CN102960598A - 一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，用压力喷嘴将双歧杆菌胶液挤压入含有乳化剂的大豆油中，充分搅拌，乳化，然后加入氯化钙溶液，静置；待静置分层后，倾去上层大豆油，离心得到湿胶囊并用生理盐水充分洗涤，得到双歧杆菌微胶囊；将双歧杆菌微胶囊与二层包埋溶液混合，震荡搅拌，离心收集得到二层包埋的双歧杆菌微胶囊；在棕榈油中加入吐温-80，充分混匀后灭菌，得到三层包埋溶液；将双层包埋的双歧杆菌微胶囊与三层包埋溶液混合，震荡搅拌，离心收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。通过三层包埋微胶囊技术对双歧杆菌进行保护，有利于延长双歧杆菌制剂及含有双歧杆菌的产品的保存期。

Description

一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法

技术领域

本发明属于益生菌饮品技术领域，涉及一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

近年来，随着人们对益生菌保健作用的逐渐认识，对其活菌制剂的研究也日渐增多。双歧杆菌是一类能在人体肠道中定植的益生菌，对人体具有重要的营养和保健作用。但由于双歧杆菌对氧极为敏感，对低pH值（如胃酸）的抵抗力差，因此，随经口服食用后，能活着进入肠道的菌体数量不多，其产品普遍也存在着保存性差、随保存时间延长活菌数下降等缺点，使产品的应用受到限制。

微胶囊化技术是近年来新兴的一门技术，是利用天然或合成的高分子材料（统称囊材），将固、液、气物质（统称囊心物）包埋成微小致密的胶囊。近年有学者开展双歧杆菌微胶囊化的研究，对保护菌体抵抗不利环境起到了较好的效果。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，通过三层微胶囊技术对双歧杆菌进行保护，在一定范围内延长双歧杆菌制剂及含有双歧杆菌的产品的保存期。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

1）将双歧杆菌的菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：5～20的体积比例混合，并加入抗氧化剂至其质量分数为0.01～0.09%，充分混均后得到双歧杆菌胶液；

所述的双歧杆菌的菌悬液是将双歧杆菌以0.1～5.0×10¹¹cfumL^-1的浓度悬浮在质量浓度为0.85～0.9%的无菌生理盐水中；

所述的含有益生元的海藻酸钠溶液中益生元量的质量浓度为3～9%，海藻酸钠的质量浓度为1～3%；

2）用压力喷嘴将双歧杆菌胶液挤压入含有乳化剂体积分数为0.2～1.0%的大豆油中，双歧杆菌胶液与大豆油的体积比为1：4～7，充分搅拌，乳化5～20min，然后加入质量浓度为1～5%的氯化钙溶液，静置20min以上；

3）待静置分层后，倾去上层大豆油，离心得到湿胶囊并用生理盐水充分洗涤，得到双歧杆菌微胶囊；

4）配制含质量浓度为1～3%的壳聚糖、含1～5%的瓜尔胶的混合溶液，灭菌后得到二层包埋溶液；

将双歧杆菌微胶囊与二层包埋溶液按照1g:5～20ml的比例混合，震荡搅拌10～30min，离心（3000,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊；

5）在棕榈油中加入体积分数为0.2～0.6%的吐温-80，充分混匀后灭菌，得到三层包埋溶液；

将双层包埋的双歧杆菌微胶囊与三层包埋溶液按照1g:10～20ml的比例混合，震荡搅拌10～30min，离心（3000,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

所述的双歧杆菌为两歧双歧杆菌、长双歧杆菌或乳双歧杆菌中的一种。

所述的益生元为水苏糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖等其中的一种或几种。

所述的抗氧化剂为半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸钠、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的两种或两种以上。

所述含有益生元的海藻酸钠溶液中还含有氯化钠，其质量浓度为0.85～0.9%。

所述的双歧杆菌为接种于MRS培养基经过增殖培养所获得的。

所述的乳化剂为吐温-80。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，通过三层包埋微胶囊技术对双歧杆菌进行保护，有利于延长双歧杆菌制剂及含有双歧杆菌的产品的保存期，在制备双歧杆菌微胶囊的过程中将乳化法和挤压法结合，采用压力喷嘴将含有抗氧化剂的菌胶液雾化成小液滴喷入油中，比传统的注射器挤压法省时省力；

本发明还通过加入了抗氧化剂，解决了在制备微胶囊过程中因为双歧杆菌与氧气的接触所受到的毒害，加入了抗氧化剂后其每克胶囊活菌数明显提高可达到10¹⁰～10¹¹；其活菌数显著高于不加抗氧化剂的双歧杆菌微胶囊。

由于所制备的微胶囊含有双歧杆菌益生元，当食用了这种双歧杆菌微胶囊的产品，当微胶囊到达肠道后，在大量双歧杆菌在肠道释放的同时，益生元也会在肠道发挥其增殖作用，可以使肠道内的双歧杆菌活菌数迅速上升。

本发明提供的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，加入了益生元和抗氧化剂，不但保护双歧杆菌免受有害环境的毒害还促进了双歧杆菌的增殖，在一定程度上提高了微胶囊内双歧杆菌的活菌数。使每克胶囊活菌数明显提高可达到10¹⁰～10¹¹cfug^-1。

本发明提供的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，三层包埋的双歧杆菌微胶囊较单层的更稳定，不易泄漏。但是由于要考虑肠溶性，必须选择合适的材料，否则当微胶囊到达肠道后双歧杆菌无法释放，达不到益生的效果。所述的三层包埋的双歧杆菌微胶囊第一层材料是海藻酸钠，第二层材料是壳聚糖，第三层材料是棕榈油，其中海藻酸钠-壳聚糖是肠溶性很好的材料，棕榈油在体温条件下就会融化。三层微胶囊耐酸，耐胆盐能力较单层和双层的微胶囊好，活菌数下降的很慢，在人工模拟胃酸中三个小时单层包埋的双歧杆菌微胶囊活菌数由1.2×10¹⁰cfug^-1下降至0.4×10¹⁰cfug^-1，双层包埋的双歧杆菌微胶囊活菌数由0.75×10¹⁰cfug^-1下降至0.45×10¹⁰cfug^-1，三层包埋的双歧杆菌微胶囊活菌数0.5×10¹⁰cfug^-1下降至0.48×10¹⁰cfug^-1。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）将0.4g双歧杆菌冻干菌粉（两歧双歧杆菌）接种于18mL MRS液体培养基（购买于青岛高科园海博生物技术有限公司）中，在MRS液体培养基中添加占培养基体积0.05%的半胱氨酸盐酸盐，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，每次以5%的接种量转接，其中前两次均在37℃培养条件下培养20～24h,第三次在37℃培养条件下培养18h，然后离心(4000r，15min)弃去上清液得菌泥，将菌泥洗两次涤后与0.85～0.9%无菌生理盐水混合配制成浓度为1.0×10¹¹cfumL^-1菌悬液以备使用。

（2）配制质量浓度2%且含益生元质量为5%的海藻酸钠溶液，110℃，灭菌15min。所述的益生元为水苏糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚果糖中的一种。

（3）制备抗氧化剂，配制抗氧化剂的浓溶液，过滤除菌以备使用。所述的抗氧化剂为半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸钠中的两种。

（4）将菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：10的比例混合，抗氧化剂按照菌胶液总量的0.03%的添加量加入，并在旋涡混合仪上混合均匀得菌胶液。

（5）用压力喷嘴将上述菌胶混合液逐滴滴入大豆油中（含0.4%的吐温-80），菌胶液和大豆油的比例为1：4，用磁力搅拌器搅拌800rpm/min，乳化20min，然后快速加入浓度为2%的氯化钙溶液，静置30min。

（6）倾去上层大豆油，通过离心得到湿胶囊(1000r，5min)，用生理盐水洗涤3次。

（7）配制含2%壳聚糖、含1.5%瓜尔胶的混合溶液，灭菌（110℃，10min）。将单层包埋的双歧杆菌微胶囊与壳聚糖-瓜尔胶混合溶液按质量体积比1:10的比例混合，震荡搅拌10min，离心（3000r,15min）收集得到二层包埋的双歧杆菌微胶囊。

（8）将棕榈油加入0.4%的吐温-80后（110℃，10min）。然后将制得的双层双歧杆菌微胶囊与棕榈油按质量体积比1：15的比例混合，震荡搅拌10min，离心（3000r,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

实施例2

三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）将0.4g双歧杆菌冻干菌粉（长双歧杆菌）接种于18mL MRS液体培养基（购买于青岛高科园海博生物技术有限公司）中，在MRS液体培养基中添加占培养基体积0.05%的半胱氨酸盐酸盐，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，每次以5%的接种量转接，其中前两次均在37℃培养条件下培养20～24h,第三次在37℃培养条件下培养18h，然后离心(4000r，15min)弃去上清液得菌泥，将菌泥洗两次涤后与0.85～0.9%无菌生理盐水混合配制成浓度为5.0×10¹¹cfumL^-1菌悬液以备使用。

（2）配制浓度2%且含益生元量为9%的海藻酸钠溶液，110℃，灭菌15min。所述的益生元为水苏糖、低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖中的两种。

（3）制备抗氧化剂，配制抗氧化剂的浓溶液，过滤除菌以备使用。所述的抗氧化剂为抗坏血酸、抗坏血酸钠、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的两种或两种以上。

（4）将菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：10的比例混合，抗氧化剂按照菌胶液总量的0.07%的添加量加入，并在旋涡混合仪上混合均匀得菌胶液。

（5）用压力喷嘴将上述菌胶混合液逐滴滴入大豆油中（含0.4%的吐温-80），菌胶液和大豆油的比例为1：5，用磁力搅拌器搅拌800rpm/min，乳化15min，然后快速加入浓度为3%的氯化钙溶液，静置30min。

（6）倾去上层大豆油，通过离心得到湿胶囊(1000r，5min)，用生理盐水洗涤3次。

（7）配制含2%壳聚糖、含1.5%瓜尔胶的混合溶液，灭菌（110℃，10min）。将单层包埋的双歧杆菌微胶囊与壳聚糖-瓜尔胶混合溶液按质量体积比1:15的比例混合，震荡搅拌30min，离心（3000r,15min）收集得到二层包埋的双歧杆菌微胶囊。

（8）将棕榈油加入0.4%的吐温-80后（110℃，10min）。然后将制得的双层双歧杆菌微胶囊与棕榈油按质量体积比1：20的比例混合，震荡搅拌30min，离心（3000r,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

实施例3

三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）将0.4g双歧杆菌冻干菌粉（乳双歧杆菌）接种于18mL MRS液体培养基（购买于青岛高科园海博生物技术有限公司）中，在MRS液体培养基中添加占培养基体积0.05%的半胱氨酸盐酸盐，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，每次以5%的接种量转接，其中前两次均在37℃培养条件下培养20～24h,第三次在37℃培养条件下培养18h，然后离心(4000r，15min)弃去上清液得菌泥，将菌泥洗两次涤后与0.85～0.9%无菌生理盐水混合配制成浓度为1.0×10¹⁰cfumL^-1菌悬液以备使用。

（2）配制浓度2.5%且含益生元量为7%的海藻酸钠溶液，110℃，灭菌15min。所述的益生元为水苏糖、菊糖、低聚半乳糖中的两种或三种。

（3）制备抗氧化剂，配制抗氧化剂的浓溶液，过滤除菌以备使用。所述的抗氧化剂为半胱氨酸盐酸盐、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的两种或两种以上。

（4）将菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：10的比例混合，抗氧化剂按照菌胶液总量的0.05%的添加量加入，并在旋涡混合仪上混合均匀得菌胶液。

（5）用压力喷嘴将上述菌胶混合液逐滴滴入大豆油中（含0.4%的吐温-80），菌胶液和大豆油的比例为1：6，用磁力搅拌器搅拌800rpm/min，乳化15min，然后快速加入浓度为2%的氯化钙溶液，静置30min。

（6）倾去上层大豆油，通过离心得到湿胶囊(1000r，5min)，用生理盐水洗涤3次。

（7）配制含2%壳聚糖、含1.5%瓜尔胶的混合溶液，灭菌（110℃，10min）。将单层包埋的双歧杆菌微胶囊与壳聚糖-瓜尔胶混合溶液按质量体积比1:20的比例混合，震荡搅拌15min，离心（3000r,15min）收集得到二层包埋的双歧杆菌微胶囊。

（8）将棕榈油加入0.4%的吐温-80后（110℃，10min）。然后将制得的双层双歧杆菌微胶囊与棕榈油按质量体积比1：20的比例混合，震荡搅拌15min，离心（3000r,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

实施例4

三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

（1）将0.4g双歧杆菌冻干菌粉（两歧双歧杆菌）接种于18mL MRS液体培养基（购买于青岛高科园海博生物技术有限公司）中，在MRS液体培养基中添加占培养基体积0.05%的半胱氨酸盐酸盐，在37℃培养条件下采用此MRS液体培养基活化三次，每次以5%的接种量转接，其中前两次均在37℃培养条件下培养20～24h,第三次在37℃培养条件下培养18h，然后离心(4000r，15min)弃去上清液得菌泥，将菌泥洗两次涤后与0.85～0.9%无菌生理盐水混合配制成浓度为2.0×10¹¹cfumL^-1菌悬液以备使用。

（2）配制浓度1.5%且含益生元量为7%的海藻酸钠溶液，110℃，灭菌15min。所述的益生元为水苏糖、低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖中的两种。

（3）制备抗氧化剂，配制抗氧化剂的浓溶液，过滤除菌以备使用。所述的抗氧化剂为抗坏血酸、抗坏血酸钠、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的两种或两种以上。

（4）将菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：10的比例混合，抗氧化剂按照菌胶液总量的0.07%的添加量加入，并在旋涡混合仪上混合均匀得菌胶液。

（5）用压力喷嘴将上述菌胶混合液逐滴滴入大豆油中（含0.4%的吐温-80），菌胶液和大豆油的比例为1：7，用磁力搅拌器搅拌800rpm/min，乳化15min，然后快速加入浓度为2%的氯化钙溶液，静置30min。

（6）倾去上层大豆油，通过离心得到湿胶囊(1000r，5min)，用生理盐水洗涤3次。

（7）配制含1.5%壳聚糖、含1.5%瓜尔胶的混合溶液，灭菌（110℃，10min）。将单层包埋的双歧杆菌微胶囊与壳聚糖-瓜尔胶混合溶液按质量体积比1:20的比例混合，震荡搅拌20min，离心（3000,15min）收集得到二层包埋的双歧杆菌微胶囊。

（8）将棕榈油加入0.4%的吐温-80后（110℃，10min）。然后将制得的双层双歧杆菌微胶囊与棕榈油按质量体积比1：20的比例混合，震荡搅拌20min，离心（3000,15min）收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

Claims (7)

1.一种三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将双歧杆菌的菌悬液和含有益生元的海藻酸钠溶液按照1：5～20的质量比例混合，并加入抗氧化剂至其质量分数为0.01～0.09%，充分混均后得到双歧杆菌胶液；

所述的双歧杆菌的菌悬液是将双歧杆菌以0.1～5.0×10¹¹cfumL^-1的浓度悬浮在质量浓度为0.85～0.9%的无菌生理盐水中；

所述的含有益生元的海藻酸钠溶液中益生元量的质量浓度为3～9%，海藻酸钠的质量浓度为1～3%；

2）用压力喷嘴将双歧杆菌胶液挤压入含有乳化剂体积分数为0.2～1.0%的大豆油中，双歧杆菌胶液与大豆油的体积比为1：4～7，充分搅拌，乳化5～20min，然后加入质量浓度为1～5%的氯化钙溶液，静置20min以上；

3）待静置分层后，倾去上层大豆油，离心得到湿胶囊并用生理盐水充分洗涤，得到双歧杆菌微胶囊；

4）配制含质量浓度为1～3%的壳聚糖、含1～5%的瓜尔胶的混合溶液，灭菌后得到二层包埋溶液；

将双歧杆菌微胶囊与二层包埋溶液按照1g:5～20ml的比例混合，震荡搅拌10～30min，离心，收集得到双层包埋的双歧杆菌微胶囊；

5）在棕榈油中加入体积分数为0.2～0.6%的吐温-80，充分混匀后灭菌，得到三层包埋溶液；

将双层包埋的双歧杆菌微胶囊与三层包埋溶液按照1g:10～20ml的比例混合，震荡搅拌10～30min，离心，收集得到三层包埋的双歧杆菌微胶囊。

2.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的双歧杆菌为两歧双歧杆菌、长双歧杆菌或乳双歧杆菌中的一种。

3.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的益生元为水苏糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚果糖、菊糖、低聚半乳糖等其中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的抗氧化剂为半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、抗坏血酸钠、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的两种或两种以上。

5.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述含有益生元的海藻酸钠溶液中还含有氯化钠，其质量浓度为0.85～0.9%。

6.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的双歧杆菌为接种于MRS培养基经过增殖培养所获得的。

7.如权利要求1所述的三层包埋双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的乳化剂为吐温-80。