CN114176225B - 一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents

一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法，属于微胶囊技术领域。所述制备方法包括如下步骤：分别制备多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、填充固体油脂的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、乙酰化的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、去除固体油脂的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体，制备层层自组装益生菌湿胶囊，最终制备得分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。本发明所得益生菌微胶囊，显著提高了益生菌的存活率。

Description

一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊及其制备 方法
本申请为以下申请的分案申请：申请日为20210318，申请号为202110290344.0，申请人为南昌大学，发明名称为一种层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法。
技术领域
本发明属于微胶囊技术领域，尤其涉及一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法。
背景技术
益生菌是一类对人体有益的活性微生物，具有调节宿主肠道菌群平衡，促进肠道营养物质吸收的作用。
为了保证足量的活菌定植于肠道，研究人员将益生菌微胶囊化，通过将益生菌包埋到更大的基质中，减少与有害环境的接触，从而有效提高了益生菌的活性。常用的益生菌微胶囊化方法包括喷雾干燥法、乳化法、挤压法和凝胶技术等，然而，这些方法仍存在益生菌存活率欠佳的问题。
发明内容
本发明提出一种层层自组装益生菌微胶囊及其制备方法，首先，利用聚乙烯亚胺等对多孔淀粉进行接枝改性，得内部孔隙带上大量正电荷，外部不带电的多孔淀粉。然后，利用益生菌表面带负电的性质，先后通过带正、负电的生物聚电解质(壳聚糖、果胶等)之间的静电相互作用，在益生菌表面形成多层保护，得最外层带负电的益生菌湿胶囊。最后，将多层益生菌湿胶囊通过静电相互作用自发地逐层吸附到多孔淀粉的微孔结构里，得层层自组装益生菌微胶囊。
本发明提出一种层层自组装益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)向多孔淀粉中加入缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺，二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃乳化，加入脂肪酶，40~50℃反应10~20min，离心，产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(5)将最外层带负电的多层益生菌湿胶囊置于上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，搅拌，干燥，得层层自组装益生菌微胶囊。
进一步地，步骤(1)中，所述淀粉包括玉米淀粉、木薯淀粉，大米淀粉，甘薯淀粉，马铃薯淀粉中至少一种；
步骤(1)中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的质量比为1~3：1；
步骤(1)中，恒温振荡为30~50℃震荡8~16h；
步骤(1)中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。
进一步地，步骤(2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1~4：0.32~0.6；
步骤(2)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基苯磺酸钠至少一种。
进一步地，步骤(3)中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例0.2~1.5g：2~10ml：10~50ml：1~5ml；
步骤(3)中，反应的时间为20~26h；
步骤(3)中，反应的温度为20~35℃。
进一步地，步骤(4)中，乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、乳化剂、脂肪酶的质量比为1.0 g：0.32~0.6g：0.1~1mg。
进一步地，步骤(5)中，所述最外层带负电的多层益生菌湿胶囊的制备方法包括：
将带正电的生物聚电解质溶液与菌悬液混合，搅拌，离心，洗涤，得一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊；然后，将一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊置于带负电的生物聚电解质溶液中，搅拌，离心，洗涤，得二层生物聚电解质吸附后的益生菌湿胶囊；
重复上述步骤，得最外层带负电的至少二层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊。
进一步地，所述步骤(5)中，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖；带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖中至少一种。
进一步地，步骤(5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液；所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
进一步地，还包括：步骤(6)，对步骤(5)所得益生菌微胶囊进行干燥，得干燥化的益生菌微胶囊。
本发明还提出一种层层自组装益生菌微胶囊，包括上述任一制备方法制备得到的益生菌微胶囊。
本发明具有以下优势：
本发明提出的益生菌微胶囊，以多孔淀粉为载体，制备内部带正电的，外部不带电的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体，然后将最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊有效的包裹在改性后多孔淀粉的内部，从而提高益生菌的存活率。并且，由于在益生菌表面形成层层包埋吸附的多层保护结构，延长了微胶囊在胃肠道中的消解时间，有效改善了益生菌在肠道输送和定植存活的效率。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1 为本发明实施例1、对比例1不同包埋过程中益生菌在存储时的存活情况；
图2 为本发明实施例1、对比例1不同包埋过程中益生菌在模拟胃液中的存活情况；
图3 为本发明实施例1、对比例1不同包埋过程中益生菌先在模拟胃液中消化2h，之后又移到模拟肠液中继续消化2h后的存活情况；
图4 是本发明实施例1中所得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的外表面以及所得乙酰化的填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的外表面的ZETA电位。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本申请发明人发现，由于制得的益生菌湿胶囊表面带负电，若多孔淀粉内外部均带正电，部分益生菌湿胶囊会被吸附到多孔淀粉的内部孔隙中，部分停留在其表面，被吸附到内部孔隙的益生菌湿胶囊可得到有效保护，但被吸附在多孔淀粉外表面的益生菌湿胶囊不会受到保护，无法进一步提高其在胃肠道中的存活率。因此，发明人提出一种仅在多孔淀粉内部包埋益生菌湿胶囊的结构，以有效提高益生菌的存活率。
本发明一实施例提出一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)向多孔淀粉中加入缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺，二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，将产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃乳化，加入脂肪酶，40~50℃反应10~20min，离心，将产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(5)将最外层带负电的多层益生菌湿胶囊置于上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，搅拌，干燥，得层层自组装益生菌微胶囊。
本发明实施例提出的益生菌微胶囊的制备方法，首先，采用聚乙烯亚胺接枝多孔淀粉，使多孔淀粉内外表面均带上大量正电荷(NH4 +)。然后，根据固态油脂的熔点特性，在多孔淀粉内部填充油脂后，采用三乙胺等对聚乙烯亚胺进行乙酰化修饰，中和多孔淀粉外表面的大量正电荷(NH4 +)，降低多孔淀粉外表面的氨基正电性，使得仅多孔淀粉内表面带大量正电荷。紧接着，采用脂肪酶去除固体油脂，得内表面带正电、外表面不带电的多孔淀粉。最后，利用静电相互作用，将最外层带负电的益生菌湿胶囊，成功吸附到内表面带正电的多孔淀粉微孔结构中，大大提高了益生菌的存活率。并且，由于益生菌表面形成层层包埋吸附的多层保护结构，延长了益生菌湿胶囊在胃肠道中的消解时间，有效改善了益生菌在肠道输送和定植存活的效率，提高了其在医药领域的商业应用价值。
本发明实施例中，步骤(1)制备采用聚乙烯亚胺对多孔淀粉进行改性，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体，使得多孔淀粉的内外表面均带正电。
本发明一实施例中，步骤(1)中，所述多孔淀粉由包括如下步骤制备而得：将淀粉、磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液的混合溶液、甲苯混合，加入酶解液，40℃恒温振荡24h，离心后，沉淀在60℃常压干燥，粉碎，得多孔淀粉。其中，所述酶解液中的酶为α-淀粉酶，糖化酶按照质量比为1:4组成的复合酶。
具体而言，所述淀粉包括玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉中至少一种。本发明实施例中，优先选用了多孔淀粉作为益生菌的包埋材料。多孔淀粉是变性淀粉的一种，来源广泛，安全无毒，具有类似蜂窝煤状的多孔结构，表面疏松多孔，可提高核心材料的粘附性和吸附性，具有良好的生物相容性和合适的孔径大小。此外，淀粉对胰淀粉酶具有抗性，在人体内被缓慢消化，且对肠道微生物群落和人体健康有益。
具体而言，步骤(1)中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的质量比为1~3:1。
具体而言，步骤(1)中，步骤(1)中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的pH为8.0。
具体而言，步骤(1)中，恒温振荡为30~50℃震荡8~16h。
具体而言，步骤(1)中，多孔淀粉、磷酸盐缓冲液的添加量为1g ：100mL。
本发明实施例中，步骤(2)中，根据油脂熔点的高低，采用油脂填充步骤(1)所得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
本发明一实施例中，步骤(2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1~4：0.32~0.6。其中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基苯磺酸钠中至少一种。乳化剂主要用于乳化固体油脂，制备乳状液。乳化剂以溶液的形式添加，例如，聚乙烯醇可以以质量分数为4%聚乙烯醇(PVA)水溶液形式添加10~15ml，即实际聚乙烯醇的质量为0.32~0.6g。
具体而言，步骤2)中，固体油脂通常是指动物油脂，例如，羊油，猪油，牛油，黄油等。
具体而言，步骤(2)中，所述乳化具体为：用分散机 14000 r/min乳化3 min后，取出并水浴保温5 min，再次乳化，如此重复至少3次。
具体而言，步骤2)中，冷却至室温，例如，可以为0~30℃，优选5~10℃。
本发明实施例中，步骤(3)中，对填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体进行乙酰化处理，中和掉多孔淀粉外表面的大量正电荷(NH4 +)，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
具体而言，步骤(3)中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例为0.2~1.5g：2~10ml：10~50ml：1~5ml。
具体而言，步骤(3)中，反应的时间为20~26h；反应的温度为20~35℃。
具体而言，步骤(3)中，所述透析具体为：先用磷酸盐缓冲液透析3次，每次用4L磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水透析3次，每次4L蒸馏水。
本发明实施例中，步骤(4)中，采用脂肪酶去除固体油脂，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的。
具体而言，步骤(4)中，所述乳化包括：用分散机 14000 r/min乳化3 min后，取出并水浴保温5 min，再次乳化，如此重复至少3次，乳化剂为10ml 4%聚乙烯醇(PVA)水溶液。
具体而言，步骤(4)中，保温的时间为5min。
具体而言，步骤(4)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基苯磺酸钠中至少一种。乳化剂主要用于乳化固体油脂，制备乳状液。乳化剂主要以溶液的形式添加，例如，聚乙烯醇可以以质量分数为4%聚乙烯醇(PVA)水溶液形式。
具体而言，步骤(4)中，乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、乳化剂、脂肪酶的质量比为1.0 g：0.32~0.6g：0.1~1mg。
本发明实施例中，步骤(5)中，所采用的最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊，先采用带正电的生物聚电解质对益生菌进行一层吸附，然后采用带负电的生物聚电解质进行二层吸附，所得二层生物聚电解质吸附后的益生菌湿胶囊的最外层所带负电与益生菌电性相同，便于填充于改性后的多孔淀粉内。
本发明一实施例中，步骤(5)中，所述最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌的制备方法包括：
将带正电的生物聚电解质溶液与菌悬液，搅拌，离心，洗涤，得一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊；然后，将一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊置于带负电的生物聚电解质溶液中，搅拌，离心，洗涤，得二层生物聚电解质吸附后的益生菌湿胶囊；重复上述步骤，得最外层带负电的至少二层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊。由于益生菌表面带负电，所以第一层吸附的聚电解质溶液是带正电的。
需要指出，生物聚电解质溶液可以为生物聚电解质的水溶液。去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液可以为其水溶液。
其中，步骤(5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液。所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。优选的，所述菌悬液由包括如下步骤制备：将益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，离心，收集菌体，洗涤，重悬于生理盐水，得浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml的菌悬液。步骤(5)中，去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、菌悬液的比例为1~3g：2ml~5 ml。
具体而言，所述生物聚电解质包括带正电的生物聚电解质、带负电的生物聚电解质。优选的，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖。优选的，带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖中至少一种。
具体而言，聚电解质溶液可以为壳聚糖的水溶液或果胶的水溶液。优选的，壳聚糖的水溶液的浓度可以为0.5mg/ml～2.5mg/ml，pH值为5.6。果胶的水溶液的浓度可以为0.5mg/ml～2.5mg/ml，pH值为5.6。
优选的，最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊的层数为4-12层。更优选的，最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊的层数为4~6层。具体可根据实际情况稍作调整。例如，第一层用壳聚糖吸附，第二层用果胶吸附，再采用壳聚糖吸附，然后再采用果胶吸附，如此，完成4层吸附。
本发明实施例所采用的层层自组装技术，主要通过静电相互作用使阴阳离子聚电解质交替吸附到益生菌表面，该制备工艺简单高效，包封更全面，使益生菌更容易抵抗外部胃酸或胆盐的侵蚀。
本发明一实施例中，还包括，对步骤(5)所得益生菌微胶囊进行干燥，得干燥化的益生菌微胶囊。所述干燥方法包括喷雾干燥或者冷冻干燥。
本发明一实施例还提出一种利用上述任一方法制备得到的层层自组装益生菌微胶囊。
本发明一实施例还提出一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊的制备方法，还包括步骤(6)：将步骤 (5) 得到的层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液通过谷氨酰胺转氨酶诱导凝胶化，形成分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。将层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液混合，再加入植物油，形成稳定且大小均匀的W/O乳化液，再加入交联剂谷氨酰胺转氨酶诱导凝胶化，谷氨酰胺转氨酶作为转移酶，谷氨酰胺转氨酶具有共价交联蛋白的能力，它通过谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸残基的交联形成分子间和分子内肽键。该方法制备出的益生菌微胶囊能大大提高益生菌在胃肠道中的存活率。
具体地，所述步骤(6)包括：将(5)得到的层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液两者混合，然后加入植物油，再加入谷氨酰胺转氨酶诱导凝胶化，再水浴磁力搅拌，然后离心得到微胶囊；用吐温80溶液洗涤两次沉淀，再用无菌生理盐水洗涤微胶囊两次，得分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。
进一步地，步骤(6)中，层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液的比例为1～2g：20～40ml。
进一步地，步骤(6)中，所述分离乳清蛋白溶液质量分数为1%～10%。
进一步地，步骤(6)中，植物油包括大豆油、橄榄油、葵花籽油、棕榈油中至少一种。
进一步地，步骤(6)中，植物油与分离乳清蛋白溶液的体积比为1:3～1:7。
进一步地，步骤(6)中，谷氨酰胺转氨酶的添加量为1～5g。
进一步地，步骤(6)中，磁力搅拌为40～50˚C搅拌0.5～1h。
进一步地，步骤(6)中，吐温80溶液质量分数为0.1%～0.5%。
进一步地，步骤(6)中，所述无菌生理盐水体积分数为0.9%。
本发明一实施例还提出利用上述任一制备方法制备得到的乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。
下面将结合实施例详细阐述本发明。
实施例1一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔淀粉的制备：2g生淀粉加入到250ml三角瓶中，加入pH4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸缓冲液，40ml，加入0.1ml甲苯，加入适当稀释酶液，40℃，恒温振荡24h,离心分离上清液，沉淀在60℃下常压干燥，粉碎即可。
(2)多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体制备：准确称取2.0g的玉米多孔淀粉，放于烧杯中，为了平衡载体，加入 200mL 的磷酸盐缓冲液(pH8.0)，放1h，然后向其中加入 1.0g 的聚乙烯亚胺，40℃恒温振荡10h，反应完成后用 pH8.0 的缓冲液冲洗，直到滤液无三硝基苯磺酸反应(TNBS)。用蒸馏水洗涤，最后对载体进行干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(3)填充固体油脂：将(2)所得1.0 g多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和1g固体油脂混合，加入10 m L 4%聚乙烯醇 (PVA)溶液，在50℃水浴保温5min，用高速分散机 14000 r/min乳化3 min后取出并水浴保温5 min, 再次乳化, 如此重复3次后离心(4000r,10min)，冷却至0℃，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(4)聚乙烯亚胺乙酰化：将(3)中1.2 g填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在100ml生理盐水中(pH8.0)，加入2ml三乙胺，10ml二甲亚砜，放在磁力搅拌器上充分搅拌30min,然后再逐滴加入1.41ml乙酸酐，该反应在室温下反应24h，最后将反应溶剂二甲亚砜，过量的反应物以及反应副产物通过透析法除去，即先用PBS磷酸盐缓冲液透析3次，每次4L，再用蒸馏水透析3次，每次4L，最后将产物的水溶液冷冻干燥，此时多孔淀粉的外表面聚乙烯亚胺已经被乙酰化，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(5)去除固体油脂：将(4)中1.0 g乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在生理盐水中(pH8.0)中，加入10 m L 4%聚乙烯醇 (PVA) 溶液,50℃水浴保温5 min, 用高速分散机14000 r/min乳化3 min，加入1mg脂肪酶40℃处理15min。离心，将产物的水溶液冷冻干燥，此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(6)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min 离心10 min收集菌体用无菌生理盐水(0.9% NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(7)生物聚电解质溶液的制备：称取200mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl 调整到5.6；称取200mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得浓度为1mg/ml的果胶溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(8)将步骤(6)中3ml浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1mg/ml壳聚糖溶液中，室温下温和搅拌30min，使壳聚糖聚电解质分子充分吸附在益生菌的表面。完成第一层吸附后，离心(4000s,10min)，弃去多余电解质，得到的沉淀菌泥用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(9)再将步骤(8)中菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1mg/ml果胶溶液中，pH调整到5.6，室温下温和搅拌30min，完成第二层吸附，离心(4000s,10min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(10)重复以上两个步骤，直到组装完成6层最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌。
(11)取步骤（10）所得多层生物聚电解质益生菌湿胶囊置于2mL含有2.0g改性后玉米多孔淀粉溶液的无菌试管中，摇床震荡(600g，3h，37℃)，使益生菌在多孔淀粉的孔径结构中被均匀吸附，让混合物沉淀2h，小心的将上清液排出，得到包埋好得益生菌微胶囊。
(12)将组装后的益生菌微胶囊溶液以5mL/min 的速度通过喷雾干燥机进行干燥，喷雾干燥结束后，立即收集制备得到的微胶囊粉末于无菌密封玻璃瓶中，并储存于 4℃保藏。
实施例2一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
同实施例1，不同之处在于，步骤(11)中，重复以上两个步骤，直到组装完成4层膜包被的层层自组装益生菌微胶囊。
实施例3一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔淀粉的制备:2g生淀粉加入到250ml三角瓶中，加入pH4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸缓冲液，40ml，0.1ml甲苯，加入适当稀释酶液，40℃，恒温振荡24h,离心分离上清液，沉淀在60℃下常压干燥，粉碎即可。
(2)多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体制备：准确称取2.0g的玉米多孔淀粉，放于烧杯中，为了平衡载体，加入 200mL 的磷酸盐缓冲液(pH8.0)，放1h，然后向其中加入 1.0g 的聚乙烯亚胺，50℃恒温振荡10h，反应完成后用 pH8.0 的缓冲液冲洗，直到滤液无三硝基苯磺酸反应(TNBS)。用蒸馏水洗涤，最后对载体进行干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(3)填充固体油脂：将(2)得l.0 g多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和1g固体油脂混合，加入10 mL 4%聚乙烯醇 (PVA) 溶液，在45℃水浴保温5min，用高速分散机 14000 r/min乳化3 min后取出并水浴保温5 min, 再次乳化, 如此重复3次后离心(4000r,10min)，冷却至10℃，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(4)聚乙烯亚胺乙酰化：将(3)中得1.2 g填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在100ml生理盐水中(pH8.0)，加入2ml三乙胺，10ml二甲亚砜，放在磁力搅拌器上充分搅拌30min,然后再逐滴加入1.41ml乙酸酐，该反应在室温下反应24h，最后将反应溶剂二甲亚砜，过量的反应物以及反应副产物通过透析法除去，即先用PBS磷酸盐缓冲液透析3次，每次4L，再用蒸馏水透析3次，每次4L，最后将产物的水溶液冷冻干燥，此时多孔淀粉的外表面聚乙烯亚胺已经被乙酰化，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(5)去除固体油脂：将(4)中1.0 g乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在生理盐水中(pH8.0)中，加入10 m L 4%聚乙烯醇 (PVA) 溶液,45℃水浴保温5 min, 用高速分散机14000 r/min乳化3 min，加入0.5mg脂肪酶45℃处理20min。离心，将产物的水溶液冷冻干燥，此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(6)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min 离心10 min收集菌体用无菌生理盐水(0.9% NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(7)生物聚电解质溶液的制备：称取300mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得到浓度为1.5 mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl 调整到5.6；称取300mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的果胶溶液，pH用0.15MNaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(8)将菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml壳聚糖溶液中，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，使壳聚糖聚电解质分子充分吸附在益生菌的表面，完成第一层吸附后，离心(3500s，15min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(9)再将步骤(8)中菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml果胶溶液中，pH调整到5.6，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，完成第二层吸附，离心(3500s，10min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(10)重复以上两个步骤，直到组装完成6层最外层带负电的多层生物聚电解质吸附的益生菌。
(11) 取步骤（10）所得多层生物聚电解质益生菌湿胶囊置于2mL含有2.0g改性后玉米多孔淀粉溶液的无菌试管中，摇床震荡(600g,3h，37℃)，使多层益生菌湿胶囊成功吸附到改性后多孔淀粉的内部孔径中，让混合物沉淀2h，小心的将上清液排出，得包埋好得益生菌微胶囊。
(12)将上述益生菌微胶囊沉淀物置于无菌培养皿中，在冰柜中(-20℃)预冷4h，然后冷冻干燥24h，微胶囊收集在10ml无菌试管中，并于4℃下冷藏保存。
实施例4一种乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊的制备方法
步骤（1）~（11）同实施例1。
(12)将步骤(11)得到的益生菌微胶囊2g与40ml 5%分离乳清蛋白溶液混合，然后加入200ml大豆油，再加入2g 谷氨酰胺转氨酶诱导凝胶化，在45˚C水浴中，磁力搅拌1h，然后离心（4000r，10min）得到微胶囊，用20ml 0.2%吐温80溶液洗涤两次沉淀，再用20ml 0.9%无菌生理盐水洗涤微胶囊两次，即可得到由分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。
(13)将上述益生菌微胶囊沉淀物置于无菌培养皿中，在冰柜中(-20℃)预冷4h，然后冷冻干燥24h，微胶囊收集在10ml无菌试管中，并于4℃下冷藏保存。
对比例1一种益生菌微胶囊的制备方法
聚电解质溶液的制备、菌悬液的制备同实施例1，然后直接制备经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊。具体包括如下步骤：
(1)制备聚电解质溶液：称取300mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl 调整到5.6；称取300mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的果胶溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(2)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min 离心10 min收集菌体用无菌生理盐水(0.9% NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(3)将菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml壳聚糖溶液中，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，使壳聚糖聚电解质分子充分吸附在益生菌的表面，完成第一层吸附后，离心(3500s，15min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(4)再将步骤(3)中菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml果胶溶液中，pH调整到5.6，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，完成第二层吸附，离心(3500s，10min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(5)重复以上两个步骤，直到完成预定组装层数的层层自组装益生菌微胶囊 。离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，得到包埋好的益生菌微胶囊。
试验例1益生菌微胶囊储存稳定性测试
准确称取未进行包埋的益生菌样品、对比例1所得经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊以及实施例1中经多孔淀粉和多层自组装复合包埋的益生菌微囊、实施例4所得乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊各3g，置于25℃下恒温保存，分别在0、5、10、15、20、25周之后取出计算其活菌数。保存不同时间之后的益生菌存活率如图1所示。
从图1中可以看出，未经包埋的益生菌很快全部死亡，经过6层层层自组装包埋的益生菌存活率虽然提高，但是已比初始浓度低了许多，实施例1中结合改性的多孔淀粉和层层自组装技术制得的益生菌微胶囊其储存稳定性有了明显的提高，在储存25周之后存活率仍能达到7~8 log CFU/ml。实施例4所得乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊可进一步提高益生菌存活率。
试验例2益生菌微胶囊对人工模拟胃肠液的耐受性
(1)人工模拟胃液实验
准确称取未进行包埋的益生菌样品、对比例1所得经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊以及实施例1所得经多孔淀粉和多层自组装复合包埋的益生菌微囊、实施例4所得乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊各 0.1g 的益生菌微胶囊添加至 9.9mL的模拟胃液中，并不断震荡混匀，在培养时间分别为 20、40、60、80、100、120min 时，从中取出1mL 的溶液立即添加进 9mL 的磷酸盐缓冲溶液中，并在 37℃下搅拌震荡 1h，使益生菌微胶囊充分解聚，随后通过梯度稀释，使用螺旋平板接种仪接种到 MRS 培养板中进行计数。结果见图2。
从图2中可以看出，未经包埋的益生菌在模拟胃液中很快全部死亡，6层包埋后的益生菌存活率下降了3.8个log，而多孔淀粉与层层组装复合包埋的益生菌存活了仅下降了1个log，说明实施例1所得益生菌胶囊具有很好的耐胃酸特性。实施例4所得乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊可进一步提高益生菌存活率。
(2)人工模拟肠液实验
在进行上述模拟胃液的处理以后，紧接着在 120min 的模拟胃液培养后，使用 1M的氢氧化钠将其 pH 调节至 7.0，然后加入 10mL 的模拟肠液，混合均匀，并在培养时间分别为 0、20、40、60、80、100、120min时，取出 1mL溶液，随后通过梯度稀释，使用螺旋平板接种仪接种到 MRS 培养板中，进行计数。结果见图3。
从图3中可以看出，未经包埋的益生菌早已在模拟胃液中全部死亡，无法到达指定肠道，6层层层自组装包埋后的益生菌存活率由106CFU/ml降到了104CFU/ml，无法达到人体最低限度值(106CFU/ml或106CFU/g)；而实施例1所得复合益生菌微囊经过模拟胃肠液的消化后，存活率仍能达到107CFU/ml ~108CFU/ml，说明这种复合结构对益生菌的保护更加有效，具有良好的耐酸，耐胆盐特性，它克服了传统壁材结构疏松不紧实的缺陷，实现了益生菌在胃中不释放，在肠道才释放的靶向释放定植的功效。实施例4所得乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊更进一步提高了益生菌存活率。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向多孔淀粉中加入缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；其中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的质量比为1~3：1；
(2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；其中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1~4：0.32~0.6；
(3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺、二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；其中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例0.2~1.5g：2~10ml：10~50ml：1~5ml；
(4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的溶液，40℃~50℃乳化，加入脂肪酶，40~50℃反应10~20min，离心，产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
(5)将最外层带负电的多层益生菌湿胶囊置于上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，搅拌，干燥，得层层自组装益生菌微胶囊；
其中，所述最外层带负电的多层益生菌湿胶囊的制备方法包括：
将带正电的生物聚电解质溶液与菌悬液混合，搅拌，离心，洗涤，得一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊；然后，将一层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊置于带负电的生物聚电解质溶液中，搅拌，离心，洗涤，得二层生物聚电解质吸附后的益生菌湿胶囊；
重复上述步骤，得最外层带负电的至少二层生物聚电解质吸附的益生菌湿胶囊；
(6)将上述层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液两者混合，然后加入植物油，再加入谷氨酰胺转氨酶诱导凝胶化，再水浴磁力搅拌，然后离心得到微胶囊；用吐温80溶液洗涤两次沉淀，再用无菌生理盐水洗涤微胶囊两次，得分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊，其中，层层自组装益生菌微胶囊与分离乳清蛋白溶液的比例为1～2g：20～40ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述淀粉包括玉米淀粉、木薯淀粉、大米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉中至少一种；
步骤(1)中，恒温振荡为30~50℃震荡8~16h；
步骤(1)中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇、十二烷基苯磺酸钠中至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中，反应的时间为20~26h；
步骤(3)中，反应的温度为20~35℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(4)中，乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、乳化剂、脂肪酶的质量比为1.0 g：0.32~0.6g：0.1~1mg。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(5)中，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖；带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖中至少一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液；所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010 CFU/ml。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(6)中，
所述分离乳清蛋白溶液质量分数为1%～10%；
植物油包括大豆油、橄榄油、葵花籽油、棕榈油中至少一种；
植物油与分离乳清蛋白溶液的体积比为5:1；
磁力搅拌为40～50˚C搅拌0.5～1h；
吐温80溶液质量分数为0.1%～0.5%。
9.权利要求1~8任一项所述的方法制备得到的分离乳清蛋白诱导的层层自组装益生菌微胶囊。
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