CN105105144B - 一种益生菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括益生菌菌株活化、菌乳混合液配制、微胶囊制备、冷冻干燥等步骤。采用本发明方法制备的益生菌微胶囊成品包埋率达76％以上，活菌数超过108CFU/g；颗粒均匀且平均粒径约100μm；在人工模拟胃液中在温度37℃保温2.5h益生菌活菌数仅减少0.22(Log10CFU/g)；在模拟人工肠液中在温度37℃下保温90min，微胶囊中益生菌基本释放完全，活菌数可达8.810±0.548(Log10CFU/g)；经冷冻干燥后，益生菌存活率达64.733±5.221％；在温度4‑37℃范围内贮藏28d后，益生菌的活菌数大于107CFU/g。

Description

一种益生菌微胶囊及其制备方法
【技术领域】
本发明属于食品生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种益生菌微胶囊，还涉及所述益生菌微胶囊的制备方法。
【背景技术】
益生菌被定义为“摄取足够数量可对宿主提供有益作用的活的微生物”。益生菌具有多种生理功能，包括改善人体肠道功能、抑制有害菌生长、减少肠道疾病、缓解乳糖不耐症、促进糖、蛋白质及钙、镁等营养物质的吸收、降胆固醇、调节免疫系统、抗肿瘤、预防癌症等。但要想获得益生功效，要求益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定，且达到一定数量(通常认为是每g或mL产品中不低于107cfu)。然而，在生产、贮藏、运输等过程中，益生菌将受到诸如食品组分(酸、氧、添加剂等)、储存温度及宿主消化系统(胃酸、胆盐、酶)等的影响，常导致活菌数大幅下降，最终定植于肠道中的活菌数低于理论上能够发挥生理作用的最小值。
微胶囊技术作为一种有效的保护策略已被广泛应用于提高益生菌在不利环境中的存活率。其中壁材和包埋方法的选择对包埋体系的保护作用至关重要。
酪蛋白是乳蛋白中的一种，作为食源性材料，其安全性极高，广泛应用于包埋材料。通过凝乳酶水解κ-酪蛋白多肽链Phe105-Met106之间的肽键，形成稳定的副κ-酪蛋白及亲水性的糖巨肽，当约85％的κ-酪蛋白被水解时，加入Ca2+使酪蛋白胶粒间形成的化学键，从而交联成凝胶并在成胶过程中包埋益生菌，但反应温度必须高于20℃。
目前，Thomas Heidebach的微胶囊制备方法(HeidebachT, P,KulozikU.Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milkproteins[J].Food Hydrocolloids,2009,23(7):1670-1677)较受欢迎，其运用内源乳化法，以牛奶蛋白为壁材制备微胶囊，利用凝乳酶低温降解酪蛋白，在CaCl2存在下迅速升温触发凝胶形成。但是，由于CaCl2为可溶性钙盐，体系中充满Ca2+，当温度突然升高，Ca2+不但会在W/O乳状液内部交联，在乳状液之间也会交联，导致形成的微胶囊粘连程度较大，分散性不好，粒径大，影响食品的口感和品质。
为了解决上述现有技术问题，本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验工作与分析研究，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种益生菌微胶囊。
本发明的另一个目的是提供所述益生菌微胶囊的制备方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种益生菌微胶囊的制备方法。
该益生菌微胶囊制备方法的步骤如下：
A、菌株活化
将益生菌接种于MRS液体培养基进行活化培养三代，再采用离心分离方法收集菌泥，它再用灭菌生理盐水洗涤，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为109cfu/mL以上的浓缩菌液，接着用MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5×109cfu/mL以上；
B、菌乳混合液配制
将脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计30～35％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的10～12％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入酶活力为80～120IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:180～220，然后在温度3～5℃下搅拌0.8～1.2h，得到所述的菌乳混合液；
C、微胶囊制备
按照以质量计15～20％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入植物油，在搅拌下反应15～20min形成均匀的W/O型乳化液，然后，
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是4～8：10～15，然后静置20～30min，离心分离，其沉淀物经洗涤得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入冷冻柜中预先冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，于是得到所述的益生菌微胶囊。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的益生菌选自植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述的益生菌在温度37℃的条件下活化培养16～20小时。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，使用离心设备在转速3000～4000r/min的条件下进行离心分离10～15min。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的凝乳酶选自来自牛胃、猪胃或羊胃的动物性凝乳酶、来自无花果树液或菠萝果实的植物性凝乳酶或来自霉菌或酵母菌的微生物凝乳酶。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的植物油选自玉米胚油、花生油、芝麻油或豆油。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，按照沉淀物与洗涤液重量比1:2～4，分离的沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤2-3次。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述的湿微胶囊在冷冻柜中在温度-78～-82℃的条件下预先冷冻2.0～3.0小时。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，预冷冻的湿微胶囊在真空冷冻干燥机中在温度-43～-47℃与真空度0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥20～24小时。
本发明还涉及采用上述制备方法得到的益生菌微胶囊。所述益生菌微胶囊的平均粒径是100μm、所述益生菌的活菌含量是108CFU/g以上；在模拟人工胃液中在温度37℃下保温2.5h时所述益生菌的活菌数减少100.22CFU/g；在模拟人工肠液中在温度37℃下保温90min时，所述的益生菌完全释放，所述益生菌的活菌数是108.0-109.5CFU/g；在温度(4～37℃)下贮藏28d后，所述益生菌的活菌数大于107CFU/g。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种益生菌微胶囊的制备方法。
该益生菌微胶囊制备方法的步骤如下：
A、菌株活化
将益生菌接种于MRS液体培养基进行活化培养三代，再采用离心分离方法收集菌泥，它再用灭菌生理盐水洗涤，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为109cfu/mL以上的浓缩菌液，接着用MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5×109cfu/mL以上。
在本发明中，所述的益生菌选自植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8。
在本发明中，所述的益生菌是一类“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体”。
植物乳杆菌(L.plantarum)LIP-1是从新疆地区酸马奶样品中分离出的1株乳杆菌，经体外试验证实该菌具有较好的耐酸性和胆盐耐受性以及较强的降胆固醇活性。利用16SrDNA序列同源性分析对该菌进行鉴定。植物乳杆菌在GenBank/EMBL/DDBJ上的序列注册号是EU213062。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；干酪乳杆菌Zhang作为一种益生菌具有优良的益生特性，具有良好的耐酸性、人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性，对免疫系统具有显著的调节功能等。
植物乳杆菌P-8是2005年从内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗牧民家庭自然发酵酸牛奶中分离的102株植物乳杆菌中筛选出的1株益生性能优异的乳杆菌。它具有免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产，及在医学上作为活疫苗提供更广泛的治疗。
本发明使用的益生菌都是公众能够从市场上获得的商品，例如由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的植物乳杆菌LIP-1、由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的干酪乳杆菌ZHANG、由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的植物乳杆菌P8。
本发明使用的MRS液体培养基是由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。
在这个步骤中，活化培养的目的在于使所述的益生菌恢复其活力。具体活化培养方法是让所述的益生菌在温度37℃的条件下活化培养16～20小时，并且以同样的方式进行活化培养三代。
在活化培养后采用离心分离方法收集菌泥。在本发明中，离心分离时使用离心设备在转速3000～4000r/min的条件下进行离心分离10～15min。所述的离心设备是本技术领域里通常使用的、在目前市场上销售的离心设备。
收集的菌泥使用以常规灭菌方法灭菌的生理盐水进行洗涤，洗涤生理盐水浓度通常是以重量计0.8％～0.85％；所述菌泥与生理盐水的重量比一般是1：3～5；洗涤次数往往是2～4次。
然后，按照洗涤菌泥与无菌水的重量比1：1～3；将洗涤菌泥重悬于无菌水中，得到一种益生菌密度为109cfu/mL以上的浓缩菌液。
接着，让所述浓缩菌液在MRS琼脂培养基中在温度37℃下倾注培养48h，达到倾注培养液的活菌菌密度为5×109cfu/mL以上。
所述的MRS琼脂培养基由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰、18克琼脂与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。
B、菌乳混合液配制
将脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计30～35％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
所述的脱脂乳粉是将鲜牛奶脱去脂肪后再进行干燥所得到的产品，除脂肪可降低至约1％外，其他组分变化不大。脱脂奶粉为乳白色或淡黄色粉末。本发明使用的脱脂乳粉是目前市场上销售的产品，例如由恒天然有限公司以商品名skimmed milk powder销售的产品。
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的10～12％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入酶活力为80～120IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:180～220，然后在温度3～5℃下搅拌0.8～1.2h，得到所述的菌乳混合液。
凝乳酶是一种天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶。
在本发明中，所述的凝乳酶选自来自牛胃、猪胃或羊胃的动物性凝乳酶、来自无花果树液或菠萝果实的植物性凝乳酶或来自霉菌或酵母菌的微生物凝乳酶。
动物性凝乳酶是一种从牛胃、猪胃或羊胃的动物胃中提取获得的酶。
植物性凝乳酶例如是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶等。
微生物凝乳酶是来自于霉菌和酵母菌的酶。
本发明使用的凝乳酶都是目前市场上销售的产品，例如由北京博奥拓达科技有限公司以商品名小牛皱胃酶销售的动物性凝乳酶；由北京博奥拓达科技有限公司以商品名木瓜蛋白酶销售的植物性凝乳酶；由北京博奥拓达科技有限公司以商品名凝乳酶(米曲霉产)销售的微生物凝乳酶。
在本发明中，酶活力是指1毫升凝乳酶溶液或1克干粉在温度35℃条件下在40分钟内能凝结原奶的毫升数。
本发明使用的凝乳酶酶活力为80～120IMCU/mL，如果其酶活力小于80IMCU/mL，则不能提供足够的壁材，使益生菌不能完全被包埋，包埋率降低，影响包埋效果；如果酶活力高于120IMCU/mL，则凝乳酶费用较高，而包埋效果几乎没有提升，则会造成生产成本增加；因此酶活力为80～120IMCU/mL是合理的。
在本发明中，混合液与凝乳酶的比为1:180～220，如果混合液与凝乳酶的比大于1:180，则会使酪蛋白酶解不彻底，包埋过程中与Ca2+交联有限，影响包埋效果；如果混合液与凝乳酶的比小于1：220，包埋效果几乎没有提高，则会造成凝乳酶浪费；因此混合液与凝乳酶的比为1:180～220是恰当的。
C、微胶囊制备
按照以质量计15～20％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入植物油，在搅拌下反应15～20min形成均匀的W/O型乳化液。
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是4～8：10～15，然后静置20～30min，离心分离，其沉淀物经洗涤得到湿的微胶囊；
本发明以不溶性钙盐CaCO3为Ca2+来源，待体系中混合物在油相中分散均匀，形成均匀的W/O型乳化液后，加入冰醋酸酸调，引发不溶性钙盐中Ca2+的解离，促使Ca2+在乳液液滴内部与酪蛋白作用生成凝胶颗粒。这种方法在室温下即可完成，条件温和，操作容易，设备简单，制得的微胶囊颗粒粒径较小，分散性好，且包埋效率高、表面致密，很好地解决了现有技术中存在的一些技术问题。
乳化剂按其在两相中所形成乳化体系性质分为水包油(O/W)型和油包水(W/O)型两类，本发明形成的乳化液是W/O(油包水)型乳化液。
本发明使用的植物油选自玉米胚油、花生油、芝麻油或豆油，它们都是目前市场上销售的产品。
在这个步骤中，离心分离条件与设备都与步骤A的相同，因此不再赘述。
在这个步骤中，沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤的目的在于除去微胶囊周围的油，减少油脂氧化腐败对益生菌的不良影响。
按照沉淀物与洗涤液重量比1:2～4，分离的沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤2-3次。无菌生理盐水的浓度不是很关键的，但通常是以重量计0.8％～0.85％。
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入冷冻柜中预先冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，于是得到所述的益生菌微胶囊。
在这个步骤中，步骤C得到的湿微胶囊预冷冻的目的在于使湿微胶囊中的液态水快速凝结成冰，防止形成较大的冰晶对微胶囊和菌体造成的机械伤害，同时便于冷冻干燥过程中，湿微胶囊中的水由冰直接升华从而达到干燥的目的，若没有完全冻结，在抽真空时会膨胀起泡，还可能造成干燥不完全(成粘稠状)影响微胶囊的质量和菌的存活。所述的湿微胶囊在冷冻柜中在温度-78～-82℃的条件下预先冷冻2.0～3.0小时。
冷冻柜是一种为了达到深度冷冻效果的低温冷藏冷冻设备。本发明使用的冷冻柜是目前市场上销售的产品，例如由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冷冻柜。
预冷冻湿微胶囊进行冷冻干燥的目的在于在冷冻条件下，湿微胶囊中的水由冰直接升华从而达到干燥的目的，同时水分的减少有助于微胶囊益生菌的长期贮藏。预冷冻湿微胶囊需要在真空冷冻干燥机中在温度-43～-47℃与真空度0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥20～24小时。
真空冷冻干燥机将制冷系统、真空系统、导热油加热系统、排湿系统等组合成一种新型箱体结构，进行冷冻真空干燥。本发明使用的真空冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如由日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机。
采用本发明方法制备得到的益生菌微胶囊进行了如下所述的性能测定。
A、包埋率测定
称取0.5g本发明益生菌微胶囊湿品，加入到4.5mL模拟肠液(用NaOH溶液将以重量计0.8％～0.85％NaCl溶液的pH值调节到8.0后，加入0.1％胰蛋白酶，用0.22μm的膜进行过滤灭菌)中，在温度37℃下震荡培养120min，使菌体完全释放，然后取样梯度稀释，采用平板计数法进行活菌计数，按照下式(1)进行计算，其结果表明本发明益生菌微胶囊中益生菌包埋率达到76％以上。
ME(％)＝微胶囊中活菌数量/初始活菌数量×100％ (1)
式中：
微胶囊中活菌数量为每克湿微胶囊的含菌量与收集得到的微胶囊总质量的乘积；
初始活菌数量为每毫升浓缩菌液的含菌量与加入的浓缩菌液总体积的乘积。
B、形态测定
使用扫描电子显微镜(SEM)在常规研究条件下观察本发明益生菌微胶囊超微结构。用双面胶将冷冻干燥后的益生菌微胶囊粘在样品台上，喷金后用扫描电镜观察微胶囊表面结构，其结果见附图1。这个结果表明本发明益生菌微胶囊结构致密、表明光滑，分散性较好，粒径较小。
C、耐胃酸测试
称取0.5g本发明益生菌微胶囊，将其分散于4.5mL模拟胃液(用浓盐酸将以重量计0.8％～0.85％NaCl溶液的pH值调节到2.0后，加入0.3％的胃蛋白酶，用0.22μm的膜进行过滤灭菌)中，在温度37℃下震荡培养2.5h，并每隔30min移取0.5mL样品溶液于模拟肠液中震荡培养2h，使菌体释放完全，从中移取0.5mL进行梯度稀释，采用MRS琼脂培养基倾注培养法进行活菌计数，其结果列于附图2中。这些结果表明，本发明益生菌在模拟胃液中的活菌数下降幅度较小，2.5h后益生菌活菌数仅减少0.22(Log10CFU/g)。
D、肠液释放性测试
称取0.5g本发明益生菌微胶囊，将其分散于4.5mL模拟肠液(与A、包埋率测定中的相同)中，在温度37℃下震荡培养2.5h，并每隔30min移取0.5mL样品溶液进行梯度稀释计数，以确定释放到模拟肠液中的活菌数，其结果列于附图3中。这些结果表明，在90min后本发明益生菌微胶囊中益生菌基本释放完全，活菌数可达8.810±0.548(Log10CFU/g)。
E、抗真空冷冻性测试
分别称取在冻干前后的本发明益生菌微胶囊0.1g加入到4.5mL上述模拟肠液中，在温度37℃下震荡培养120min，完全释放菌体，然后进行菌落计数。结果表明，经冷冻干燥后本发明益生菌存活率达65％。
F、耐贮藏性测试
取冷冻干燥后的本发明益生菌LIP-1微胶囊分别在4℃、20℃和37℃下贮存28d，每隔7d取样，测定LIP-1的存活率，其结果列于附图4中。这些结果表明，贮藏28d后益生菌的活力仍较高，活菌数大于107CFU/g。
上述测试结果表明，本发明的益生菌微胶囊无论在包埋率、形态特征，还是耐胃酸性、肠液释放性、抗冷冻性和贮藏稳定性，都表现出良好的性能，可以为益生菌提供很好的保护，是一种具有实际应用的可靠包埋方法。
本发明还涉及采用上述制备方法得到的益生菌微胶囊。所述益生菌微胶囊的平均粒径是100μm、所述益生菌的活菌含量是108CFU/g以上；在模拟人工胃液中在温度37℃下保温2.5h时所述益生菌的活菌数减少100.22CFU/g；在模拟人工肠液中在温度37℃下保温90min时，所述的益生菌完全释放，所述益生菌的活菌数是108.0-109.5CFU/g；在温度(4～37℃)下贮藏28d后，所述益生菌的活菌数大于107CFU/g。
[有益效果]
采用本发明方法制备的益生菌微胶囊成品包埋率达76％以上，活菌数超过108CFU/g；颗粒均匀且平均粒径约100μm；在人工模拟胃液中在温度37℃保温2.5h益生菌活菌数仅减少0.22(Log10CFU/g)；在模拟人工肠液中在温度37℃下保温90min，微胶囊中益生菌基本释放完全，活菌数可达8.810±0.548(Log10CFU/g)；经冷冻干燥后，益生菌存活率达64.733±5.221％；在温度4-37℃范围内贮藏28d后，益生菌的活菌数大于107CFU/g。本发明所述的微胶囊对益生菌的保护效果确切，使用的包埋材料是食品级的，生产工艺简单，成本较低，产品得率较高，胶囊粒径均匀，稳定性高，性质优异且保存时间长，方便运输和储存，可广泛应用于食品、生物技术等多个领域。
【附图说明】
图1是本发明益生菌微胶囊的扫描电镜(SEM)图；
图2是本发明益生菌微胶囊耐胃酸试验结果图；
图3是本发明益生菌微胶囊肠液释放试验结果图；
图4是本发明益生菌微胶囊耐贮藏试验结果图。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明益生菌微胶囊的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
将由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室获得的植物乳杆菌LIP-1益生菌接种于由Oxoid公司以商品名MRS Broth销售的MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下活化培养17小时进行活化培养三代，再使用离心设备在转速3000r/min的条件下进行离心分离12min，收集菌泥，按照菌泥与生理盐水的重量比1：3，所述菌泥再用浓度为以质量计15％的灭菌生理盐水洗涤3次，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为1.1×109cfu/mL的浓缩菌液，接着用由Oxoid公司以商品名MRS Agar销售的MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5.2×109cfu/mL；
B、菌乳混合液配制
将由Fonterra(New Zealand)公司以商品名skimmed milk powder销售的脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计30％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的11％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入由北京博奥拓达科技有限公司以商品名凝乳酶销售的酶活力为110IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:195，然后在温度3℃下搅拌1.0h，得到所述的菌乳混合液；
C、微胶囊制备
按照以质量计18％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入玉米胚油植物油，在搅拌下反应15min形成均匀的W/O型乳化液，然后，
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是6：12，然后静置20min，使用离心设备在转速3000r/min的条件下进行离心分离15min，按照沉淀物与洗涤液重量比1:2，其沉淀物用无菌生理盐水洗涤2次，得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冷冻柜中在温度-78℃的条件下预先冷冻3.0小时，再置于由日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机中在温度-43℃与真空度0.01MPa的条件下冷冻干燥22小时，于是得到所述的益生菌微胶囊。
本实施例制备的益生菌微胶囊进行了包埋率、形态、耐胃酸性、肠液释放性、抗真空冷冻性和贮藏性的测试。本实施例制备的益生菌微胶囊中益生菌包埋率达到76.2％，经冷冻干燥后的益生菌存活率达65.3％，形态、耐胃酸性、肠液释放性和耐贮藏性测试结果分别列于附图1-4中。这些结果充分说明，本发明的益生菌微胶囊无论在包埋率、形态特征，还是耐胃酸性、肠液释放性、抗冷冻性和贮藏稳定性，都表现出良好的性能，说明本发明的方法是一种具有实际应用的可靠包埋方法。
实施例2：本发明益生菌微胶囊的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
将由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室获得的干酪乳杆菌ZHANG益生菌接种于由Oxoid公司以商品名MRS Broth销售的MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下活化培养16小时进行活化培养三代，再使用离心设备在转速3300r/min的条件下进行离心分离10min，收集菌泥，按照菌泥与生理盐水的重量比1：4，所述菌泥再用浓度为以质量计30％的灭菌生理盐水洗涤2次，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为1.2×109cfu/mL的浓缩菌液，接着用由Oxoid公司以商品名MRS Agar销售的MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5.4×109cfu/mL；
B、菌乳混合液配制
将由Fonterra(New Zealand)公司以商品名skimmed milk powder销售的脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计32％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的10％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入由北京博奥拓达科技有限公司以商品名凝乳酶销售的酶活力为80IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:180，然后在温度4℃下搅拌0.8h，得到所述的菌乳混合液；
C、微胶囊制备
按照以质量计15％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入花生油植物油，在搅拌下反应20min形成均匀的W/O型乳化液，然后，
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是4：10，然后静置30min，使用离心设备在转速3200r/min的条件下进行离心分离14min，按照沉淀物与洗涤液重量比1:3，其沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤3次，得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冷冻柜中在温度-82℃的条件下预先冷冻2.0小时，再置于由日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机中在温度-47℃与真空度0.02MPa的条件下冷冻干燥20小时，于是得到所述的益生菌微胶囊。
本实施例制备的益生菌微胶囊进行了包埋率、形态、耐胃酸性、肠液释放性、抗真空冷冻性和贮藏性的测试。本实施例制备的益生菌微胶囊中益生菌包埋率达到76.6％，经冷冻干燥后的益生菌存活率达66.2％，形态、耐胃酸性、肠液释放性和耐贮藏性测试结果与附图1-4的结果相同。这些结果充分说明，本发明的益生菌微胶囊无论在包埋率、形态特征，还是耐胃酸性、肠液释放性、抗冷冻性和贮藏稳定性，都表现出良好的性能，说明本发明的方法是一种具有实际应用的可靠包埋方法。
实施例3：本发明益生菌微胶囊的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
将由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室获得的植物乳杆菌P8益生菌接种于由Oxoid公司以商品名MRS Broth销售的MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下活化培养20小时进行活化培养三代，再使用离心设备在转速3700r/min的条件下进行离心分离14min，收集菌泥，按照菌泥与生理盐水的重量比1：6，所述菌泥再用浓度为以质量计20％的灭菌生理盐水洗涤3次，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为1.4×109cfu/mL的浓缩菌液，接着用由Oxoid公司以商品名MRS Agar销售的MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5.6×109cfu/mL；
B、菌乳混合液配制
将由Fonterra(New Zealand)公司以商品名skimmed milk powder销售的脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计35％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的12％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入由北京博奥拓达科技有限公司以商品名凝乳酶销售的酶活力为95IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:220，然后在温度4℃下搅拌1.2h，得到所述的菌乳混合液；
C、微胶囊制备
按照以质量计16％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入芝麻油植物油，在搅拌下反应18min形成均匀的W/O型乳化液，然后，
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是8：15，然后静置24min，使用离心设备在转速3800r/min的条件下进行离心分离12min，按照沉淀物与洗涤液重量比1:4，其沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤2次，得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冷冻柜中在温度-80℃的条件下预先冷冻2.5小时，再置于由日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机中在温度-44℃与真空度0.01MPa的条件下冷冻干燥24小时，于是得到所述的益生菌微胶囊。
本实施例制备的益生菌微胶囊进行了包埋率、形态、耐胃酸性、肠液释放性、抗真空冷冻性和贮藏性的测试。本实施例制备的益生菌微胶囊中益生菌包埋率达到76.8％，经冷冻干燥后的益生菌存活率达65.5％，形态、耐胃酸性、肠液释放性和耐贮藏性测试结果与附图1-4的结果相同。这些结果充分说明，本发明的益生菌微胶囊无论在包埋率、形态特征，还是耐胃酸性、肠液释放性、抗冷冻性和贮藏稳定性，都表现出良好的性能，说明本发明的方法是一种具有实际应用的可靠包埋方法。
实施例4：本发明益生菌微胶囊的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、菌株活化
将由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室获得的植物乳杆菌LIP-1益生菌接种于由Oxoid公司以商品名MRS Broth销售的MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下活化培养18小时进行活化培养三代，再使用离心设备在转速4000r/min的条件下进行离心分离15min，收集菌泥，按照菌泥与生理盐水的重量比1：5，所述菌泥再用浓度为以质量计26％的灭菌生理盐水洗涤4次，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为1.3×109cfu/mL的浓缩菌液，接着用由Oxoid公司以商品名MRS Agar销售的MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5.5×109cfu/mL；
B、菌乳混合液配制
将由Fonterra(New Zealand)公司以商品名skimmed milk powder销售的脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计34％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；
按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的11％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入由北京博奥拓达科技有限公司以商品名凝乳酶销售的酶活力为120IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:110，然后在温度5℃下搅拌1.0h，得到所述的菌乳混合液；
C、微胶囊制备
按照以质量计20％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入豆油植物油，在搅拌下反应16min形成均匀的W/O型乳化液，然后，
往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是5：14，然后静置27min，使用离心设备在转速4000r/min的条件下进行离心分离10min，按照沉淀物与洗涤液重量比1:3，其沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤3次，得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入由海尔公司以商品名超低温冰箱销售的冷冻柜中在温度-80℃的条件下预先冷冻2.5小时，再置于由日本SANYO公司以商品名真空冷冻干燥机销售的真空冷冻干燥机中在温度-46℃与真空度0.02MPa的条件下冷冻干燥22小时，于是得到所述的益生菌微胶囊。
本实施例制备的益生菌微胶囊进行了包埋率、形态、耐胃酸性、肠液释放性、抗真空冷冻性和贮藏性的测试。本实施例制备的益生菌微胶囊中益生菌包埋率达到76.9％，经冷冻干燥后的益生菌存活率达65.8％，形态、耐胃酸性、肠液释放性和耐贮藏性测试结果与附图1-4的结果相同。这些结果充分说明，本发明的益生菌微胶囊无论在包埋率、形态特征，还是耐胃酸性、肠液释放性、抗冷冻性和贮藏稳定性，都表现出良好的性能，说明本发明的方法是一种具有实际应用的可靠包埋方法。

Claims (8)

1.一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、菌株活化
将选自植物乳杆菌LIP-1、干酪乳杆菌ZHANG或植物乳杆菌P8的益生菌接种于MRS液体培养基进行活化培养三代，再采用离心分离方法收集菌泥，它再用灭菌生理盐水洗涤，然后重悬于无菌水中，混匀得到一种益生菌密度为109cfu/mL的浓缩菌液，接着用MRS琼脂培养基在温度37℃下倾注培养48h，经计数得到倾注培养液的活菌菌密度为5×109cfu/mL；
B、菌乳混合液配制
将脱脂乳粉溶解于蒸馏水中配制成以质量计30～35％的溶液，并在温度4℃下搅拌过夜得到一种脱脂乳液；按照浓缩菌液质量为脱脂乳液质量的10～12％，将步骤A得到的浓缩菌液加到所述的脱脂乳液中，充分搅拌，再加入酶活力为80～120IMCU/mL的凝乳酶，其中以毫升计菌乳混合液与以微升计凝乳酶的比为1:180～220，然后在温度3～5℃下搅拌0.8～1.2h，得到所述的菌乳混合液；所述的凝乳酶选自来自牛胃、猪胃或羊胃的动物性凝乳酶、来自无花果树液或菠萝果实的植物性凝乳酶或来自霉菌或酵母菌的微生物凝乳酶；
C、微胶囊制备
按照以质量计15～20％把CaCO3加到在步骤B得到的菌乳混合液中，混合均匀，再按照植物油与菌乳混合液质量比10:1加入植物油，在搅拌下反应15～20min形成均匀的W/O型乳化液，然后，往所述W/O型乳化液中加入冰醋酸，其中以微升计冰醋酸与以克计W/O型乳化液的比是4～8：10～15，然后静置20～30min，离心分离，其沉淀物经洗涤得到湿的微胶囊；
D、冷冻干燥
将步骤C得到的湿微胶囊放入冷冻柜中预先冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，于是得到所述的益生菌微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述的益生菌在温度37℃的条件下活化培养16～20小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，使用离心设备在转速3000～4000r/min的条件下进行离心分离10～15min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的植物油选自玉米胚油、花生油、芝麻油或豆油。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，按照沉淀物与洗涤液重量比1:2～4，分离的沉淀物用无菌生理盐水或无菌蒸馏水洗涤2-3次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，所述的湿微胶囊在冷冻柜中在温度-78～-82℃的条件下预先冷冻2.0～3.0小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，预冷冻的湿微胶囊在真空冷冻干燥机中在温度-43～-47℃与真空度0.01～0.02MPa的条件下冷冻干燥20～24小时。
8.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述制备方法得到的益生菌微胶囊，其特征在于所述益生菌微胶囊的平均粒径是100μm、所述益生菌的活菌含量是108CFU/g；在模拟人工胃液中在温度37℃下保温2.5h时所述益生菌的活菌数减少100.22CFU/g；在模拟人工肠液中在温度37℃下保温90min时，所述的益生菌完全释放，所述益生菌的活菌数是108.0～109.5CFU/g；在温度(4～37℃)下贮藏28d后，所述益生菌的活菌数大于107CFU/g。
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