增殖的特点，实现了仔猪肠道菌落调节的目的。

Description

一种仔猪用益生菌饲料的制备方法
技术领域
本发明属于生物饲料技术领域，更具体地说，本发明涉及一种仔猪用益生菌饲料的制备方法。
背景技术
在猪饲料中添加抗生素是以前饲料生产的常用手段，抗生素作为添加剂的饲料可以有效预防和治疗常见猪患病，还能够增加仔猪的生长品质，因此人们为了追求养猪生产效益的最大化，开发了多种带有抗生素的饲料。随着人们对抗生素认识的不断深入和对食品安全的日益关注，发现抗生素对猪和人以及环境都会造成危害。例如，抗生素的耐药性和抗生素残留等负面问题逐渐突出，抗生素还会打破猪群体内原有的微生态平衡，正常情况下，猪体内既有有害细菌也有有益细菌，正常情况下有益细菌压制着有害细菌的生长，所以猪群不会发病。当给猪饲喂添加有抗生素的饲料时，抗生素在猪体内杀死有害细菌的同时，也会杀死有益细菌，从而打破了猪体内的微生物平衡，甚至引起新的感染。因此，目前各国都严格限制抗生素在猪饲料的使用。
为了避免抗生素的添加导致猪肠道微生物失衡的发生，需要替代掉饲料中的抗生素，同时这种替代物在猪肠道内能够起到与抗生素相同的作用，并且不会影响猪肠道内的微生物平衡。将益生菌制剂添加到饲料中，不但可以用益生菌替代抗生素，使得益生菌起到抗生素的作用，还能够增强猪肠道内微生物平衡。但是直接将益生菌通过暴露方式与饲料原料进行组合，不仅益生菌容易在进入肠道前失活，还容易对饲料的长时间保存造成影响。因此，目前常规选用益生菌包被技术替代抗生素的添加。此外，运用益生菌替代抗生素还需要解决以下问题。
人和动物的消化道中寄居着大量的微生物(超过99％是细菌)，它们与宿主形成稳定的共生关系，能够帮助宿主分解膳食纤维等宿主自身难以消化的营养素、抵御外来有害菌的侵袭、产生有益于宿主健康的代谢物、促进和维持肠道健康、有助于免疫系统的形成、并直接或间接影响宿主的能量稳态和生理稳定。
仔猪早期阶段生长速度快，是各种器官功能发育的关键阶段、决定了后期的生长和生产性能。在此期间，猪肠道菌的数量和多样性都大幅提升，肠道菌的演替和变化同猪的肠道发育、健康水平、消化和免疫功能具有密切联系。仔猪断奶时，食物类型的转化及其引发的应激反应会引起一定时间内仔猪肠道健康功能下降和肠道菌群组成的明显变化。在这期间，仔猪腹泻率明显升高，生长性能下降，乳酸菌等益生菌的数量和比例大幅度降低，这些都会影响猪的健康和生长。改善和维持肠道健康，促进肠道微生态区系的稳定和平衡是保障仔猪早期快速生长的关键因素之一。为了维持动物的健康并在不使用抗生素的情况下减少断奶造成的不利影响，畜牧生产中经常使用益生菌等添加剂来刺激肠道菌群，使其达到最佳的微生态平衡。
益生菌又称益生素，是由Parker于1947年首次提出，益生菌包括多种对人体和动物体有益的细菌或真菌，主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌和罗伊氏乳酸杆菌等。益生菌制剂中的益生菌可以产生水解酶、发酵酶和呼吸酶，这些酶有利于降解饲料中的蛋白质、脂肪和较复杂的碳水化合物，并且益生菌制剂具有无毒副作用且具有调节肠道菌群平衡、促进动物生长，提高饲料转化率和增仔猪机体免疫功能等优点。
随着现在养猪规模的扩大，为了减少养殖风险，增加养殖收益，就要为仔猪提供更好的生长环境，提高仔猪的免疫力和生长性能。因此，益生菌制剂就成为了仔猪生长过程中极佳的肠道菌落调节制剂。但是由于益生菌本省存在一些不利因素，例如抑菌效果参差不齐，在菌种发酵过程中通常会伴有一些有害细菌的生长，导致制得的益生菌制剂仔猪食用后，仔猪腹泻乃至发病；同时，由于各个益生菌在猪消化道内的优势分布部位不同，例如十二指肠内优势菌群依次为双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌，回肠内优势菌群依次为双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌和乳酸杆菌，盲肠内优势菌群依次为双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌和乳酸杆菌，直肠内优势菌群依次为双歧杆菌乳酸杆菌、肠球菌和肠杆菌，可见大部分益生菌的优势繁殖生长区域在十二指肠以后的消化道中，而消化道内存在胃肠液、胆汁分泌以及抗生素残留，益生菌制剂进入仔猪消化道后，益生菌会由于不耐受而失活，这就是为什么益生菌制剂在实际运用中达不到实验中的良好效果。因此，目前为了避免益生菌制剂中的益生菌因由于胆汁和胃酸消化液作用而失活，普遍对益生菌制剂采取了益生菌包被技术，即在益生菌外面包埋包被膜或胶囊，最为常用的包被方式是三层包被技术。三层包被技术中的第一层由生物分子聚合物构成，用于抵挡强酸性的胃酸侵蚀，第二层由脂质类物质构成，用于低挡弱碱性的胆汁侵蚀，第三层由保护剂构成，用于使益生菌定点释放并增殖，大幅度提高益生菌存活率。但是，由于仔猪的胃酸呈强酸性，其pH值介于2到3之间，而益生菌制剂会在仔猪胃中停留较长的时间，因此最外层的生物分子聚合物被胃酸侵蚀后，第二层的脂质类物质随即就会被胃酸侵蚀，这样益生菌制剂在没有遇到胆汁之前就失去了第二层包被层的保护，导致了益生菌在没有进入肠道之前就失去活性，益生菌制剂的作用就会大打折扣。因此为了防止第二层脂质类物质提前被胃酸侵蚀，就需要对益生菌制剂的三层包被方式进行改进。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种仔猪用益生菌饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，15～30份玉米粉，10～26份大豆粉，20～42份脱脂奶粉，1～15份乳清粉，1～3份鱼粉，2～10份葡萄糖，0.2～0.5份碳酸钙，0.1～0.2份磷酸氢钙，0.1～0.25份食盐，2～9份肉骨粉，3～10份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备改性明胶，取制得的12～18份改性明胶加入20～58份的去离子水中，搅拌加热至45～55℃后进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的30～36份饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至2～4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤三、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
优选的是，其中，所述步骤二中，改性明胶的制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取1.5～2份魔芋胶，8～10份明胶，2～3份玉米淀粉和0.3～0.6份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入120～140份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应20～36min；
步骤S32、向步骤S31反应后的混合溶液中加入玉米淀粉，搅拌均匀后，水浴加热至40～50℃，保温1～2.5h后，进行蒸发浓缩，将混合溶液蒸发为含水量在12～16％的胶状混合物，便制备得到改性明胶。
优选的是，其中，所述步骤三中，益生菌制剂的制备方法包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.3～1.5份，植酮1～2份，酵母粉2～6份，肝浸出物2～5份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2～4份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1～2份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45～50℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层；
步骤S24、制备阻隔膜；
步骤S25、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.2～0.6份的黄原胶，0.18～0.26份的海藻酸钠，1.3～1.8份的液体石蜡，1.3～1.66份的淀粉，将各物质加入10～12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S26、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤四制得的阻隔膜包埋在中间脂质层的外部，最后将步骤S25制得的外部包被胶囊包埋在阻隔膜的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
优选的是，其中，所述步骤S24制备阻隔膜的方法包括：按重量份称取1～2份的纳米淀粉微球和0.08～0.1份的纳米二氧化硅粉末，将纳米淀粉微球溶解于无菌水中，先搅拌10～25min，再在600～1100rmp转速下离心2～5h，然后将纳米二氧化硅粉末加入至无菌水中，向混有纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末的无菌水中加入交联剂，交联时间1～1.3h，然后向交联后的溶液中依次加入食用明胶0.4～0.6份，羧甲基纤维素钠0.8～1份，赖氨酸0.05～0.06份，再次搅拌1h，搅拌速率为250～300rmp；对搅拌后的混合溶液进行蒸发浓缩，直至含水量低于26％，得到胶状阻隔膜粗料；随后对蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料进行改性，得到阻隔膜。
优选的是，其中，所述步骤S21中的益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.2～0.6∶1.3；
所述步骤S23中的交联剂为氯化钙、柠檬酸钠、柠檬酸钾或三偏磷酸钠中的一种。
优选的是，其中，对胶状阻隔膜粗料进行改性的方法包括：
步骤S241、将蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料平铺在细孔板表面，平铺厚度小于1mm，细孔板上开设有致密的小孔，小孔孔径为0.1～0.2mm；
步骤S242、在细孔板的下方放置一个中空的通气板，通气板的长、宽与细孔板相同，通气板的上表面开设有与细孔板小孔孔径一致的出气孔，将储存有氮气的气管与通气板连通，氮气从通气板的上表面逸出，并迅速透过胶状阻隔膜粗料，在胶状阻隔膜粗料中贯穿形成气孔，氮气的通气时间为25～40min；在氮气通过通气板向上流动的同时，使用加热棒放置在通气板的底部，对通气板进行加热，加热温度不高于80℃；
步骤S243、使用表面光滑的平板缓慢压平胶状阻隔膜粗料，使胶状阻隔膜粗料表面保持平整；
步骤S244、将表面平整过的胶状阻隔膜粗料件低温冷冻，冷冻温度为﹣12～﹣4℃，冷冻时间为2h。
优选的是，其中，所述步骤S21中对益生菌进行培养发酵的方法包括：
步骤S211、对筛选得到的益生菌进行活化，将益生菌采用划线接种的方式接种于活化培养基上，在37℃的温度下活化培养24～30h；
步骤S212、将活化培养的益生菌接种于液体培养基中，在37℃下兼性厌氧培养24～30h，得到益生菌发酵液；
步骤S213、在2500rmp转速下，对步骤S12制得的益生菌发酵液进行离心，离心时间为12～25min，静置后将下层沉淀滤除，取下层清液接种于灭菌后的发酵培养基中，并将发酵培养基放图发酵罐中，进行厌氧发酵，发酵时间为24～30h；
步骤S214、将经过步骤S12发酵后的益生菌发酵液低温冷冻干燥，得到益生菌菌泥。
优选的是，其中，所述步骤S23制备中间脂质层的方法包括：按重量份称取0.6～0.65份的甘油三酯，0.12～0.16份的鞘磷脂，1～2份的壳聚糖，3～6份的大豆粉以及0.1～0.22份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在20～35rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入2～5份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料。
优选的是，其中，所述步骤S22制备内层包被层时，加入有崩解剂，崩解剂与胰蛋白胨的重量比为1比20，崩解剂为微晶纤维、羧甲基纤维素钠中的一种。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明提供的一种仔猪用益生菌饲料的制备方法用具有阻隔膜的益生菌制剂替代饲料中抗生素的添加，饲料与益生菌之间具有良好的粘接效果，益生菌制剂还具有定点释放和增殖的特点，实现了仔猪肠道菌落调节的目的。
2、本发明提供的一种仔猪用益生菌饲料，使用魔芋胶、淀粉和三乙醇胺对明胶进行共混改性，提高了明胶的粘附能力，使得改性明胶与饲料混合料混合后较强的粘附性，实现明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的稳定粘附，使得制备得到的益生菌饲料不会发生表面干脱，产生粉屑的现象，确保了饲料颗粒的完整性和产品的品质；同时，经过魔芋胶、淀粉和三乙醇胺共混改性的明胶与饲料混合料混合后不仅可以实现与益生菌制剂的稳定粘附，给仔猪饲喂益生菌饲料后，经过仔猪唾液和消化液作用，改性明胶的粘附能力减弱，这样益生菌饲料表面的饲料混合料就能够从益生菌制剂表面脱落，饲料混合料和益生菌制剂在仔猪的消化道中分离，饲料中的营养物质经过消化道消化吸收，而益生菌制剂中的益生菌进入大肠等优势增殖地点释放、增殖。
3、本发明提供的益生菌饲料中的益生菌制剂对传统的三层包被技术进行改进，在中间脂质包被层与外部包被胶囊之间使用阻隔膜，并且阻隔膜的主要成分为纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末，并对制得对胶状的阻隔膜粗料进行了改性处理，这样制得的益生菌制剂在最外层的外部包被胶囊被胃酸侵蚀后，阻隔膜可以延缓仔猪胃酸对中间脂质包被层的侵蚀，对内层包被层中的益生菌进行了有效的保护，确保了益生菌的存活数量，使得大部分益生菌可以到达仔猪肠道中进行定点释放和增殖，以实现对仔猪肠道菌落调节改善的目的。通过氮气对阻隔膜粗料进行改性，是由于纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末经过交联剂交联后，其成膜会比较致密，当其包埋中间脂质层后，脂质消化可能无法完全消化掉其中的纳米淀粉微球，导致益生菌无法在肠道中定点释放；经过氮气改性后，氮气贯穿阻隔膜粗料，使得阻隔膜粗液形成了大量气孔，这样胆汁、肠液就可以将纳米淀粉微球完全消化，益生菌也能够在肠道中定点释放。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
通过胃液模拟试验检测益生菌制剂经过胃酸消化后的活菌数量，胃液模拟试验使用的试剂配制方法为：将0.1kg/L氯化氢溶液16.4mL溶解800mL水，加入10g胃蛋白酶(1000NFU/mg)，调节pH至2.0-3.0，定容至1000mL；0.22微米无菌过滤器过滤除菌备用。
实施例1
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，15份玉米粉，10份大豆粉，20份脱脂奶粉，1份乳清粉，1份鱼粉，2份葡萄糖，0.2份碳酸钙，0.1份磷酸氢钙，0.1份食盐，2份肉骨粉，3份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备益生菌制剂，所述益生菌制剂为四层包被结构，由内向外包括内层包被层、中间脂质包被层、阻隔膜和外部包被胶囊，具体步骤包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥，益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，且罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.2∶1.3；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.3份，作为崩解剂的微晶纤维0.065份，植酮1份，酵母粉2份，肝浸出物2份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层，具体方法包括：按重量份称取0.6份的甘油三酯，0.12份的鞘磷脂，1份的壳聚糖，3份的大豆粉以及0.1份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在20rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入2份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料；
步骤S24、制备阻隔膜，具体方法包括：按重量份称取1份的纳米淀粉微球和0.08份的纳米二氧化硅粉末，将纳米淀粉微球溶解于无菌水中，先搅拌10min，再在600rmp转速下离心2h，然后将纳米二氧化硅粉末加入至无菌水中，向混有纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末的无菌水中加入氯化钙，交联时间1h，然后向交联后的溶液中依次加入食用明胶0.4份，羧甲基纤维素钠0.8份，赖氨酸0.05份，再次搅拌1h，搅拌速率为250rmp；对搅拌后的混合溶液进行蒸发浓缩，直至含水量低于26％，得到胶状阻隔膜粗料；随后对蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料进行改性，改性方法包括：将蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料平铺在细孔板表面，平铺厚度为0.8mm，细孔板上开设有致密的小孔，小孔孔径为0.1mm；在细孔板的下方放置一个中空的通气板，通气板的长、宽与细孔板相同，通气板的上表面开设有与细孔板小孔孔径一致的出气孔，将储存有氮气的气管与通气板连通，氮气从通气板的上表面逸出，并迅速透过胶状阻隔膜粗料，在胶状阻隔膜粗料中贯穿形成气孔，氮气的通气时间为25min；使用表面光滑的平板缓慢压平胶状阻隔膜粗料，使胶状阻隔膜粗料表面保持平整；将表面平整过的胶状阻隔膜粗料件低温冷冻，冷冻温度为﹣12℃，冷冻时间为2h，得到阻隔膜；
步骤S25、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.2份的黄原胶，0.18份的海藻酸钠，1.3份的液体石蜡，1.4份的淀粉，将上述物质加入12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S26、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤S24制得的阻隔膜包埋在中间脂质层的外部，最后将步骤S25制得的外部包被胶囊包埋在阻隔膜的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
步骤三、制备改性明胶，制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取1.5份魔芋胶，8份明胶，2份玉米淀粉和0.3份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入120份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应20min；
步骤S32、向步骤S31反应后的混合溶液中加入玉米淀粉，搅拌均匀后，水浴加热至40℃，保温1h后，进行蒸发浓缩，将混合溶液蒸发为含水量在12％的胶状混合物，便制备得到改性明胶；
取制得的12份改性明胶加入20份的去离子水中，搅拌加热至45℃后进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的30份饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤四、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
进行模拟胃液试验：将1g步骤二制得的仔猪用益生菌制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养2h，在0、2h稀释涂布计数，计算存活率为94％。
使用活菌计数法计数，检测本实施例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂中各菌种的初始活菌数，在4℃下保存100天，再检测100天后各菌种的活菌数，结果如下表所示。
Figure BDA0003423877140000101
实施例2
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，30份玉米粉，26份大豆粉，42份脱脂奶粉，15份乳清粉，3份鱼粉，10份葡萄糖，0.5份碳酸钙，0.2份磷酸氢钙，0.25份食盐，9份肉骨粉，10份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备益生菌制剂，所述益生菌制剂为四层包被结构，由内向外包括内层包被层、中间脂质包被层、阻隔膜和外部包被胶囊，具体步骤包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥，益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，且罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.5∶1.3；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.5份，作为崩解剂的微晶纤维0.075份，植酮1份，酵母粉3份，肝浸出物3份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2.5份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层，具体方法包括：按重量份称取0.6份的甘油三酯，0.15份的鞘磷脂，1.5份的壳聚糖，4份的大豆粉以及0.2份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在30rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入4份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料；
步骤S24、制备阻隔膜，具体方法包括：按重量份称取1.8份的纳米淀粉微球和0.1份的纳米二氧化硅粉末，将纳米淀粉微球溶解于无菌水中，先搅拌20min，再在800rmp转速下离心5h，然后将纳米二氧化硅粉末加入至无菌水中，向混有纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末的无菌水中加入氯化钙，交联时间1h，然后向交联后的溶液中依次加入食用明胶0.6份，羧甲基纤维素钠0.9份，赖氨酸0.06份，再次搅拌1h，搅拌速率为270rmp；对搅拌后的混合溶液进行蒸发浓缩，直至含水量低于26％，得到胶状阻隔膜粗料；随后对蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料进行改性，改性方法包括：将蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料平铺在细孔板表面，平铺厚度为0.6mm，细孔板上开设有致密的小孔，小孔孔径为0.11mm；在细孔板的下方放置一个中空的通气板，通气板的长、宽与细孔板相同，通气板的上表面开设有与细孔板小孔孔径一致的出气孔，将储存有氮气的气管与通气板连通，氮气从通气板的上表面逸出，并迅速透过胶状阻隔膜粗料，在胶状阻隔膜粗料中贯穿形成气孔，氮气的通气时间为33min；使用表面光滑的平板缓慢压平胶状阻隔膜粗料，使胶状阻隔膜粗料表面保持平整；将表面平整过的胶状阻隔膜粗料件低温冷冻，冷冻温度为﹣10℃，冷冻时间为2h，得到阻隔膜；
步骤S25、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.5份的黄原胶，0.22份的海藻酸钠，1.5份的液体石蜡，1.5份的淀粉，将上述物质加入12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S26、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤S24制得的阻隔膜包埋在中间脂质层的外部，最后将步骤S25制得的外部包被胶囊包埋在阻隔膜的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
步骤三、制备改性明胶，制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取2份魔芋胶，10份明胶，3份玉米淀粉和0.6份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入140份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应36min；
步骤S32、向步骤S31反应后的混合溶液中加入玉米淀粉，搅拌均匀后，水浴加热至50℃，保温2.5h后，进行蒸发浓缩，将混合溶液蒸发为含水量在12％的胶状混合物，便制备得到改性明胶；
取制得的15份改性明胶加入50份的去离子水中，搅拌加热至55℃后进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的35份饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤四、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
进行模拟胃液试验：将1g步骤二制得的仔猪用益生菌制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养2h，在0、2h稀释涂布计数，计算存活率为96％。
使用活菌计数法计数，检测本实施例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂中各菌种的初始活菌数，在4℃下保存100天，再检测100天后各菌种的活菌数，结果如下表所示。
Figure BDA0003423877140000121
对比例1
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，15份玉米粉，10份大豆粉，20份脱脂奶粉，1份乳清粉，1份鱼粉，2份葡萄糖，0.2份碳酸钙，0.1份磷酸氢钙，0.1份食盐，2份肉骨粉，3份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备益生菌制剂，所述益生菌制剂为三层包被结构，由内向外包括内层包被层、中间脂质包被层和外部包被胶囊，具体步骤包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥，益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，且罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.5∶1.3；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.5份，作为崩解剂的微晶纤维0.075份，植酮1份，酵母粉3份，肝浸出物3份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2.5份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层，具体方法包括：按重量份称取0.6份的甘油三酯，0.15份的鞘磷脂，1.5份的壳聚糖，4份的大豆粉以及0.2份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在30rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入4份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料；
步骤S24、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.5份的黄原胶，0.22份的海藻酸钠，1.5份的液体石蜡，1.5份的淀粉，将上述物质加入12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S25、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤S24制得的外部包被胶囊包埋在中间脂质层的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
步骤三、制备改性明胶，制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取1.5份魔芋胶，8份明胶，2份玉米淀粉和0.3份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入120份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应20min；
步骤S32、向步骤S31反应后的混合溶液中加入玉米淀粉，搅拌均匀后，水浴加热至40℃，保温1h后，进行蒸发浓缩，将混合溶液蒸发为含水量在12％的胶状混合物，便制备得到改性明胶；
取制得的12份改性明胶加入20份的去离子水中，搅拌加热至45℃后进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的30份饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤四、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
进行模拟胃液试验：将1g本对比例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养2h，在0、2h稀释涂布计数，计算存活率为67％。
使用活菌计数法计数，检测本对比例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂中各菌种的初始活菌数，在4℃下保存100天，再检测100天后各菌种的活菌数，结果如下表所示。
Figure BDA0003423877140000141
对比例2
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，30份玉米粉，26份大豆粉，42份脱脂奶粉，15份乳清粉，3份鱼粉，10份葡萄糖，0.5份碳酸钙，0.2份磷酸氢钙，0.25份食盐，9份肉骨粉，10份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备益生菌制剂，所述益生菌制剂为三层包被结构，由内向外包括内层包被层、中间脂质包被层和外部包被胶囊，具体步骤包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥，益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，且罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.5∶1.3；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.5份，作为崩解剂的微晶纤维0.075份，植酮1份，酵母粉3份，肝浸出物3份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2.5份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层，具体方法包括：按重量份称取0.6份的甘油三酯，0.15份的鞘磷脂，1.5份的壳聚糖，4份的大豆粉以及0.2份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在30rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入4份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料；
步骤S24、制备阻隔膜，具体方法包括：按重量份称取1.8份的纳米淀粉微球和0.1份的纳米二氧化硅粉末，将纳米淀粉微球溶解于无菌水中，先搅拌20min，再在800rmp转速下离心5h，然后将纳米二氧化硅粉末加入至无菌水中，向混有纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末的无菌水中加入氯化钙，交联时间1h，然后向交联后的溶液中依次加入食用明胶0.6份，羧甲基纤维素钠0.9份，赖氨酸0.06份，再次搅拌1h，搅拌速率为270rmp；对搅拌后的混合溶液进行蒸发浓缩，直至含水量低于26％，得到胶状阻隔膜粗料；随后对蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料进行改性，改性方法包括：将蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料平铺在细孔板表面，平铺厚度为0.6mm，细孔板上开设有致密的小孔，小孔孔径为0.11mm；在细孔板的下方放置一个中空的通气板，通气板的长、宽与细孔板相同，通气板的上表面开设有与细孔板小孔孔径一致的出气孔，将储存有氮气的气管与通气板连通，氮气从通气板的上表面逸出，并迅速透过胶状阻隔膜粗料，在胶状阻隔膜粗料中贯穿形成气孔，氮气的通气时间为33min；使用表面光滑的平板缓慢压平胶状阻隔膜粗料，使胶状阻隔膜粗料表面保持平整；将表面平整过的胶状阻隔膜粗料件低温冷冻，冷冻温度为﹣10℃，冷冻时间为2h，得到阻隔膜；
步骤S25、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.5份的黄原胶，0.22份的海藻酸钠，1.5份的液体石蜡，1.5份的淀粉，将上述物质加入12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S26、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤S24制得的阻隔膜包埋在中间脂质层的外部，最后将步骤S25制得的外部包被胶囊包埋在阻隔膜的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
步骤三、制备改性明胶，制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取2份魔芋胶，10份明胶，3份玉米淀粉和0.6份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入140份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应36min；
步骤S32、取15份明胶加入50份的去离子水中，搅拌加热至55℃后进行保温，得到明胶溶液；将制备得到的35份饲料混合料与明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤四、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
进行模拟胃液试验：将1g本对比例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养2h，在0、2h稀释涂布计数，计算存活率为59％。
使用活菌计数法计数，检测本对比例步骤二制得的仔猪用益生菌制剂中各菌种的初始活菌数，在4℃下保存100天，再检测100天后各菌种的活菌数，结果如下表所示。
Figure BDA0003423877140000161
选取250头体质状况良好，日龄为30日的仔猪，随机平均分为5组，即每组50头仔猪；使用实施例1、实施例2、对比例1和对比例2制得的益生菌饲料分别喂养一组仔猪，连续喂养40天，实施例1制得的益生菌饲料喂养的仔猪记为试验组Ⅰ，实施例2制得的益生菌饲料喂养的仔猪记为试验组Ⅱ，对比例1制得的益生菌饲料喂养的仔猪记为试验组Ⅲ，对比例2制得的益生菌饲料喂养的仔猪记为试验组Ⅳ；另外50头仔猪喂养同等质量的基础日粮，作为对照组；每组仔猪均采用圈养方式分开喂养，自由采食，提供充足的光照、饮水和相同的通风条件，圈舍温度保持在20～25℃。记录仔猪的腹泻率、发病率和平均日增重；其中，腹泻率(％)＝[总腹泻次数/(每组仔猪头数×试验天数)]×100％；
发病率(％)＝[总发病次数/(每组仔猪头数×试验天数)]×100％；
平均日增重＝(每组饲喂结束仔猪总重量－每组饲喂前仔猪总重量)/每组仔猪头数；
结果见下表：
腹泻率(％) 发病率(％) 平均日增重(kg)
试验组Ⅰ 2.1 2.3 0.65
试验组Ⅱ 2.4 2.5 0.63
试验组Ⅲ 5.9 7.5 0.44
试验组Ⅳ 3.7 3.5 0.53
对照组 6.8 8.3 0.40
结果表明，实施例1、实施例2制得的益生菌饲料可以有效降低仔猪的腹泻率和发病率，显著提高了仔猪的平均日增重量；同时，对比例2为有阻隔膜但未使用改性明胶制备得到的益生菌饲料，饲喂对比例2制得益生菌饲料的试验组Ⅳ，其腹泻率和发病率也均较对照组和试验组Ⅲ低，平均日增重较对照组和试验Ⅲ组高。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备饲料混合料，饲料的原料包括：按重量份计，15～30份玉米粉，10～26份大豆粉，20～42份脱脂奶粉，1～15份乳清粉，1～3份鱼粉，2～10份葡萄糖，0.2～0.5份碳酸钙，0.1～0.2份磷酸氢钙，0.1～0.25份食盐，2～9份肉骨粉，3～10份鱼肝油；将各原料在反应釜中搅拌混合均匀，得到饲料混合料；
步骤二、制备改性明胶，取制得的12～18份改性明胶加入20～58份的去离子水中，搅拌加热至45～55℃后进行保温，得到改性明胶溶液；将制备得到的30～36份饲料混合料与改性明胶溶液搅拌混合，蒸发浓缩，然后冷却至2～4℃，得到具有强粘附能力的明胶-饲料胶状混合物；
步骤三、将明胶-饲料胶状混合物包裹在益生菌制剂表面，烘干水分，制得益生菌饲料，其中明胶-饲料胶状混合物与益生菌制剂的重量比为3∶1。
2.如权利要求1所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，改性明胶的制备方法包括：
步骤S31、按重量份，称取1.5～2份魔芋胶，8～10份明胶，2～3份玉米淀粉和0.3～0.6份三乙醇胺，向三乙醇胺中加入120～140份去离子水，对三乙醇胺进行稀释，然后将魔芋胶和明胶同时加入至稀释后的三乙醇胺溶液中，以120rpm的速率搅拌反应20～36min；
步骤S32、向步骤S31反应后的混合溶液中加入玉米淀粉，搅拌均匀后，水浴加热至40～50℃，保温1～2.5h后，进行蒸发浓缩，将混合溶液蒸发为含水量在12～16％的胶状混合物，便制备得到改性明胶。
3.如权利要求1所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，益生菌制剂的制备方法包括：
步骤S21、筛选出耐抗生素的菌种进行培养发酵，制备得到益生菌菌泥；
步骤S22、制备内层包被层，按重量份，称取胰蛋白胨1.3～1.5份，植酮1～2份，酵母粉2～6份，肝浸出物2～5份以及L-半胱氨酸盐酸盐溶液2～4份，混合搅拌得到泥状混合物，取步骤S21制得的1～2份益生菌菌泥与泥状混合物混合，并在45～50℃的温度下烘干3h，得到固态益生菌混合物；
步骤S23、制备中间脂质包被层；
步骤S24、制备阻隔膜；
步骤S25、制备外部包被胶囊，具体方法包括：按重量份称取0.2～0.6份的黄原胶，0.18～0.26份的海藻酸钠，1.3～1.8份的液体石蜡，1.3～1.66份的淀粉，将各物质加入10～12份的无菌水中，搅拌均匀制得胶囊粗液，将胶囊粗液蒸发后得到外部包被胶囊；
步骤S26、将步骤S22制得的固态益生菌混合物包埋在步骤S23制得的中间脂质包被层中，然后将步骤四制得的阻隔膜包埋在中间脂质层的外部，最后将步骤S25制得的外部包被胶囊包埋在阻隔膜的外部，这样益生菌制剂便制备完成。
4.如权利要求3所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤S24制备阻隔膜的方法包括：按重量份称取1～2份的纳米淀粉微球和0.08～0.1份的纳米二氧化硅粉末，将纳米淀粉微球溶解于无菌水中，先搅拌10～25min，再在600～1100rmp转速下离心2～5h，然后将纳米二氧化硅粉末加入至无菌水中，向混有纳米淀粉微球和纳米二氧化硅粉末的无菌水中加入交联剂，交联时间1～1.3h，然后向交联后的溶液中依次加入食用明胶0.4～0.6份，羧甲基纤维素钠0.8～1份，赖氨酸0.05～0.06份，再次搅拌1h，搅拌速率为250～300rmp；对搅拌后的混合溶液进行蒸发浓缩，直至含水量低于26％，得到胶状阻隔膜粗料；随后对蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料进行改性，得到阻隔膜。
5.如权利要求3所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤S21中的益生菌菌种包括罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的活菌数量比为1∶1∶0.2～0.6∶1.3；
所述步骤S23中的交联剂为氯化钙、柠檬酸钠、柠檬酸钾或三偏磷酸钠中的一种。
6.如权利要求4所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，对胶状阻隔膜粗料进行改性的方法包括：
步骤S241、将蒸发浓缩后的胶状阻隔膜粗料平铺在细孔板表面，平铺厚度小于1mm，细孔板上开设有致密的小孔，小孔孔径为0.1～0.2mm；
步骤S242、在细孔板的下方放置一个中空的通气板，通气板的长、宽与细孔板相同，通气板的上表面开设有与细孔板小孔孔径一致的出气孔，将储存有氮气的气管与通气板连通，氮气从通气板的上表面逸出，并迅速透过胶状阻隔膜粗料，在胶状阻隔膜粗料中贯穿形成气孔，氮气的通气时间为25～40min；在氮气通过通气板向上流动的同时，使用加热棒放置在通气板的底部，对通气板进行加热，加热温度不高于80℃；
步骤S243、使用表面光滑的平板缓慢压平胶状阻隔膜粗料，使胶状阻隔膜粗料表面保持平整；
步骤S244、将表面平整过的胶状阻隔膜粗料件低温冷冻，冷冻温度为﹣12～﹣4℃，冷冻时间为2h。
7.如权利要求3所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤S21中对益生菌进行培养发酵的方法包括：
步骤S211、对筛选得到的益生菌进行活化，将益生菌采用划线接种的方式接种于活化培养基上，在37℃的温度下活化培养24～30h；
步骤S212、将活化培养的益生菌接种于液体培养基中，在37℃下兼性厌氧培养24～30h，得到益生菌发酵液；
步骤S213、在2500rmp转速下，对步骤S12制得的益生菌发酵液进行离心，离心时间为12～25min，静置后将下层沉淀滤除，取下层清液接种于灭菌后的发酵培养基中，并将发酵培养基放图发酵罐中，进行厌氧发酵，发酵时间为24～30h；
步骤S214、将经过步骤S12发酵后的益生菌发酵液低温冷冻干燥，得到益生菌菌泥。
8.如权利要求3所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤S23制备中间脂质层的方法包括：按重量份称取0.6～0.65份的甘油三酯，0.12～0.16份的鞘磷脂，1～2份的壳聚糖，3～6份的大豆粉以及0.1～0.22份的山楂粉，将上述物质混合后倒入体积量分数为20％的乙醇溶液中，在20～35rmp转速下搅拌40min，静置一段时间后将乙醇完全蒸发，再加入2～5份的无菌水，搅拌均匀后便制得中间脂质包被层材料。
9.如权利要求3所述的仔猪用益生菌饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤S22制备内层包被层时，加入有崩解剂，崩解剂与胰蛋白胨的重量比为1比20，崩解剂为微晶纤维、羧甲基纤维素钠中的一种。
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