CN104894093B - 一种转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其步骤如下：一、采用灭菌蒸馏水配制4～10％(w/w)的大豆分离蛋白溶液，以0.3～2mol/L HCl调节蛋白质溶液pH为6.5～8.0；二、按照10～40U/g蛋白质的浓度加入转谷氨酰胺酶，使用磁力搅拌器搅拌均匀，在30～50℃交联1～4h，然后立即使用冰水浴冷却，之后放入2～8℃冰箱贮存备用；三、向经交联处理的大豆分离蛋白溶液中加入5～15倍乳杆菌浓缩液，搅拌5～15min混合均匀后，再经冷冻干燥制备微胶囊。本发明进一步推广了大豆分离蛋白凝胶和乳杆菌的实际应用，进而可以更好的保护活乳杆菌的数量，为微胶囊化乳杆菌的工业化生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用转谷酰氨酶交联技术所形成的大豆分离蛋白凝胶对乳杆菌进行保护的方法。
背景技术
乳杆菌是在发酵食品和益生菌制品生产中经常使用的菌株，也是哺乳动物肠道内的有益微生物，主要的益生作用包括：平衡肠道菌群、改善肠道功能、控制血清胆固醇水平、防止腹泻、抗癌等。
但在乳杆菌的应用和食用过程中会遭遇各种胁迫，例如酸奶体系中的酸胁迫，腌制品中的盐胁迫，储藏过程中的冷胁迫，益生菌进入胃肠道将会遭受到胆盐、酸、消化酶的影响等，这些胁迫环境会导致乳杆菌活菌数下降，进而影响乳杆菌的发酵和益生性能。为了确保益生菌在人体充分发挥益生作用，几个国际组织已经颁布了某些益生菌最小活菌数的标准，他们要求在出售的发酵乳中，嗜酸乳杆菌最小活菌数应达到107cfu/mL，双歧杆菌应达到106cfu/mL。在日本，发酵乳和乳饮料协会要求在发酵乳饮品中双歧杆菌活菌数至少要达到107cfu/mL。
微胶囊(microencapsule)是一种能包埋和保护某些敏感性物质的具有聚合物壁壳的半透性的微型“容器”或“包装物”。通过特殊的方法，利用天然或合成的高分子材料包覆固体、液体甚至是气体物质，制成有囊壁的微型胶囊以及保留或截留其它物质的微粒，从而达到保护、控释等效果，这一过程称为微胶囊化(microencapsulation)。微胶囊化的目的是建立一个微环境，在这里敏感的活性物质可以在加工和贮存过程中更好的存活下来，然后在消化道中适当位点(例如小肠)被释放出来。有研究发现，在加工、贮存过程中，或者当乳杆菌在人体胃肠道中传递时，微胶囊能够起到保护乳杆菌的作用。因为微胶囊能削弱低pH胃酸、胆盐等胁迫环境对益生菌的伤害，同样在液态产品，如乳制品中也有同样的作用。
通常，在以海藻酸等多糖凝胶为微胶囊化的壁材时，常会用到CaCl2、甲醛、戊二醛这样的化学交联剂或醛类固化剂，残留的化学交联大分子会存在毒性，严重限制了微胶囊产品在食品中的应用。而转谷氨酰胺酶作为一种无毒的酶类可以催化多种蛋白形成水不溶性的凝胶，替代常用的多糖凝胶，避免引入有毒的交联剂，扩大微胶囊在食品领域中的应用。将乳杆菌微胶囊制备成粉末状可以使食品中的乳杆菌在加工、运输、贮存和食用之前保持较高存活率。常用的干燥方法有喷雾干燥法和真空冷冻干燥法，因为乳杆菌对温度比较敏感，所以通过真空冷冻干燥法制备微胶囊粉末，更有利于保持较高的存活率。因此利用转谷氨酰胺酶交联大豆分离蛋白，并利用真空冷冻干燥技术制备乳杆菌微胶囊，势必推动微胶囊领域的变革，为益生菌微胶囊的开发与应用提供一个新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，通过研究微胶囊中乳杆菌的冻干存活率，确定达到最好保护作用的转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白的条件；对结构特性的研究，揭示交联处理会加强保护性的原因；通过在模拟胃液和模拟肠液中存活率的分析，确定微胶囊化后抗性提高；通过贮存稳定性和在酸奶中的应用实验，进一步验证其在发酵食品中应用的可行性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，包括以下步骤：
一、采用灭菌蒸馏水配制4～10％(w/w)的大豆分离蛋白溶液，以0.3～2mol/L HCl(HCl使用0.22μm滤膜过滤除菌)调节蛋白质溶液pH为6.5～8.0；
二、按照10～40U/g蛋白质的浓度加入转谷氨酰胺酶(TGase)，使用磁力搅拌器搅拌均匀，在30～50℃交联1～4h，然后立即使用冰水浴冷却，之后放入2～8℃冰箱贮存备用。
三、向经交联处理的大豆分离蛋白溶液中加入5～15倍乳杆菌浓缩液，其加入量为经交联处理的大豆分离蛋白溶液的5～15％(w/w)，搅拌5～15min混合均匀后，再经冷冻干燥制备微胶囊，得到微胶囊化效率为67.4±2.7％。
本发明中，所述的冷冻干燥是将乳杆菌与交联处理后获得的蛋白质溶液混合均匀后先在-15～-25℃预冻7～12h，然后真空冷冻干燥8～17h。
本发明具有如下优点：
1、本发明利用转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白形成的凝胶对乳杆菌进行保护。
2、本发明拓展了凝胶制品的应用领域，尤其是在生物活性物质领域的应用。
3、本发明所获得的利用转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白包埋乳杆菌制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊在pH2.5和pH3.5的模拟胃液中作用2h后的存活率分别为5.25±0.50％和12.38±0.62％，显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)(分别为1.04±0.07％和2.87±0.38％)。鼠李糖乳杆菌微胶囊在含有0.3％和2％胆盐的模拟肠液中作用4h后的存活率分别为13.82±0.72％和4.43±0.50％，显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)(分别为4.21±0.53％和0.92±0.06％)。
4、本发明含有乳杆菌的微胶囊具有良好的储存稳定性，适用于在发酵食品等中的应用。鼠李糖乳杆菌微胶囊经真空包装后在4℃条件下贮藏21d后，发现鼠李糖乳杆菌活菌数下降1.00Log10(cfu/g)，存活率为10.04±0.50％。37℃条件下贮藏21d后，LGG活菌数下降1.89Log10(cfu/g)，存活率为1.30±0.04％。显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.05)(存活率分别为：1.42±0.12％和0.17±0.01％)。将鼠李糖乳杆菌微胶囊应用于酸奶，在4℃下储存21d后，鼠李糖乳杆菌活菌数仅下降0.73Log10(cfu/g)，存活率为14.49±0.53％，极显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)(存活率为2.65±0.46％)。
5、本发明进一步推广了大豆分离蛋白凝胶和乳杆菌的实际应用，进而可以更好的保护活乳杆菌的数量，为微胶囊化乳杆菌的工业化生产奠定基础。
附图说明
图1为不同TGase添加量制备的微胶囊的微胶囊化效率和未经交联冻干粉末中LGG存活率；
图2为不同交联时间制备的微胶囊的微胶囊化效率和未经交联冻干粉末中LGG存活率；
图3为不同交联温度制备的微胶囊的微胶囊化效率和未经交联冻干粉末中LGG存活率；
图4为不同交联pH制备的微胶囊的微胶囊化效率和未经交联的冻干粉末中LGG存活率；
图5为微胶囊化和未微胶囊化的LGG在模拟胃液中的存活率；
图6为微胶囊化和未微胶囊化的LGG在模拟肠液中的存活率；
图7为微胶囊和未微胶囊化粉末在4℃条件下贮存的LGG存活率；
图8为微胶囊和未微胶囊化粉末在37℃条件下贮存的LGG存活率；
图9为酸奶贮存期间LGG的存活率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
浓缩菌悬液的制备：
将鼠李糖乳杆菌LGG培养液加入到离心管中，在4℃条件下，6000r/min离心15min弃上清。菌泥用等体积生理盐水(0.9％NaCl溶液)在相同离心条件下洗涤两次，用原菌液1/10体积的生理盐水重新悬浮菌泥，得到十倍浓缩菌悬液。
实施例2
LGG微胶囊制备条件的优化
通过单因素和响应面试验确定最佳酶添加量、交联时间、交联温度、交联pH。
单因素试验结果见图1-4，响应面试验设计及结果见表1，回归模型进行方差和显著性检验分析见表2。
表1
表2
结论：利用Design-Expert 7.0软件获得最佳微胶囊制备条件：TGase添加量为30.8U/g蛋白质，交联时间为2.2h，交联温度为42℃，交联pH为7.4，预测微胶囊化效率为68.3％。以该条件进行验证试验，实际测得微胶囊化效率为67.4±2.7％，试验值与预测值之间无显著差异(P＜0.01)，证明采用响应面法优化得到的微胶囊制备条件准确可靠，具有实用价值。此条件下，未经过交联的对照组中LGG经冻干后存活率仅为29.6±3.1％。
实施例3
鼠李糖乳杆菌LGG微胶囊的制备
以灭菌蒸馏水配制7％(w/w)的大豆分离蛋白溶液，以1mol/L HCl调节蛋白质pH为7.4(HCl使用0.22μm滤膜过滤除菌)，按照30.8U/g蛋白质的浓度加入转谷氨酰胺酶(TGase)，使用磁力搅拌器搅拌均匀，在42℃交联2.2h，立即使用冰水浴冷却，之后放入4℃冰箱贮存备用。取2mL浓缩菌悬液加入到18g转谷氨酰胺酶交联后的大豆分离蛋白溶液中，搅拌均匀后在-20℃预冻10h，真空冷冻干燥12h。
实施例4
微胶囊化的LGG在模拟胃液和肠液中的存活率
将经过交联和未经过交联的冻干粉末分别加入装有100mL模拟胃液(pH2.5和pH3.5)和模拟肠液(含0.3％和2％胆盐)的三角瓶中，调节模拟肠液中LGG浓度约2×108cfu/mL，将上述三角瓶放入37℃摇床中，设定摇床转速为150r/min。每隔一定时间取1mL模拟胃液或肠液加入到装有9mL 0.1mol/L PBS缓冲溶液的试管中，将该试管放入上述摇床中30min，之后取样、梯度稀释、涂布、菌落计数。
LGG存活率按照下面的公式计算：
其中，Nt为第t分钟时每毫升模拟胃液(肠液)中LGG的活菌数，N0为第0分钟时每毫升模拟胃液(肠液)中LGG活菌数。
本发明所获得的利用转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白包埋乳杆菌制备的鼠李糖乳杆菌微胶囊在pH2.5和pH3.5的模拟胃液中作用2h后的存活率分别为5.25±0.50％和12.38±0.62％，显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)(分别为1.04±0.07％和2.87±0.38％)。鼠李糖乳杆菌微胶囊在含有0.3％和2％胆盐的模拟肠液中作用4h后的存活率分别为13.82±0.72％和4.43±0.50％，显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)(分别为4.21±0.53％和0.92±0.06％)，见图5-6。
实施例5
LGG微胶囊的贮存稳定性
将制备好的鼠李糖乳杆菌LGG微胶囊分装后进行真空包装，置于4℃和37℃贮存21d，每3天测定一次微胶囊中LGG的存活率。微胶囊中LGG存活率按照实施方式4的公式计算，此时Nt为储存第t天时每克微胶囊中LGG的活菌数，N0为第0天时每克微胶囊中LGG活菌数。
本发明含有乳杆菌的微胶囊具有良好的储存稳定性，适用于在发酵食品等中的应用。鼠李糖乳杆菌微胶囊经真空包装后在4℃条件下贮藏21d后，发现鼠李糖乳杆菌活菌数下降1.00Log10(cfu/g)，存活率为10.04±0.50％。37℃条件下贮藏21d后，LGG活菌数下降1.89Log10(cfu/g)，存活率为1.30±0.04％。显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.05)(存活率分别为：1.42±0.12％和0.17±0.01％)。将鼠李糖乳杆菌微胶囊应用于酸奶，在4℃下储存21d后，鼠李糖乳杆菌活菌数仅下降0.73 Log10(cfu/g)，存活率为14.49±0.53％，极显著高于未经TGase交联的对-照组(P＜0.01)(存活率为2.65±0.46％)见图7-8。
实施例6
酸奶贮存时LGG存活率的测定
添加LGG微胶囊的酸奶的制备：新鲜牛乳→升温至60℃，加入7％蔗糖，搅拌均匀→80～85℃杀菌20min→冷却至42℃→加入发酵剂(0.05g/L)和鼠李糖乳杆菌LGG微胶囊(使灭菌乳中LGG含量约为2×108cfu/mL)→42℃发酵，以pH4.5为发酵终点→冰水浴冷却→分装(25℃)→后熟(4℃放置16h)→成品(4℃冷藏)。以后熟结束时为0d，将酸奶成品放入4℃冰箱贮存21d，每3d测定酸奶中鼠李糖乳杆菌LGG的存活率。
取4℃储存酸奶5g加入到45mL 0.1mol/L PBS缓冲溶液中，用磁力搅拌器充分搅拌30min后，取1mL混合液进行梯度稀释，取适当梯度稀释液100μL涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养48h后菌落计数。酸奶中LGG存活率按照实施方式4中的公式计算。此时Nt为酸奶储存第t天时每克酸奶中的活菌数，N0为酸奶储存0天时测得的每克酸奶中的活菌数。
酸奶贮存过程中，处理组酸奶中LGG存活率高于对照组，并且差异极显著(P＜0.01)，酸奶贮存21天后，处理组和对照组酸奶中LGG活菌数分别下降了0.73和1.34Log10(cfu/g)，存活率分别为14.49±0.53％和2.65±0.46％，微胶囊中LGG存活率显著高于未经TGase交联的对照组(P＜0.01)。见图9。
Claims (5)
1.一种转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、采用灭菌蒸馏水配制4～10％(w/w)的大豆分离蛋白溶液，以0.3～2mol/L HCl调节蛋白质溶液pH为6.5～8.0；所述HCl使用0.22μm滤膜过滤除菌；
二、按照20～40U/g蛋白质的浓度加入转谷氨酰胺酶，使用磁力搅拌器搅拌均匀，在35～50℃交联2～4h，然后立即使用冰水浴冷却，之后放入2～8℃冰箱贮存备用；
三、向经交联处理的大豆分离蛋白溶液中加入5～15倍乳杆菌浓缩液，其加入量为经交联处理的大豆分离蛋白溶液的5～15％(w/w)，搅拌5～15min混合均匀后，再经冷冻干燥制备微胶囊；所述冷冻干燥是将乳杆菌浓缩液与交联处理后获得的蛋白质溶液混合均匀后先在-15～-25℃预冻7～12h，然后真空冷冻干燥8～17h；所述乳杆菌为鼠李糖乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其特征在于所述转谷氨酰胺酶添加量为30.8U/g蛋白 质。
3.根据权利要求1所述的转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其特征在于所述交联时间为2.2h。
4.根据权利要求1所述的转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其特征在于所述交联温度为42℃。
5.根据权利要求1所述的转谷酰胺酶交联大豆分离蛋白保护乳杆菌的方法，其特征在于所述pH为7.4。
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