CN111838677A - 可培养的肠道菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents
可培养的肠道菌微胶囊及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可培养的肠道菌的微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：菌种活化、增殖培养、湿胶囊制备、二次包埋、干胶囊制备，得到肠道菌微胶囊。所述发明具有以下有益效果：采用挤压法技术制备微胶囊，可以有效解决肠道菌不耐酸、不耐氧的缺点，从而增加贮存稳定性。采用海藻酸钠‑壳聚糖作为微胶囊的壁材，以及用脱脂乳和低聚木糖为保护剂包埋菌体，不仅可以在菌株外形成的蛋白膜对细胞加以保护从而有效降低菌体的死亡率，而且糖类的加入能够减少细胞损伤，从而有效提高肠道菌群的存活率。本发明制备简单、工艺参数易控、生产效率高、经济易行，适合工业化规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及微胶囊制备技术领域，特别是涉及一种可培养的肠道菌种微胶囊的壁材及干燥方式的制备方法。
背景技术
肠道菌群包括有益菌、有害菌、条件致病菌三部分，其与人体健康的关系错综复杂，正常人的肠道菌群与宿主之间是相互依存、相互制约的关系，二者共同处于动态平衡状态之中。肠道菌群和宿主的健康状况有着密切的关系，参与了机体一系列的生命活动，包括机体营养物质的消化吸收、生物拮抗、免疫应答、黏膜屏障、抗肿瘤等。肠道菌群失衡时，人体免疫功能、维生素的合成、肠道蠕动、对病原菌的定植力等功能将会发生变化。肠道菌群作为一个大而复杂的生态系统，菌群携带的基因数量大约为人类基因组的上百倍，与人体的健康息息相关。但是多数肠道菌群对动物消化道内的胃酸、胆盐及各种消化酶耐受性相对较差，致使菌种在经过胃肠道时存活率降低。所以必须对肠道菌进行改造处理，保证菌体在肠道内的存活率。
微胶囊技术具有保护、运载以及延缓释放的效果；能够改善物质的物理性质，改变剂型；保护敏感成分，改善芯材稳定性；降低或掩盖不良气味；控释和缓释作用；降低毒性。壁材的选择直接影响微胶囊发挥作用。理想壁材需要具备无毒、性质稳定、生物相容性好、价格低廉、具有缓释作用等特点，主要的微胶囊壁材材料有以下三类：天然材料，半合成材料，合成材料。常用的壁材有海藻酸钠、果胶、壳聚糖、抗性淀粉、乳清蛋白等，为了更好的发挥微胶囊的作用，可以有两种方式。一是壁材选择两种或两种以上的物质进行复配使用，以弥补单一材料在使用过程中的缺陷，提高微胶囊的化学或稳定性。二是先用一种壁材制备得微胶囊，再用其他壁材对其进行二次或多次包衣，减小微胶囊表面的孔径，防止包封物质泄露及破坏物质进入，以此强化微胶囊的性能。
由于肠道菌进行微胶囊技术包埋后，菌种抵抗外界不良环境的能力可以得到显著加强，菌体在肠道中的存活率也随之提高。肠道细胞较为脆弱敏感，所以微胶囊化过程中操作要尽可能温和，减少细胞损伤，最大程度上保证细胞的存活率。主要包括的方法：挤压法，乳化法，复合凝聚法。挤压法操作简单、成本低廉，能保持较高的细胞密度和活性，较好地解决了其不耐酸、不耐氧的缺点。该方法首先将芯材物质和壁材物质混合均匀，然后通过针或喷嘴等压力将二者的混合物快速挤入冷却介质中使其迅速脱水降温，壁材析出硬化得到微胶囊。胶粒的大小和形状决定于针或喷嘴的直径以及下落的距离，通常呈球形。
本申请的目的在于解决多数肠道菌种无法在极端条件下存活，在动物消化道内的胃酸、胆汁盐及各种消化酶耐受性差，致使肠道菌群的免疫反应不明显的技术问题。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，提出一种提高肠道内菌体的存活率，保证菌种免疫效应的发挥，提高肠道菌种对不良环境的耐受性的微胶囊的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种可培养的肠道菌微胶囊，所述可培养的肠道菌微胶囊包括芯材和壁材，所述芯材为肠道菌，所述壁材外层上涂覆有壳聚糖；所述壁材为含有天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液，其中，
所述冻干保护剂包括脱乳脂、低聚木糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种；
所述天然高分子材料的壁材为海藻酸钠。
进一步优选为：所述肠道菌与混合溶液的质量比为1:1-1:6。
进一步优选为：所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-5%，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-15%。
本发明的另一个目的是提供一种肠道菌微胶囊的制备方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种可培养的肠道菌湿胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将冷藏的肠道菌接种至已灭菌的培养基中，然后取一定量肠道菌置于培养箱中进行活化。
(2)增殖培养：将活化好的肠道菌在与活化相同条件下进行增殖培养8-12h后，进行离心处理，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将所述菌泥加入到含有所述天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液中，混合均匀，得到菌悬液，再把所述菌悬液进行固化，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)二次包埋：将步骤(3)所得物加入到所述壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤，储存于4℃冰箱中备用。
(5)干胶囊的制备：将步骤(4)所得物放入-20℃冰箱中预冻12-24h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥12-24h，得到肠道菌干胶囊。
进一步优选为：所述肠道菌为植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母中的一种或几种。
进一步优选为：所述(1)中活化培养基为MRS培养基，培养条件为温度35-38℃，时间20-28h，进行三次活化培养。
进一步优选为：所述(2)中离心处理的离心转速为3000-6000r/min，离心时间为10-20min。
进一步优选为：所述(3)中肠道菌与混合溶液的质量比为1:1-1:6。
进一步优选为：所述(3)中混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-5%，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-15%。
进一步优选为：所述(3)中用于固化的溶液为1-5%CaCl2，固化时间为10-30min。
进一步优选为：所述(4)中壳聚糖的体积分数为5-10%。
与现有技术比较，本发明的有益效果在于：
(1)肠道菌微胶囊具有维持肠道菌群平衡、降低胆固醇、抑制病原菌生长，使好氧或厌氧活菌数量发挥最大免疫作用。
(2)肠道菌微胶囊兼具操作简单，成本低，稳定性良好，肠道菌存活率高的优点。
(3)采用挤压法技术制备微胶囊，可以有效解决肠道菌不耐酸、不耐氧的缺点，从而增加贮存稳定性。
(4)采用海藻酸钠-壳聚糖作为微胶囊的壁材，以及用脱脂乳为保护剂包埋菌体，不仅可以在菌株外形成的蛋白膜对细胞加以保护从而有效降低菌体的死亡率，而且糖类的加入能够减少细胞损伤，从而有效提高肠道菌群的存活率。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特性能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
实施例1：
本对比例提供一种蔗糖-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，以3%的接种量在35℃恒温培养箱中进行培养22h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的植物乳杆菌在与活化相同条件下进行增殖培养8h后，在3000r/min下离心10min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到4%的海藻酸钠溶液5mL中，与15%的蔗糖溶液5mL混匀，充分搅拌(200r/min，15min)，取5mL注入到5%CaCl2无菌溶液中固化30min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
检测发现，蔗糖-海藻酸钠微胶囊的活菌数仅为2.95×109CFU/mL。
将实施例1中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌湿胶囊在1天、10天、20天后的活菌数，测得活菌数如表1所示。
表1 肠道菌湿胶囊不同时间下活菌数对比
| 1天的活菌数 | 10天后的活菌数 | 20天后的活菌数 | |
| 湿胶囊 | 2.95×10<sup>9</sup> | 1.57×10<sup>7</sup> | 5.62×10<sup>6</sup> |
| 胃肠消化后 | 1.79×10<sup>6</sup> | 4.63×10<sup>5</sup> | 2.13×10<sup>5</sup> |
测试结果如表1所示。表1显示，制备得到的肠道菌湿胶囊基本满足实验需求，由于湿胶囊活菌数量随着保存时长的增加而剧烈下降，水分无法完全去除，且会析出，菌体细胞外湿度的增加不利于菌体的生长代谢，导致样品中活菌数量的降低。严重影响了发酵实验的进行，所以需要将湿胶囊进行干燥处理。
实施例2：
本对比例提供一种蔗糖-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，以3%的接种量在35℃恒温培养箱中进行培养24h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的植物乳杆菌在与活化相同条件下进行增殖培养10h后，在4000r/min下离心12min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到2%的海藻酸钠溶液5mL中，与15%的蔗糖溶液5mL混匀，充分搅拌(200r/min，15min)，取5mL注入到2%CaCl2无菌溶液中固化30min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)干胶囊的制备：将步骤(4)所得微胶囊放入-20℃冰箱中预冻12h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥12h，得到肠道菌干胶囊。
检测发现，蔗糖-海藻酸钠微胶囊的活菌数为4.26×106CFU/mL。
将实施例2中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌干胶囊的活菌数，测得活菌数为3.95×105CFU/mL。
由实验结果可知，经海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖包埋后，由于蔗糖的存在，冻干之后微胶囊黏度较大，菌存活率也没有显著提高，根据不同保护剂的特点，将蔗糖换为脱脂乳。脱脂乳提供菌体外蛋白衣的保护，在冷冻干燥过程中，在菌株外形成的蛋白膜对细胞加以保护从而有效降低菌体的死亡率。
实施例3：
本对比例提供一种海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，以5%的接种量在37℃恒温培养箱中进行培养24h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的植物乳杆菌在与活化相同条件下进行增殖培养12h后，在5000r/min下离心15min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到3%的海藻酸钠溶液5mL中，与10%的脱脂乳溶液5mL和低聚木糖混匀，充分搅拌(200r/min，15min)，取5mL注入到2%CaCl2无菌溶液中固化15min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)干胶囊的制备：将步骤(4)所得微胶囊放入-20℃冰箱中预冻20h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥20h，得到肠道菌干胶囊。
检测发现，海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖微胶囊的活菌数为4.75×108CFU/mL。
将实施例3中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌干胶囊的活菌数，测得活菌数仅为6.85×104CFU/mL。
由实验结果可知，经海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖包埋后，菌体的稳定性提高了，但是存活率不高，考虑到一步法包埋海藻酸钠和肠道菌形成网状结构，酸容易进入，菌存活率下降。
实施例4：
本对比例提供一种海藻酸钠-脱脂乳-海藻糖-壳聚糖微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，以4%的接种量在37℃恒温培养箱中进行培养24h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的植物乳杆菌在与活化相同条件下进行增殖培养12h后，在4000r/min下离心20min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到5%的海藻酸钠溶液5mL中，与10%的脱脂乳溶液5mL和海藻糖混匀，充分搅拌(300r/min，20min)，取5mL注入到3%CaCl2无菌溶液中固化20min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)二次包埋：将步骤(3)所得物加入到所述8%壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤，储存于4℃冰箱中备用。
(5)干胶囊的制备：将步骤(4)所得微胶囊放入-20℃冰箱中预冻24h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥24h，得到肠道菌干胶囊。
检测发现，海藻酸钠-脱脂乳-海藻糖-壳聚糖微胶囊的活菌数为3.98×108CFU/mL。
将实施例4中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌双侧包埋微胶囊在1天、10天、20天后的活菌数，测得活菌数如表2所示。
表2 肠道菌双层包埋微胶囊不同时间下活菌数对比
| 1天的活菌数 | 10天后的活菌数 | 20天后的活菌数 | |
| 0.25g微胶囊 | 3.98×10<sup>8</sup> | 1.36×10<sup>8</sup> | 4.95×10<sup>7</sup> |
| 胃肠消化后 | 1.35×10<sup>7</sup> | 1.65×10<sup>7</sup> | 1.55×10<sup>7</sup> |
测试结果如表2所示。表2显示，肠道菌微胶囊模拟胃肠消化后活菌1.35×107CFU/mL，即0.25g微胶囊经过2h的胃液消化和4h的肠液消化后，100mL胃肠液中共含有1.35×109CFU活菌，据规定肠道菌在大于107CFU就可发挥益生效应，故制备的微胶囊达到要求，可在肠道中发挥益生作用，且肠道菌微胶囊在保存20天时间内活菌率基本保持不变且稳定性良好，可作为体外发酵的材料，说明本申请的方案更有利于肠道菌的保存。
实施例5：
本对比例提供一种海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖-壳聚糖微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将双歧杆菌接种至MRS液体培养基中，以5%的接种量在37℃恒温培养箱中进行培养24h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的双歧杆菌在与活化相同条件下进行增殖培养12h后，在5000r/min下离心10min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到4%的海藻酸钠溶液5mL中，与5%的脱脂乳溶液5mL和低聚木糖混匀，充分搅拌(200r/min，15min)，取5mL注入到2%CaCl2无菌溶液中固化15min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)二次包埋：将步骤(3)所得物加入到所述5%壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤，储存于4℃冰箱中备用。
(5)干胶囊的制备：将步骤(4)所得微胶囊放入-20℃冰箱中预冻24h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥24h，得到肠道菌干胶囊。
检测发现，海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖-壳聚糖微胶囊的活菌数为4.35×108CFU/mL。
将实施例5中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌双侧包埋微胶囊在1天、10天、20天后的活菌数，测得活菌数如表2所示。
表3 肠道菌双层包埋微胶囊不同时间下活菌数对比
| 1天的活菌数 | 10天后的活菌数 | 20天后的活菌数 | |
| 0.25g微胶囊 | 4.35×10<sup>8</sup> | 1.57×10<sup>8</sup> | 5.62×10<sup>7</sup> |
| 胃肠消化后 | 1.75×10<sup>7</sup> | 1.70×10<sup>7</sup> | 1.60×10<sup>7</sup> |
测试结果如表3所示。表3显示，肠道菌微胶囊模拟胃肠消化后活菌1.75×107CFU/mL，即0.25g微胶囊经过2h的胃液消化和4h的肠液消化后，100mL胃肠液中共含有1.75×109CFU活菌，据规定肠道菌在大于107CFU就可发挥益生效应，故制备的微胶囊达到要求，可在肠道中发挥益生作用，且肠道菌微胶囊在保存20天时间内活菌率基本保持不变且稳定性良好，可作为体外发酵的材料，说明本申请的方案更有利于肠道菌的保存。
实施例6：
本对比例提供一种海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖-壳聚糖微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将产朊假丝酵母接种至MRS液体培养基中，以3%的接种量在37℃恒温培养箱中进行培养22h，进行三次活化培养。
(2)增殖培养：将活化好的产朊假丝酵母在与活化相同条件下进行增殖培养10h后，在5000r/min下离心15min，弃去上清液，得到菌泥。
(3)湿胶囊的制备：将5mL菌悬液加入到4%的海藻酸钠溶液5mL中，与10%的脱脂乳溶液5mL和低聚木糖混匀，充分搅拌(200r/min，15min)，取5mL注入到3%CaCl2无菌溶液中固化10min，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用。
(4)二次包埋：将步骤(3)所得物加入到所述5%壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤，储存于4℃冰箱中备用。
(5)干胶囊的制备：将步骤(4)所得微胶囊放入-20℃冰箱中预冻24h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥24h，得到肠道菌干胶囊。
检测发现，海藻酸钠-脱脂乳-低聚木糖-壳聚糖微胶囊的活菌数为3.75×108CFU/mL。
将实施例6中制备的微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中消化2h，之后用1mol/L NaOH溶液将pH调整至6.8，加入过滤除菌的模拟肠液50mL继续消化4h，测定肠道菌双侧包埋微胶囊在1天、10天、20天后的活菌数，测得活菌数如表2所示。
表4 肠道菌双层包埋微胶囊不同时间下活菌数对比
| 1天的活菌数 | 10天后的活菌数 | 20天后的活菌数 | |
| 0.25g微胶囊 | 3.75×10<sup>8</sup> | 1.26×10<sup>8</sup> | 4.35×10<sup>7</sup> |
| 胃肠消化后 | 1.13×10<sup>7</sup> | 1.30×10<sup>7</sup> | 1.53×10<sup>7</sup> |
测试结果如表4所示。表4显示，肠道菌微胶囊模拟胃肠消化后活菌1.13×107CFU/mL，即0.25g微胶囊经过2h的胃液消化和4h的肠液消化后，100mL胃肠液中共含有1.13×109CFU活菌，据规定肠道菌在大于107CFU就可发挥益生效应，故制备的微胶囊达到要求，可在肠道中发挥益生作用，且肠道菌微胶囊在保存20天时间内活菌率基本保持不变且稳定性良好，可作为体外发酵的材料，说明本申请的方案更有利于肠道菌的保存。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说， 在不脱离本发明构思前提下，还可做出若干简单推演或替换。凡在未脱离本发明技术方案的内容，所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种可培养的肠道菌微胶囊，所述可培养的肠道菌微胶囊包括芯材和壁材，所述芯材为肠道菌，所述壁材外层上涂覆有壳聚糖；所述壁材为含有天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液，其中，
所述冻干保护剂包括脱乳脂、低聚木糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种；
所述天然高分子材料的壁材为海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的可培养的肠道菌微胶囊，其特征在于，所述肠道菌与混合溶液的质量比为1:1-1:6。
3.根据权利要求1所述的可培养的肠道菌微胶囊，其特征在于，所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-5%，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-15%。
4.根据权利要求1-3任一项所述的可培养的肠道菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)菌种的活化：将冷藏的肠道菌接种至已灭菌的培养基中，然后取一定量肠道菌置于培养箱中进行活化；
(2)增殖培养：将活化好的肠道菌在与活化相同条件下进行增殖培养8-12h后，进行离心处理，弃去上清液，得到菌泥；
(3)湿胶囊的制备：将所述菌泥加入到含有所述天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液中，混合均匀，得到菌悬液，再把所述菌悬液进行固化，洗涤过滤，置于4℃冰箱中备用；
(4)二次包埋：将步骤(3)所得物加入到所述壳聚糖溶液中进行包衣，洗涤过滤，储存于4℃冰箱中备用；
(5)干胶囊的制备：将步骤(4)所得物放入-20℃冰箱中预冻12-24h，在-50℃真空冷冻干燥机中干燥12-24h，得到肠道菌干胶囊。
5.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述肠道菌为植物乳杆菌、双歧杆菌、产朊假丝酵母中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(1)中活化培养基为MRS培养基，培养条件为温度35-38℃，时间20-28h，进行三次活化培养。
7.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(2)中离心处理的离心转速为3000-6000r/min，离心时间为10-20min。
8.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(3)中肠道菌与混合溶液的质量比为1:1-1:6。
9.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(3)中混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-5%，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-15%。
10.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(3)中用于固化的溶液为1-5%CaCl2，固化时间为10-30min。
11.根据权利要求4所述肠道菌微胶囊的方法，其特征在于，所述(4)中壳聚糖的体积分数为5-10%。
12.如权利要求4-11任一项所述方法制备得到的肠道菌微胶囊。
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