CN104928278A - 一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，该方法将枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116菌悬液、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117菌悬液及弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115菌悬液混合后经发酵后得到发酵产物；然后将发酵产物中加入保护剂，菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到CaCl2固化液中固定化，固化后依次经过滤、低温冷冻干燥、吸附载体吸附、干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂。采用该方法制得的复合芽孢杆菌微胶囊制剂活不但菌含量高，还能有效避免高温、氧气、酸性环境对复合芽孢杆菌的胁迫，大大提高了复合芽孢杆菌在水产动物饲养过程中的应用效果。
Description
技术领域
本发明涉及水产动物用微生物制剂技术领域，特别涉及一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法。
背景技术
水产微生态制剂，是利用水产动物体内或养殖水体中的有益微生物经特殊加工工艺而形成的活菌制剂。它可以用于调节动物肠道内菌群平衡，增强水产动物的营养和免疫力。水产养殖中，常用的益生菌主要包括芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌、酵母菌和硝化细菌等。芽孢杆菌的抗逆性很强，耐高温、耐酸碱、耐挤压，可加工到颗粒饲料中而不改变活性，能调节肠道菌群，维持微生态平衡，能抑制肠道中的弧菌、沙门氏菌等有害菌群，促进其它有益菌种的成长。芽孢杆菌能够分泌各种消化酶，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性很高，有助于水产动物降解饲料中不易分解消化的成分，从而提高饲料转化率和利用率。可提高动物对钙、磷、铁的利用，促进维生素D的吸收。
一般的微生态制剂在应用时，要求其应以活的形式进入胃肠道，并且需要达到一定的数量才会具有益生作用。如果以死菌的形式进入动物体内，只能提供机体少量的菌体蛋白，益生效果甚微。当以活的形式进入体内时可以在肠道中萌发、增殖以及分泌代谢产物，发挥更大的功能。在绝大多数水产微生态制剂应用的过程中，绝大多数益生菌都会受到环境的破坏而失去作用，当益生菌的最低活菌浓度小于106 cfu/g时，益生效果将不是很显著。微胶囊技术是一项显著提高益生菌应用效果的技术，它是利用合成的高分子材料，将固体、液体甚至气体的微小颗粒包裹在半透性或密封性囊膜的微型胶囊内，使微胶囊内的物质与外界环境隔离，免受环境的影响，从而保持生物效能的稳定。在适当条件下，将包裹的物质释放出来发挥作用。将益生菌用微胶囊技术包埋在壁材内，可以降低外界环境对益生菌细胞的破坏，提高益生菌的存活率，保证在贮存过程中活菌的有效数量。经过微胶囊化的益生菌对肠道环境的抗逆性增强，有效避免溶菌酶、噬菌体和其它病原菌等因素的干扰，有利于在肠道内定植。
菌种本身的特性是发挥其效能的关键因素。不同的菌种菌属，其生理生化特性、代谢产物有一定的差异，对生长环境和宿主有很强的依赖性，对针对淡水或陆生动物的效果显著的益生菌未必对海水动物有效。所以本发明本着来源于自然，回归自然的原则，在水产动物的肠道和养殖环境中，筛选了与原宿主、原微生态系、原微生物种群相适应的芽孢杆菌，旨在经过合理配伍研制专门适应适于水产动物的复合益生菌制剂，并通过微胶囊技术对菌体进行包被，其制备材料易得、环保、简单、安全，微胶囊化的菌体可以有效避免高温、氧气、酸性环境的胁迫，大大提高了益生菌的应用效果。
一篇申请号为CN201310405575.7的中国发明申请中公开了一种兽用枯草芽孢杆菌微囊制剂及其制备方法，该制剂是将枯草芽孢杆菌活化，然后发酵培养，在发酵液中加入羧甲基纤维素，溶解制得混合液，再将混合液加入硫酸铝溶液中，形成凝聚囊，过滤得到凝聚囊，水洗，干燥得到兽用枯草芽孢杆菌微囊制剂。该发明的枯草芽孢杆菌制剂为微囊制剂，它是将菌体包裹后低温干燥制成，具有耐强酸、耐受抗生素等优点，能够有效保护枯草芽孢杆菌穿过胃酸，进入肠道起到其作为益生菌的作用。根据不同的菌种菌属，其生理生化特性、代谢产物有一定的差异，对生长环境和宿主有很强的依赖性的特点可知，该申请的枯草芽孢杆菌制剂为微囊制剂是兽用枯草芽孢杆菌制剂，因此，其对水产动物的效果极其有限的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，采用该方法制得的复合芽孢杆菌微胶囊制剂活不但菌含量高，还能有效避免高温、氧气、酸性环境对复合芽孢杆菌的胁迫，大大提高了复合芽孢杆菌应用效果。
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法,包括以下步骤：
（1）将枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116菌悬液、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117菌悬液及弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115菌悬液混合后接种到种子培养液中发酵制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液接种到发酵培养液中发酵得到发酵产物；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入保护剂，然后再加入1～5倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到CaCl2固化液中固定化处理，固化后经过滤、低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂。
为了提高制得的复合芽孢杆菌微胶囊制剂对水产动物的使用效果，可以将枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116菌悬液、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117菌悬液、弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115菌悬液以菌数比 1：1 ：2 ～ 1：2 ：3 的比例混合。以该比例范围配比，能达到最好的协同互补作用。
步骤（2）中所述的益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中所述多孔淀粉的含量为1%，所述海藻酸钠的含量为3.5%。将多孔淀粉与海藻酸钠合理配比，保证包埋效果的同时使复合芽孢杆菌微胶囊的质量得到保证，有效抵御各种胁迫，保证活菌含量。
步骤（2）所述的保护剂为海藻糖、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或一种以上的混合，保护剂的加入量为发酵产物体积的0.1～1%。
步骤（2）中所述的吸附载体为膨润土、硅藻土、沸石、麦麸中的一种或一种以上的混合。
制备得到的复合芽孢杆菌微胶囊制剂活菌数含量为8.6×1011 cfu/g。
步骤（2）中所述的冻干粉与吸附载体的重量比为1:1～1000。
步骤（1）中所述的发酵制备益生菌种子液时，菌悬液的接种量为种子培养液体积的3%，发酵条件为25～40℃，24～48h。
所述发酵产物是将益生菌种子液按发酵培养液体积的3%～5%接种到发酵培养液中，在压力为0.05-0.25 MPa，温度为25℃-36℃的密闭式发酵反应器中发酵24～48h，得到发酵产物。
本发明在复合芽孢杆菌的种子液制备及发酵过程中，采用针对于本发明复合芽孢杆菌的发酵工艺，保证发酵液中活菌含量的同时提高复合芽孢杆菌的抗胁迫性。
所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=1.5～3：0.7～1.3：100；所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=0.5～2：0.5～3：100。本发明的种子培养液及发酵培养液尤其适用于本发明复合芽孢杆菌的培养，有利于菌的生长及其他营养物质的产生。
本发明保存编号为YB-1 CGMCC No.5116的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、保存编号为YB-2 CGMCC No.5117的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、保存编号为XH-1 CGMCC No.5115的弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）记载于申请号为CN201210082156.X，名称为一种海参微生态水质调节剂及其制备方法的发明专利中，提交有存活证明，记载有其保藏编号及保藏日期。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
1、本发明方法特定的将完全分离于水产动物肠道和养殖环境中的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117、弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115组合，使得复合芽孢杆菌微胶囊制剂能有效清除水产动物肠道中的毒素，抑制有毒物质的合成，能在水产动物的肠道粘膜中黏附、占位、生长和繁殖，形成优势菌群，分泌消化酶和病原菌抑制物，在增强水产动物营养免疫功能的同时，抑制病原菌的生长；提供水产动物大量的维生素、矿物质、消化酶和未知生长因子等营养成分，提高饲料的转化率和利用率，加速水产动物的快速生长和繁育。
本发明方法制备步骤简单，采用该方法制备得到的复合芽孢杆菌微胶囊制剂稳定高效，保存时间长，不但活菌含量高，还能有效避免高温、氧气、酸性环境对复合芽孢杆菌的胁迫，大大提高了复合芽孢杆菌在水产饲养过程中的应用效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例说明本发明。
实施例1
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将琼脂斜面上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115，加入水，制成菌悬液，然后将上述三种枯草芽孢杆菌的菌悬液混合后接种到种子培养液中发酵制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液接种到发酵培养液中发酵得到发酵产物；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入保护剂，然后再加入1倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到CaCl2固化液中固定化处理，固化后经过滤、低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂。
实施例2
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将琼脂斜面上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115，加入水，制成菌悬液，然后将上述三种枯草芽孢杆菌的菌悬液混合后按种子培养液体积的3%接种到种子培养液中，在25℃条件下发酵培养24h制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液以发酵培养液体积的3%接种到发酵培养液中，在压力为0.05 MPa，温度为25-36℃的密闭式发酵反应器中发酵24h得到发酵产物；上述的菌悬液以菌悬液中菌数比 1：1 ：2 的比例混合；所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=1.5：0.7：100, 所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=0.5：0.5：100；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入0.5%的保护剂，保护剂为海藻糖、蔗糖和脱脂牛奶，按1:1:5配比，然后再加入1倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到1.5%的CaCl2固化液中固定化处理，同时用磁力搅拌器不停地搅拌，固化1h，100目筛网过滤，生理盐水冲洗，最后平铺于滤纸上，低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，其中，吸附载体为膨润土、硅藻土、沸石、麦麸的混合。冻干粉与吸附载体的用量比为1∶1000，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂，干燥使水分含量为4%为好，约28小时。益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中多孔淀粉的含量为1%，海藻酸钠的含量为3.5%，
实施例3
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将琼脂斜面上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115，加入水，制成菌悬液，然后将上述三种枯草芽孢杆菌的菌悬液混合后按种子培养液体积的3%接种到种子培养液中，在35℃条件下发酵培养32h制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液按发酵培养液体积的4%接种到发酵培养液中，在压力为0.15 MPa，温度为30℃的密闭式发酵反应器中发酵35h得到发酵产物；上述的菌悬液以菌悬液中菌数比 1：2 ：2的比例混合；所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=2.2：1.0：100, 所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=1.2：1.5：100；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入0.1%的保护剂，保护剂海藻糖和脱脂牛奶，按1: 5配比，然后再加入3倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到1.5%的CaCl2固化液中固定化处理，同时用磁力搅拌器不停地搅拌，固化1h，100目筛网过滤，生理盐水冲洗，最后平铺于滤纸上，低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，其中，所述的吸附载体为膨润土、沸石、麦麸的混合。冻干粉与吸附载体的用量比为1∶500，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂，干燥使水分含量为4%为好，约28小时。益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中多孔淀粉的含量为1%，海藻酸钠的含量为3.5%。
实施例4
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将琼脂斜面上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115，加入水，制成菌悬液，然后将上述三种枯草芽孢杆菌的菌悬液混合后按种子培养液体积的3%接种到种子培养液中，在40℃条件下发酵培养48h制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液以发酵培养液体积的5%接种到发酵培养液中，在压力为0.25 MPa，温度为36℃的密闭式发酵反应器中发酵48h得到发酵产物；上述的菌悬液以菌悬液中菌数比 1：1 ： 3 的比例混合；所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=3：1.3：100, 所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=2：3：100；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入1%的保护剂，保护剂为海藻糖，然后再加入5倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到1.5%的CaCl2固化液中固定化处理，同时用磁力搅拌器不停地搅拌，固化1h，100目筛网过滤，生理盐水冲洗，最后平铺于滤纸上，低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，其中，吸附载体为硅藻土，冻干粉与吸附载体的用量比为1∶1，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂，干燥使水分含量为4%为好，约28小时。益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中多孔淀粉的含量为1%，海藻酸钠的含量为3.5%。
实施例5
一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）分别将琼脂斜面上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117和弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115，加入水，制成菌悬液，然后将上述三种枯草芽孢杆菌的菌悬液混合后按种子培养液体积的3%接种到种子培养液中，在40℃条件下发酵培养48h制备益生菌种子液，然后将制得的益生菌种子液以发酵培养液体积的5%接种到发酵培养液中，在压力为0.25 MPa，温度为36℃的密闭式发酵反应器中发酵48h得到发酵产物；上述的菌悬液以菌悬液中菌数比 1：2 ： 3 的比例混合；所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=3：1.3：100, 所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=2：3：100；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入0.8%的保护剂，保护剂为海藻糖和蔗糖，按1:1配比，然后再加入4倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到1.5%的CaCl2固化液中固定化处理，同时用磁力搅拌器不停地搅拌，固化1h，100目筛网过滤，生理盐水冲洗，最后平铺于滤纸上，低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，其中，吸附载体为硅藻土和麦麸的混合，冻干粉与吸附载体的用量比为1∶300，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂，干燥使水分含量为4%为好，约28小时。益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中多孔淀粉的含量为1%，海藻酸钠的含量为3.5%。
将采用本发明方法制备得到的复合芽孢杆菌微胶囊制剂的产品质量指标及其稳定性，其品质指标如下表1、稳定性如下表2；
表1
表2
贮存处理后本发明复合芽孢杆菌微胶囊制剂的稳定性(cfu/g)。
由上表1、2可知，本发明方法制备得到的复合芽孢杆菌微胶囊制剂具有较好的耐胃酸性及肠溶性，在贮存过程中活菌含量过高，提高了其在水产动物饲养过程中的使用效果，具有较好的经济效果，促进了复合芽孢杆菌微胶囊制剂的发展。
Claims (10)
1. 一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法,其特征在于：包括以下步骤：
（1）将枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116菌悬液、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117菌悬液及弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115菌悬液混合后接种到种子培养液中发酵制备种子液，然后将制得的种子液接种到发酵培养液中发酵得到发酵产物；
（2）向步骤（1）制备得到的发酵产物中加入保护剂，然后再加入1～5倍体积量的益生菌载体胶液，充分摇匀后喷洒到CaCl2固化液中固定化处理，固化后经过滤、低温冷冻干燥，制得冻干粉，冻干粉中加入吸附载体吸附，吸附后干燥即得复合芽孢杆菌微胶囊制剂。
2.根据权利要求1或2所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：是将枯草芽孢杆菌YB-1 CGMCC No.5116菌悬液、蜡状芽孢杆菌YB-2 CGMCC No.5117菌悬液、弯曲芽孢杆菌XH-1 CGMCC No.5115菌悬液以菌数比 1：1 ：2 ～ 1：2 ：3 的比例混合。
3.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的益生菌载体胶液是将多孔淀粉和海藻酸钠混合后加水制成的胶液，其中所述多孔淀粉的含量为1%，所述海藻酸钠的含量为3.5%。
4.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的保护剂为海藻糖、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或一种以上的混合，保护剂的加入量为发酵产物体积的0.1～1%。
5.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的吸附载体为膨润土、硅藻土、沸石、麦麸中的一种或一种以上的混合。
6.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：制备得到的复合芽孢杆菌微胶囊制剂活菌数含量为8.6×1011 cfu/g。
7.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的冻干粉与吸附载体的重量比为1:1～1000。
8.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的发酵制备益生菌种子液时，菌悬液的接种量为种子培养液体积的3%，发酵条件为25～40℃，24～48h。
9.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述发酵产物是将种子液按发酵培养液体积的3%～5%接种到发酵培养液中，在压力为0.05-0.25 MPa，温度为25℃-36℃的密闭式发酵反应器中发酵24～48h，得到发酵产物。
10.根据权利要求1所述的一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述的种子培养液的组成包括玉米面粉、豆饼粉和水，其重量份配比为玉面粉：豆饼粉：水=1.5～3：0.7～1.3：100；所述发酵培养液组成包括麸皮、豆饼粉、水，其重量份配比为麸皮：豆饼粉：水=0.5～2：0.5～3：100。
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