CN110025638B - 壳聚糖‐羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备 - Google Patents

壳聚糖‐羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖‑羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备，其中，壳聚糖‑羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，包括壁材以及被该壁材包裹的芯材，其中，所述芯材主要是由益生菌菌泥和海藻糖构成的混合物，所述壁材主要是由壳聚糖和羧甲基纤维素钠层层自组装构成的多层结构。本发明通过对益生菌微囊的细节结构(尤其是囊壁所采用的材料及结构)等进行改进，并对制备方法整体流程工艺进行相应设计，利用壳聚糖和羧甲基纤维素钠组分的聚电解质层层自组装形成的囊壁，得到的壳聚糖‑羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊耐酸、耐胆盐，耐消化酶、提高益生菌的稳定性，能够增强益生菌的肠道定植效果。

Description

壳聚糖‐羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备
技术领域
本发明属于益生菌制品技术领域，更具体地，涉及一种益生菌微囊及其制备方法，该益生菌微囊尤其是种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装形成的益生菌微囊。
背景技术
益生菌是指一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。益生菌在人体中具有调节肠道菌群、增强机体免疫力、降低胆固醇等功效，目前在世界范围内已开发多种益生菌食品、保健食品和药品。
研究发现，人体补充益生菌必须保证足量的活菌定植于肠道才能发挥作用，因此美国FDA推荐食品中活性益生菌的添加量最低限为106CFU/g 或106CFU/ml。益生菌存活条件极为苛刻，氧气、温度、湿度等对益生菌的存活有很大影响，可导致其在生产、运输、存储和销售过程中活菌数大幅减少，益生菌制剂的稳定性限制了其应用。同时，益生菌在进入消化道后易受到胃酸、胆盐和多种消化酶的破坏，难以保持足够的活菌数到达肠道定植，从而发挥作用。目前市场上益生菌制剂产品着力于解决货架期产品中所含有的活菌数量符合要求，但对于如何改善益生菌耐酸、耐胆盐性，提高益生菌在肠道活性和定植效果等问题上无有效解决方案，严重限制了益生菌制剂的功效。
为了改善益生菌存活条件苛刻、长期储存稳定性差、不耐酸、不耐胆盐和消化酶等缺点，目前制备益生菌微囊制剂研究较多。微囊化技术 (microencapsulation)是一种包埋益生菌的有效手段，采用天然或合成的高分子材料为囊材，通过化学、物理或物理化学法将活性物质即囊芯包裹起来形成具有半透性或密封性囊膜的微型胶囊。将益生菌活菌微囊化后，能在一定程度上使其与外界环境隔离，提高其对不利环境的耐受性。
目前，益生菌微囊壁材主要有酪蛋白、大豆分离蛋、乳清分离蛋白、明胶、黄原胶、壳聚糖、海藻酸钠或醋酸邻苯二甲酸纤维素中的一种或几种，一些研究表明，微囊化对益生菌在胃肠道消化液中的存活率并没有表现出显著地保护效果。其原因可能是微囊囊壁骨架过于疏松、结构多孔，微囊表面硬度小，导致消化液可进入囊芯中引起益生菌失活。
并且，现有的益生菌微囊制剂制备过程中，为保证制备过程中菌的存活率通常采用真空冷冻干燥法，该方法具有菌存活率高、低温等优点，但存在生产效率低，设备成本较高等缺点。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备方法，其中通过对益生菌微囊的细节结构(尤其是囊壁所采用的材料及结构)等进行改进，并对制备方法整体流程工艺进行相应设计，利用壳聚糖和羧甲基纤维素钠组分的聚电解质层层自组装形成的囊壁，得到的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊耐酸、耐胆盐，耐消化酶、提高益生菌的稳定性，能够增强益生菌的肠道定植效果。并且，本发明壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊的制备方法，除了可以采用常用的冷冻干燥法外，还可以采用喷雾干燥实现，菌存活率高，为益生菌微囊的干燥制备提供了多种可选途径。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，其特征在于，包括壁材以及被该壁材包裹的芯材，其中，所述芯材主要是由益生菌菌泥和海藻糖构成的混合物，所述壁材主要是由壳聚糖和羧甲基纤维素钠层层自组装构成的多层结构。
作为本发明的进一步优选，所述芯材中，所述益生菌菌泥与所述海藻糖两者的质量比为10:(0.5～6)；
优选地，所述益生菌菌泥与所述海藻糖两者的质量比为10:6。
作为本发明的进一步优选，所述壁材为壳聚糖与羧甲基纤维素钠层层自组装形成的2～18个复合层的多层结构，其中，任意一个复合层均包括一个壳聚糖子层结构和包裹着该壳聚糖子层结构的一个羧甲基纤维素钠子层结构；
优选地，所述壁材为壳聚糖与羧甲基纤维素钠层层自组装形成的3～6 个复合层的多层结构。
作为本发明的进一步优选，所述壳聚糖其脱乙酰度为75％～90％；
优选地，所述壳聚糖其脱乙酰度为85％～90％。
作为本发明的进一步优选，所述羧甲基纤维素钠取代度为35％～80％；
优选地，所述羧甲基纤维素钠取代度为50％～70％。
作为本发明的进一步优选，所述壁材中，壳聚糖层是利用壳聚糖水溶液制备形成，所述壳聚糖水溶液质量分数为0.1％～5％；
羧甲基纤维素钠层是利用羧甲基纤维素钠水溶液制备形成，所述羧甲基纤维素钠水溶液质量分数为0.1％～5％。
按照本发明的另一方面，本发明提供了制备上述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将活化后的益生菌菌泥配制成菌悬液，并向其中添加海藻糖，配制得到益生菌溶液用以作为芯材；
(b)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中，然后去掉不溶物，调节pH值至2.5～6，得到壳聚糖溶液；
(c)将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中，然后去掉不溶物，调节pH 值至2.5～6，得到羧甲基纤维素钠溶液；
(d)以步骤(a)得到的所述益生菌溶液为操作对象，将它与步骤(b) 得到的所述壳聚糖溶液两者混合，然后机械搅拌20～50min，固液分离得到固体，并用pH为2.5～6的醋酸溶液去除所得固体中未吸附的壳聚糖，从而得到表面为壳聚糖层的益生菌；
(e)将步骤(d)得到的所述表面为壳聚糖层的益生菌分散于去离子水中，使之与步骤(c)得到的所述羧甲基纤维素钠溶液两者混合，然后机械搅拌20～50min，固液分离得到固体，并用去离子水去除所得固体中未吸附的羧甲基纤维素钠，从而得到单个复合层的壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装的益生菌湿微囊；
(f)以步骤(e)得到的所述单个复合层的壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊为操作对象，重复步骤(d)和步骤(e)中的操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊；
(g)将步骤(f)得到的所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊干燥，即可得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。
作为本发明的进一步优选，步骤(b)中，所述醋酸溶液为体积分数为 1％的醋酸溶液；所述去掉不溶物具体是采用抽滤工艺；所述调节pH值具体是采用NaOH水溶液；
步骤(c)中，所述去掉不溶物具体是采用抽滤工艺；所述调节pH值具体是采用体积分数为10％的醋酸溶液；
步骤(d)中，所述固液分离具体是采用抽滤工艺或离心工艺；
步骤(e)中，所述固液分离具体是采用抽滤工艺或离心工艺；
步骤(g)中，所述干燥具体是采用真空冷冻干燥工艺或喷雾干燥工艺；优选的，所述喷雾干燥工艺中进风温度为70～100℃；
此外，步骤(b)中，所述壳聚糖溶液的pH值是被调节至5；步骤(c) 中，所述羧甲基纤维素钠溶液的pH值是被调节至5；步骤(d)中，所采用的所述醋酸溶液其pH值为5。
作为本发明的进一步优选，步骤(a)中，所述益生菌溶液中菌泥质量浓度为10～30％，菌泥与海藻糖质量比为10:(0.5～6)；
步骤(b)中，所述壳聚糖溶液质量分数为0.1％～5％；
步骤(c)中，所述羧甲基纤维素钠溶液质量分数为0.1％～5％；
步骤(d)中，所述益生菌溶液与所述壳聚糖溶液体积比满足1:(5～20)；
步骤(e)中，所述表面为壳聚糖层的益生菌分散于去离子水中后，益生菌质量浓度为10～30％；表面为壳聚糖层的益生菌溶液与所述羧甲基纤维素钠溶液体积比为1:(5～20)。
作为本发明的进一步优选，步骤(f)中，重复步骤(d)和步骤(e) 中的操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊，具体是重复步骤(d)和步骤(e)中的操作三次得到预定组装四次的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于利用壳聚糖与羧甲基纤维素钠这两种物质的静电作用通过层层自组装方式配合形成多层聚电解质囊壁(即壁材)，并包裹益生菌芯材，可显著改善益生菌耐酸、耐胆盐性，提高益生菌的稳定性，增强益生菌的定植效果。而层层自组装法制备益生菌微囊技术是一种简单、高效、可重复性高的方法，同时成本低，通用性强，适合工业化生产。
本发明利用天然聚电解质间的静电结合形成多层致密结构，保护能力好。本发明先形成壳聚糖层微囊，再利用自组装形成壳聚糖-羧甲基纤维素钠复合结构层微囊，每一层复合结构都是由单层壳聚糖与单层羧甲基纤维素钠通过静电结合形成致密的结构，如此重复多次构成的多层结构，从而显著改善微囊表面疏松多孔的性质，并提高微囊表面硬度，提高益生菌的稳定性，减少益生菌活菌在胃酸、胆汁和消化酶中的暴露时间，尤其当复合结构层的层数大于5时，具有较强的保护作用。若将壳聚糖和羧甲基纤维素钠仅通过物理溶解混合制备的微囊囊壁，由于其表面不能形成致密结构，将失去对益生菌芯材的保护意义。
本发明还优选通过控制壳聚糖脱乙酰度，将壳聚糖其脱乙酰度控制为 75％～90％(更优选为85％～90％)，进一步确保了壳聚糖的表面性能及溶解度。并且，壳聚糖水溶性较差，其随着脱乙酰度提高可增强水溶性，一般需用 1％醋酸溶液溶解。壳聚糖水溶液在pH较低时，其溶解性好，包载率高，表面电荷密度大，与羧甲基纤维素钠静电结合更紧密，但菌种在低pH环境下易失活，导致制备过程中的存活率低。本发明优选将pH值选定为2.5～6(尤其是5)，保证了制备过程中益生菌的存活率，也可满足益生菌微囊的包载率以及微囊表面结构致密。此外，由于壳聚糖在pH较低时会带有高密度电荷，可形成多聚电解质稳定性结构，而中性条件下壳聚糖材料不稳定、易聚集，因此一般以羧甲基纤维素钠层为外层。
总体来说，本发明中壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，该益生菌微囊包含芯材和壁材，芯材为益生菌，添加海藻糖作为益生菌保护剂；壁材为壳聚糖与羧甲基纤维素钠，利用两种物质的静电作用通过层层自组装方式配合形成多层聚电解质囊壁，并且，该益生菌可以通过冻干或喷雾干燥制备。本发明的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊可显著改善益生菌耐酸、耐胆盐性，提高益生菌的稳定性，增强益生菌的定植效果；相应的，本发明中壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊的制备方法，同时也是一种提高益生菌耐酸性的方法，提升益生菌耐胆盐性的方法。
现有技术中的益生菌微囊，一般以益生菌和保护剂为芯材，壁材选用天然高分子材料制备成微囊，再采用固化法在微囊外层形成包衣，此益生菌微囊囊壁骨架过于疏松、结构多孔，微囊表面硬度小，微囊表面易破裂，导致消化液可进入囊芯中引起益生菌失活，此益生菌微囊虽有良好的存储稳定性，但在耐酸、耐胆盐，耐消化酶、和增强益生菌的肠道定植效果性能上无法满足人体需求。本发明提供的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，芯材为益生菌和保护剂海藻糖，壁材利用天然聚电解质羧甲基纤维素钠和壳聚糖之间的静电结合，可人为控制形成多层聚电解质络合膜，从而显著改善微囊表面疏松多孔的性质，并提高微囊表面硬度，提高益生菌的稳定性，减少益生菌活菌在胃酸、胆汁和消化酶中的暴露时间。同时壁材中的壳聚糖具有良好的生物相容性与肠道黏附性，可增强益生菌在肠道中的定植效果。
此外，本发明提供的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊可采用真空冷冻干燥工艺或喷雾干燥工艺得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。通过喷雾干燥得到益生菌微囊干粉能保持较高的活力，稳定性好，具有耐酸性、耐胆盐、耐消化酶性能。并且，即使是采用现有益生菌制剂制备中最常用的冷冻干燥法，与常规冻干工艺中将保护剂添加于溶液中不同，本发明中由于将保护剂(海藻糖)与益生菌一同包裹在微囊内，可起到较好的保护作用。
本发明提供的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊可应用在药品制剂、食品或保健品。其中，药品制剂包括粉末、胶囊、片剂以及其它药品学上可接受的剂型。食品包括压片果糖、固体饮料、乳制品、蛋白粉、奶酪、冰激凌以及其他食品学上可接受的食品形式。保健品包括胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒冲剂、茶剂。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中，芯材为益生菌，益生菌可以选嗜热链球菌、酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌中的一种或几种；优选乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种。
下述实施例中，芯材和壁材水溶液所用溶剂为无菌水，壳聚糖水溶液、羧甲基纤维素钠水溶液都经过湿热灭菌，灭菌温度为121.0℃，灭菌时间为 15min。当然，也可以采用其他灭菌工艺。
所采用的主要溶液：
人工模拟胃液：取0.1mol/L浓度的盐酸16.4mL，并称取10g胃蛋白酶，将两者混合后加水搅匀定容至1000mL，调节pH至1.2，过滤除菌制得人工模拟胃液；
人工模拟肠液配制方法：同样先称取6.8g的磷酸二氢钾用250mL的去离子水进行溶解，之后利用0.2mol/L浓度的氢氧化钠溶液调节pH值至 8.0，另称取10g的胰蛋白酶加400mL的去离子水将其溶解，最后将两种溶液进行混合后，加水定容至1000mL，过滤除菌制得人工肠液。
实施例1
本实施例提供一种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将活化后的乳杆菌菌泥配制成质量浓度10％的菌悬液，添加海藻糖，海藻糖质量浓度6％，配制益生菌溶液芯材；
(b)将壳聚糖溶解在体积分数为1％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液质量分数为0.1％，然后抽滤去掉不溶物，用NaOH水溶液调节其pH值至5；
(c)将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中，羧甲基纤维素钠溶液质量分数为0.1％，然后抽滤去掉不溶物。用体积分数为10％的醋酸溶液调节其 pH值至5；
(d)将步骤(a)益生菌溶液加入步骤(b)壳聚糖溶液中，体积比为 1:20，机械搅拌30min，抽滤并用pH为5的醋酸溶液去除未吸附的壳聚糖，得到单层壳聚糖包载益生菌湿微囊。
(e)将步骤(d)的表面为壳聚糖层的益生菌分散于pH为5的去离子水中(以便将壳聚糖层的益生菌分散开来，方便实验操作)，质量浓度为 20％，然后加入步骤(c)羧甲基纤维素钠溶液，体积比为1:20，机械搅拌 30min，抽滤并用去离子水去除未吸附的羧甲基纤维素钠。得到单层壳聚糖 -羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊。
(f)将步骤(e)得到的单层壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊重复步骤(d)和(e)操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊。
(g)将步骤(f)制备的益生菌湿微囊于-80℃预冻1h，然后在冷阱温度-50℃、真空度约为25Pa条件下冷冻干燥约48h，得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。
益生菌微囊制剂质量研究
1)解囊后活力检测
益生菌微囊由于聚电解质壁材的包裹，需要先用解囊液释放益生菌后测定其活力，解囊液一般采用人工模拟肠液。
乳酸菌的活力检测参照GB 4789.35—2016方法执行。
2)包埋产率的计算
Figure BDA0002012933950000091
Figure BDA0002012933950000092
产品中活菌数：微胶囊样品放入人工肠液中彻底崩解后，测定液体中活菌数。
产品表面活菌数：微胶囊样品用适量灭菌生理盐水洗涤，测定洗涤液中活菌数。
起始加入的活菌数：测定起始加入的菌泥活菌数。
结果显示，益生菌微囊包埋率随层层自组装次数的增加而降低，层层自组装六次的冻干微囊包埋率为49.84％，活菌数高达1.6×108CFU/g，符合要求。
Figure BDA0002012933950000101
注：上表中的每一层均表示一个壳聚糖子层结构和包裹着该壳聚糖子层结构的一个羧甲基纤维素钠子层结构两者构成的一个复合层结构；下同。
3)微囊肠道释放曲线
取1g微囊置于10mL人工模拟肠液中，37±1℃恒温振荡(180rpm 培养)，分别在15min、30min、45min、60min、90min、120min取出样品测定其活菌数。获得的活菌数用以计算微胶囊的解囊率。结果显示层层自组装次数越多解囊速率越小，3～6层囊壁在120min内可完全溶解，菌体存活率达90％以上。结果证明壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装微囊显著提高菌体在肠道的稳定性，有效延缓益生菌在小肠液中的释放，提高菌体在肠道中的定植效果。
4)微囊耐酸性能测定
取一定量的微囊置于盛有100mL，pH为1.0的稀盐酸水溶液的三角瓶中，于摇床中37℃，180rpm培养，处理0.5h、1h、1.5h、2h时取样中和至中性，测定微囊活菌数并计算存活率，根据存活率来分析微胶囊在酸性条件下的溶出情况。
Figure BDA0002012933950000111
结果显示，乳酸菌制成壳聚糖-羧甲基纤维素钠微囊后耐酸性能优良，菌体存活率几乎无变化，该微囊显著提升菌体耐酸性。同时层层自组装层数越多保护效果越显著。
5)微囊耐胆盐性能测定
在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中添加2％质量浓度的胆盐，在37℃条件下，每2h测定微囊在该环境中的菌体存活率，考察微胶囊对胆盐的耐受情况。
Figure BDA0002012933950000112
结果显示，壳聚糖-羧甲基纤维素钠乳酸菌微囊较未包埋时耐胆盐性能显著提升，层层自组装层数越多增强耐胆盐性能越显著。
6)微囊长期稳定性
称取微囊3g，压盖密封后装入铝袋塑封保存于4℃恒温实验箱，于90 天取样品测量活菌数，测定冻干菌粉和冻干微胶囊的菌体存活率，考察长期稳定性。结果显示，益生菌冻干微囊存活率显著高于未包埋菌粉，证明微囊制剂可有效提高菌体长期稳定性。
Figure BDA0002012933950000121
实施例2
本实施例提供一种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将活化后的乳杆菌菌泥配制成质量浓度30％的菌悬液，添加海藻糖，海藻糖质量浓度18％，配制益生菌溶液芯材；
(b)将壳聚糖溶解在体积分数为1％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液质量分数为5％，然后抽滤去掉不溶物，用NaOH水溶液调节其pH值至5；
(c)将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中，羧甲基纤维素钠溶液质量分数为5％，然后抽滤去掉不溶物。用体积分数为10％的醋酸溶液调节其 pH值至5；
(d)将步骤(a)益生菌溶液加入步骤(b)壳聚糖溶液中，体积比为 1:5，机械搅拌30min，，1000转离心5分钟并弃掉上清，用pH为5的醋酸溶液去除未吸附的壳聚糖，得到单层壳聚糖包载益生菌湿微囊。
(e)将步骤(d)的表面为壳聚糖层的益生菌分散于pH为5的去离子水中，质量浓度为30％，然后加入步骤(c)羧甲基纤维素钠溶液，体积比为1:5，机械搅拌30min，1000转离心5分钟并弃掉上清，用去离子水去除未吸附的羧甲基纤维素钠。得到单层壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊。
(f)将步骤(e)得到的单层壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊重复步骤(d)和(e)操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊。
(g)将步骤(f)制备的益生菌湿微囊分散于去离子水中，然后通过喷雾干燥得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。喷雾干燥工艺参数为：进风温度82℃，出风温度60℃。
益生菌微囊制剂质量研究
1)解囊后活力检测和包埋产率的计算
益生菌微囊由于聚电解质壁材的包裹，需要先用解囊液释放益生菌后测定其活力，解囊液一般采用人工模拟肠液。
乳酸菌的活力检测参照GB 4789.35—2016方法执行。
Figure BDA0002012933950000131
2)微囊肠道释放曲线
取1g微囊置于10mL人工模拟肠液中，37±1℃恒温振荡(180rpm 培养)，分别在15min、30min、45min、60min、90min、120min取出样品测定其活菌数。获得的活菌数用以计算微胶囊的解囊率。结果喷雾干燥制备的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊与冻干干燥的微囊肠道释放曲线基本一致，3～6层囊壁在120min内可完全溶解，菌体存活率达85％以上，结果证明该微囊显著提高菌体在肠道的稳定性，有效延缓益生菌在小肠液中的释放，提高菌体在肠道中的定植效果。
3)微囊耐酸性能测定
取一定量的微囊置于盛有100mL，pH为1.0的稀盐酸水溶液的三角瓶中，于摇床中37℃，180rpm培养，处理0.5h、1h、1.5h、2h时取样中和至中性，测定微囊活菌数并计算存活率，根据存活率来分析微胶囊在酸性条件下的溶出情况。
Figure BDA0002012933950000141
结果显示，喷雾干燥制备的乳酸菌微囊后耐酸性能优良，菌体存活率几乎无变化，该微囊显著提升菌体耐酸性。同时层层自组装层数越多保护效果越显著。
4)微囊耐胆盐性能测定
在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中添加2％浓度的胆盐，在37℃条件下，每2h测定微囊在该环境中的菌体存活率，考察微胶囊对胆盐的耐受情况。
Figure BDA0002012933950000151
结果显示，喷雾干燥制备的乳酸菌微囊较冻干制备的微囊在耐胆盐性能基本一致，可显著增强耐胆盐性能。
5)微囊长期稳定性
称取微囊3g，压盖密封后装入铝袋塑封保存于4℃恒温实验箱，于90 天取样品测量活菌数，测定微胶囊的菌体存活率，考察长期稳定性。结果显示，经过90天的稳定性试验后喷雾干燥菌粉的活菌数为0.1×106CFU/g，菌体存活率为0.1％，低于添加量最低限，益生菌喷雾干燥微囊存活率显著高于未包埋菌粉，微囊活菌数为1.2×108CFU/g，符合要求。证明微囊喷雾干燥制剂可有效提高菌体长期稳定性。
Figure BDA0002012933950000152
(一)未包埋对益生菌活性及稳定性的影响
对比例1
本对比例提供一种益生菌冻干粉及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将活化后的乳杆菌菌泥配制成质量浓度20％的菌悬液，添加海藻糖，海藻糖质量浓度12％，配制益生菌溶液芯材；
(b)将益生菌溶液放置在安培瓶中，于-80℃预冻1h，然后在冷阱温度-50℃、真空度约为25Pa条件下冷冻干燥约48h，得到益生菌冻干粉样品。开展益生菌微囊和冻干粉样品活力、耐酸性、耐胆盐和长期稳定性测定。
冻干菌粉耐酸性能测定
取一定量的冻干菌粉置于盛有100mL，pH为1.0的稀盐酸水溶液的三角瓶中，于摇床中37℃，180rpm培养，处理0.5h、1h、1.5h、2h时取样中和至中性，测定活菌数并计算存活率。
Figure BDA0002012933950000161
结果显示，乳酸菌冻干菌粉耐酸性较差，30min后存活率仅为3.9％。
冻干菌粉耐胆盐性能测定
在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中添加2％浓度的胆盐，在37℃条件下，每2h测定冻干菌粉在该环境中的菌体存活率，考察冻干菌粉对胆盐的耐受情况。
Figure BDA0002012933950000162
Figure BDA0002012933950000171
结果显示，高胆盐环境中未包埋的乳酸菌存活率较低，胆盐处理2小时后乳酸菌存活率仅为2.6％。
冻干菌粉长期稳定性
称取冻干菌粉3g，压盖密封后装入铝袋塑封保存于4℃恒温实验箱，于90天取样品测量活菌数，测定冻干菌粉的菌体存活率，考察长期稳定性。结果显示，未包埋的冻干菌粉存活率仅为0.4％，活菌数为1.3×106CFU/g，冻干菌粉长期稳定性较差。
Figure BDA0002012933950000172
对比例2
本对比例提供一种益生菌喷雾干燥粉及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将活化后的乳杆菌菌泥配制成质量浓度20％的菌悬液，添加海藻糖，海藻糖质量浓度12％，配制益生菌溶液；
(b)将步骤(a)制备的益生菌溶液通过喷雾干燥得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。喷雾干燥工艺参数为：进风温度82℃，出风温度60℃。测定益生菌喷雾干燥样品活力和长期稳定性。益生菌喷雾干燥样品中活菌数为1.1×108CFU/g，存活率为34.37％。
喷雾干燥菌粉长期稳定性
称取喷雾干燥菌粉3g，压盖密封后装入铝袋塑封保存于4℃恒温实验箱，于90天取样品测量活菌数，测定喷雾干燥菌粉的菌体存活率，考察长期稳定性。结果显示，经过90天的稳定性试验后喷雾干燥菌粉的活菌数为 0.1×106CFU/g，菌体存活率为0.1％，低于添加量最低限。
Figure BDA0002012933950000181
(二)其它壁材制备的微囊对益生菌活性及稳定性的影响
对比例3
本对比例提供一种壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)将活化后的乳杆菌菌泥配制成质量浓度20％的菌悬液，添加海藻糖，海藻糖质量浓度12％，配制益生菌溶液芯材；
(b)将阿拉伯胶和海藻酸钠溶解在去离子水中，阿拉伯胶溶液质量分数为10％，海藻酸钠溶液质量分数为2％，然后抽滤去掉不溶物；
(c)将步骤(a)益生菌溶液加入步骤(b)阿拉伯胶和海藻酸钠混合溶液中，按体积比为1:5混合均匀，用微胶囊发生器喷射将上述混合均匀的溶液以逐滴滴入的方式，挤压到置于磁力搅拌器(100r/min)上的质量浓度 3％CaCl2溶液中，连续搅拌30min，形成胶囊。
(d)将壳聚糖溶解在体积分数为1％的醋酸溶液中，壳聚糖溶液质量分数为5％，然后抽滤去掉不溶物，用NaOH水溶液调节其pH值至5；
(e)将步骤(c)所得微囊加入到步骤(d)壳聚糖溶液中，磁力搅拌 60min，洗涤过滤，得到壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊。
(f)将步骤(e)制备的益生菌湿微囊于-80℃预冻1h，然后在冷阱温度-50℃、真空度约为25Pa条件下冷冻干燥约48h，得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。
益生菌微囊制剂质量研究
1)解囊后活力检测和包埋产率
该益生菌微囊由于壳聚糖的包裹，需要先用解囊液释放益生菌后测定其活力，解囊液一般采用人工模拟肠液。
乳酸菌的活力检测参照GB 4789.35—2016方法执行。
结果显示，该益生菌微囊包埋率56.36％，活菌数高达1.8×108CFU/g，符合要求。
2)微囊肠道释放曲线
取1g微囊置于10mL人工模拟肠液中，37±1℃恒温振荡(180rpm 培养)，分别在15min、30min、45min、60min、90min、120min取出样品测定其活菌数。获得的活菌数用以计算微胶囊的解囊率。结果显示该微囊在 45min内可完全溶解，菌体存活率达90％以上。
3)微囊耐酸性能测定
取一定量的微囊置于盛有100mL，pH为1.0的稀盐酸水溶液的三角瓶中，于摇床中37℃，180rpm培养，处理0.5h、1h、1.5h、2h时取样中和至中性，测定微囊活菌数并计算存活率，根据存活率来分析微胶囊在酸性条件下的溶出情况。
Figure BDA0002012933950000191
Figure BDA0002012933950000201
结果显示，乳酸菌制成壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊在盐酸溶液中的菌体存活率明显低于壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌冻干微囊。
4)微囊耐胆盐性能测定
在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中添加2％浓度的胆盐，在37℃条件下，每2h测定微囊在该环境中的菌体存活率，考察微胶囊对胆盐的耐受情况。
Figure BDA0002012933950000202
结果显示，乳酸菌制成壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠微胶囊较未包埋时抗胆盐性能有所提升，但明显低于壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌冻干微囊的保护能力。
5)微囊长期稳定性
称取微囊3g，压盖密封后装入铝袋塑封保存于4℃恒温实验箱，于90 天取样品测量活菌数，测定冻干菌粉和冻干微胶囊的菌体存活率，考察长期稳定性。结果显示，壳聚糖-阿拉伯胶-海藻酸钠益生菌微胶囊存活率显著高于未包埋菌粉，证明微囊制剂可有效提高菌体长期稳定性。
Figure BDA0002012933950000211
上述实施例仅以pH值为5的壳聚糖溶液、羧甲基纤维素钠溶液、为去除未吸附的游离壳聚糖所采用的醋酸溶液为例，它们适用的pH值除了5外，还可以采用满足2.5～6范围内的其它值。另外，益生菌微囊及其制备方法中所用原料药及辅料均可由市场购得。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，其特征在于，包括壁材以及被该壁材包裹的芯材，其中，所述芯材是由益生菌菌泥和海藻糖构成的混合物，所述壁材为壳聚糖与羧甲基纤维素钠层层自组装形成的3～6个复合层的多层结构，其中，任意一个复合层均包括一个壳聚糖子层结构和包裹着该壳聚糖子层结构的一个羧甲基纤维素钠子层结构；
所述芯材中，所述益生菌菌泥与所述海藻糖两者的质量比为10:(0.5～6)；
所述壳聚糖其脱乙酰度为75％～90％；
所述羧甲基纤维素钠取代度为35％～80％；
所述壁材中，壳聚糖层是利用壳聚糖水溶液制备形成，所述壳聚糖水溶液质量分数为0.1％～5％；
羧甲基纤维素钠层是利用羧甲基纤维素钠水溶液制备形成，所述羧甲基纤维素钠水溶液质量分数为0.1％～5％。
2.如权利要求1所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，其特征在于，所述芯材中，所述益生菌菌泥与所述海藻糖两者的质量比为10:6。
3.如权利要求1所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，其特征在于，所述壳聚糖其脱乙酰度为85％～90％。
4.如权利要求1所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊，其特征在于，所述羧甲基纤维素钠取代度为50％～70％。
5.制备如权利要求1-4任意一项所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌微囊的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将活化后的益生菌菌泥配制成菌悬液，并向其中添加海藻糖，配制得到益生菌溶液用以作为芯材；
(b)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中，然后去掉不溶物，调节pH值至2.5～6，得到壳聚糖溶液；
(c)将羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中，然后去掉不溶物，调节pH值至2.5～6，得到羧甲基纤维素钠溶液；
(d)以步骤(a)得到的所述益生菌溶液为操作对象，将它与步骤(b)得到的所述壳聚糖溶液两者混合，然后机械搅拌20～50min，固液分离得到固体，并用pH为2.5～6的醋酸溶液去除所得固体中未吸附的壳聚糖，从而得到表面为壳聚糖层的益生菌；
(e)将步骤(d)得到的所述表面为壳聚糖层的益生菌分散于去离子水中，使之与步骤(c)得到的所述羧甲基纤维素钠溶液两者混合，然后机械搅拌20～50min，固液分离得到固体，并用去离子水去除所得固体中未吸附的羧甲基纤维素钠，从而得到单个复合层的壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装的益生菌湿微囊；
(f)以步骤(e)得到的所述单个复合层的壳聚糖-羧甲基纤维素钠自组装益生菌湿微囊为操作对象，重复步骤(d)和步骤(e)中的操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊；
(g)将步骤(f)得到的所述壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊干燥，即可得到固态化的壳聚糖-羧甲基纤维素钠益生菌微囊。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(b)中，所述醋酸溶液为体积分数为1％的醋酸溶液；所述去掉不溶物具体是采用抽滤工艺；所述调节pH值具体是采用NaOH水溶液；
步骤(c)中，所述去掉不溶物具体是采用抽滤工艺；所述调节pH值具体是采用体积分数为10％的醋酸溶液；
步骤(d)中，所述固液分离具体是采用抽滤工艺或离心工艺；
步骤(e)中，所述固液分离具体是采用抽滤工艺或离心工艺；
步骤(g)中，所述干燥具体是采用真空冷冻干燥工艺或喷雾干燥工艺；
此外，步骤(b)中，所述壳聚糖溶液的pH值是被调节至5；步骤(c)中，所述羧甲基纤维素钠溶液的pH值是被调节至5；步骤(d)中，所采用的所述醋酸溶液其pH值为5。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，步骤(g)中，所述喷雾干燥工艺中进风温度为70～100℃。
8.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(a)中，所述益生菌溶液中菌泥质量浓度为10～30％，菌泥与海藻糖质量比为10:(0.5～6)；
步骤(b)中，所述壳聚糖溶液质量分数为0.1％～5％；
步骤(c)中，所述羧甲基纤维素钠溶液质量分数为0.1％～5％；
步骤(d)中，所述益生菌溶液与所述壳聚糖溶液体积比为1:(5～20)；
步骤(e)中，所述表面为壳聚糖层的益生菌分散于去离子水中后，益生菌质量浓度为10～30％；表面为壳聚糖层的益生菌溶液与所述羧甲基纤维素钠溶液体积比为1:(5～20)。
9.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(f)中，重复步骤(d)和步骤(e)中的操作直至得到预定组装次数的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊，具体是重复步骤(d)和步骤(e)中的操作三次得到预定组装四次的壳聚糖-羧甲基纤维素钠层层自组装益生菌湿微囊。
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