CN101597604A

CN101597604A - 一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法

Info

Publication number: CN101597604A
Application number: CNA2009101365172A
Authority: CN
Inventors: 储一衫; 任发政; 张明; 杨海莺; 赵亮; 刘晓飞
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2009-05-06
Publication date: 2009-12-09

Abstract

本发明公开了一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，采用脱脂乳作为相分离凝聚法的壁材来源，通过凝乳酶和乳蛋白的相互作用形成微胶囊。技术方案包括：脂乳浓度20％～40％，凝乳酶作用时间为30min～120min，植物油混合比例为10∶1～2∶1，乳化时搅拌转速为100rpm～1000rpm。本发明制备的微胶囊化双歧杆菌具有包埋率高、粒径合适、肠溶性高和安全性好等优点，可有效促进双歧杆菌微胶囊制备技术的革新和产业化。

Description

一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法

技术领域

本发明涉及到种双歧杆菌制剂，特别是一种双歧杆菌微胶囊制剂，属于益生菌产品制备技术领域。

背景技术

双歧杆菌对人体的生理和保健功能已渐渐为人们所熟知。但双歧杆菌的良好益生功能必需要求有大量的存活菌通过胃环境到达肠道并能够定殖于肠粘膜上。在发酵乳制品中，氧的损伤、胃肠道中胃酸、胆盐等的作用都会使双歧杆菌的活菌数会大量下降，因而研究如何对双歧杆菌进行有效保护具有重要意义。

微胶囊技术(Microencapsulation)是近年来新兴的一门技术，指采用特殊手段将固、液、气物质包埋成微小致密胶囊。在双歧杆菌的微胶囊化的制备工艺中，壁材的选择很大程度上决定了微胶囊化的效果。包埋双歧杆菌的壁材必须考虑以下因素：生物安全性，壁材成膜性，包埋率、肠溶性以及微胶囊粒径大小等因素。

目前制备已报道的应用于双歧杆菌微胶囊化的壁材分为两类：碳水化合物类和蛋白质类。碳水化合物类的包埋载体以海藻酸钠研究最多，海藻酸钠具有价格低廉、生物相容性好等特点，但是得到的微胶囊产品粒径偏大，不适合在食品中直接应用，而且在加工过程中经常发生粘连现象，影响产品的得率和菌种的包埋率。常用的蛋白质类的微胶囊壁材有明胶、阿拉伯胶、果胶等，特点是价格低廉、来源广泛，且菌种的包埋率也较高，但是得到的产品粒径难以控制，由于明胶等在肠道中的消化率不高，导致产品的肠溶性很差，大量的双歧杆菌没有被释放，达不到应有的效果。因此，发明一种包埋率高、粒径合适、肠溶性高的包埋材料可以有效促进双歧杆菌微胶囊制备技术的革新和产业化。

本发明用脱脂乳作为壁材来源，通过乳蛋白和凝乳酶相互作用形成微胶囊。该发明可以解决微胶囊包埋率低、粒径偏大以及分布不均匀等问题；以食源性的脱脂乳作为壁材，不存在食用安全性的问题；脱脂乳中的蛋白容易被肠道中的蛋白酶水解，可以有效解决肠溶性差的问题。该发明无论是壁材选择还是成胶方式在国内外微胶囊技术领域都尚属首次。本研究即以乳蛋白为壁材，利用乳蛋白和凝乳酶的相互作用制备双歧杆菌微胶囊，通过对关键工艺参数进行优化，得到稳定的、粒径大小均一的双歧杆菌微胶囊，以进一步提高双歧杆菌在产品及胃肠道中的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，通过制备过程的关键工艺参数的优化(包括脱脂乳浓度、凝乳时间、植物油添加比例以及搅拌转速等)，使微胶囊具有最好的包埋效果，促进益生菌产品制备技术的革新和产业化。

本发明提供的双歧杆菌微胶囊化的方法，壁材由脱脂乳中的蛋白和凝乳酶的相互作用形成，其特征在于，壁材可以和双歧杆菌均匀的混合并且形成一个微球形的颗粒，可以有效的保护双歧杆菌不受空气和胃液的影响，到达肠道后能有效的释放。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

(1)将长双歧杆菌BBMN68(保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检菌株形态，将活化菌株以10⁷cfu/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。

(2)将(1)得到菌液4000rpm，10min离心得到菌体，收集菌泥。

(3)配制一定浓度的脱脂乳，62℃30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为1-2×10¹⁰cfu/ml。

(4)将30g脱脂乳菌悬液冷却至4℃，加入200μl凝乳酶后4℃下静置。一段时间后加入200μL 10％(W/V)CaCl₂。

(5)随后将混合物加入一定量植物油中，5℃下搅拌5min。之后将温度升至40℃，继续搅拌15min。当温度到达18-20℃时胶粒开始形成。500rpm 1min离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。

所述的双歧杆菌为本实验室从广西巴马长寿老人肠道中分离得到，具备一定的益生功能。双歧杆菌微胶囊化关键工艺参数的设定见表-1。

表1.双歧杆菌微胶囊化关键工艺参数

Tablel key processing parameters of Microencapsulation of bifidobacteria

其中，脱脂乳浓度优选20％～40％，尤其优选25％～35％，最优选30％。凝乳时间优选30min～120min，尤其优选30～90min，最优选60min。花生油混合比例优选10∶1～2∶1，尤其优选10∶1～3∶1，最优选5∶1。搅拌速度优选100rpm～1000rpm，尤其优选500～1000rpm，最优选750rpm。

1.脱脂乳浓度对BB68包埋率和粒径大小的影响

凝乳时间恒定为60min，花生油混合比例定为10∶1，搅拌转速恒定为500rpm，脱脂乳的浓度分别设定为20％、25％、30％、35％、40％。考察脱脂乳浓度对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图1所示，随着脱脂乳浓度的升高，微胶囊的包埋率和粒径大小都有明显增加；当浓度达到30％和35％时包埋率最高且二者之间无显著性差异(P＞0.05)，30％形成的粒径略小于35％(p＜0.05)，并且微胶囊的粒径分布范围较窄，成球形较好。脱脂乳浓度低于30％时，也能形成粒径很小的胶囊(80um左右)，但包埋率与30％和35％的浓度有显著差异；当脱脂乳浓度达到40％时，包埋率和30％、35％的浓度相比没有显著差异(P＞0.05)，但形成的微胶囊粒径显著增大，达到120um左右，不适合实际的生产和应用。所以，脱脂乳的最佳浓度选择为30％。

2.凝乳酶作用时间对BB68包埋率和粒径大小的影响

脱脂乳浓度恒定为35％，花生油混合比例定为10∶1，搅拌转速恒定为500rpm，凝乳酶的作用时间分别设定为30min、60min、90min、120min。考察凝乳时间对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图2所示。其它条件不变的情况下，随着凝乳酶低温作用时间的增长，包埋率在90min以后明显下降，而粒径大小在60min后就没有显著的差距。凝乳酶作用60min和90min得到的微胶囊粒径比120min时得到的微胶囊粒径相比没有明显差异，但显著高于作用30min后的粒径大小。凝乳酶作用30min、60min和90min的包埋率没有显著差异，而作用120min的包埋率明显降低。

3.花生油的添加比例对BB68包埋率和粒径大小的影响

凝乳时间恒定为60min，脱脂乳浓度恒定为35％，搅拌转速恒定为500rpm，花生油的添加比例分别设定为10∶1，5∶1，3∶1，2∶1。考察花生油的添加比例对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图3所示。在其它条件不变的情况下，随着油添加比例的减小，微胶囊包埋率降低，粒径增大。油和脱脂乳比例为10∶1和5∶1制得的微胶囊在粒径和包埋率没有显著性差异(P＞0.05)。最终选择油和脱脂乳比例为5∶1。

4.乳化时搅拌速度对BB68包埋率和粒径大小的影响

凝乳时间恒定为60min，脱脂乳浓度恒定为35％，花生油混合比例定为10∶1，搅拌速度分别设定为100rpm、250rpm、500rpm、750rpm、1000rpm。考察乳化搅拌速度对BB68包埋率和粒径大小的影响，结果如图4所示。在其它条件不变的情况下，随着转速的提高，胶囊的粒径大小明显降低(p＜0.05)，而包埋率先升高后降低；转速过高时，粒径下降的同时，包埋率也明显下降，；250～750rpm的转速条件下，包埋率无显著差异(p＞0.05)，而粒径差异明显(p＜0.05)，以750rpm条件下的粒径最小。因此选择750rpm为乳化过程的最佳转速。

5.BB68微胶囊化工艺优化前后效果比较

优化后的工艺为：脂乳浓度30％，凝乳酶作用时间为60min，植物油混合比例为5∶1，乳化时搅拌转速为750rpm。优化后的工艺与原工艺进行比较，结果如表2：

表2.BB68微胶囊化工艺优化前后效果比较

从表1结果可以看出，优化前后包埋率提高了23.3％(p＜0.05)，粒径大小降低了11.0％(p＜0.05)，优化的效果显著。

6.微胶囊化的双歧杆菌在酸奶中的应用

微胶囊化的双歧杆菌在酸奶中结果如图5所示。4℃条件下贮藏12天内，活菌数无明显变化(p＞0.05)，贮藏21天后，活菌数相比于0天，下降了0.65个数量级，但活菌数依然达到了2×10⁶cfu/ml。因此，在酸奶贮藏期内，微胶囊化的双歧杆菌性能稳定，达到实际应用的要求。

附图说明

附图1：脱脂乳浓度对BBMN68包埋率和粒径大小的影响

附图2：凝乳时间对BBMN68包埋率和粒径大小的影响

附图3：油的添加比例对BBMN68包埋率和粒径大小的影响

附图4：转速对BBMN68包埋率和粒径大小的影响

附图5：酸奶中微胶囊的稳定性。

具体实施方式

实施例1-9

(1)将保藏的长双歧杆菌BBMN68(保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检培养液菌株形态，将活化菌株以10⁷cfu/mL接种于MRS培养基，厌氧培养24h。

(2)将(1)得到菌液4000rpm，10min离心得到菌体，收集菌泥。

(3)配制一定浓度的脱脂乳，62℃ 30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为1-2×10¹⁰cfu/ml。

(5)凝乳后，后将混合物加入一定量植物油中，5℃下以一定的转速搅拌15min。温度升至40℃，继续搅拌15min。当温度到达18-20℃时胶粒开始形成。500rpm 1min离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。

其中，脱脂乳浓度、凝乳时间、花生油的添加比例、乳化时搅拌速度是双歧杆菌微胶囊效果的关键工艺。工艺参数的设置如表3.

表3

Claims

1、一种微胶囊化双歧杆菌的制备方法，其特征在于，制备方法为：

(2)将(1)得到菌液4000rpm，10min离心得到菌体，收集菌泥。

(3)配制20％～40％的脱脂乳，62℃，30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为1-2×10¹⁰cfu/ml。

(4)将30g脱脂乳菌悬液冷却至4℃，加入200μl凝乳酶后4℃下静置。30min～120min后加入200μL10％(W/V)CaCl₂。

(5)凝乳后，向混合物加入质量比为10∶1～2∶1的花生油，5℃下100rpm～1000rpm搅拌5min。之后将温度升至40℃，继续搅拌15min。当温度到达18-20℃时胶粒开始形成。500rpm 1min离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。

2、如权利要求1所述的微胶囊化双歧杆菌的制备方法，其特征在于，制备方法为：

(2)将(1)得到菌液4000rpm，10min离心得到菌体，收集菌泥。

(3)配制30％的脱脂乳，62℃，30min巴氏杀菌，冷却后取出28g与离心得到的双歧杆菌菌体混合，搅拌均匀。脱脂乳菌悬液中双歧杆菌的初始浓度大约为1-2×10¹⁰cfu/ml。

(4)将30g脱脂乳菌悬液冷却至4℃，加入200μl凝乳酶后4℃下静置。60min后加入200μL 10％(W/V)CaCl₂。

(5)凝乳后，向混合物加入质量比为5∶1的花生油，5℃下750rpm搅拌5min。之后将温度升至40℃，继续搅拌15min。当温度到达18-20℃时胶粒开始形成。500rpm 1min离心将胶粒从油相中分离出来。得到的沉淀用蒸馏水洗涤2次，得到微胶囊化双歧杆菌产品。

3、一种微胶囊化的双歧杆菌，其特征在于是由如权利要求1-2中任一种制备方法制得的。