CN102936568A

CN102936568A - 鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102936568A
Application number: CN201210428013XA
Authority: CN
Inventors: 刘益平; 孙静; 李念珍; 熊彦; 朱庆; 钟航
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: CN102936568B

Abstract

本发明公开了鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂的制备方法，选用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株保藏编号：CGMCC NO.6565；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株保藏编号：CGMCC NO.6566；两个菌株经过发酵，获得发酵产物即为固体发酵菌剂。将本发明的固体发酵菌剂直接添加入饲料，维持了肠道微生态健康并帮助肠道吸收饲料中营养成分，提高鸡群生长性能。

Description

鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于芽孢杆菌属，杆状，染色均匀；芽孢0.8×1.5~1.8μm；菌落源或不规则形，表面色暗；可起皱，形成奶油色或褐色；在培养液中可形成完整的膜，轻度浑浊。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）属于片球菌书，球状，四联活成片状排列；细胞直径约1μm；在MRS培养基上生长良好，菌落生长在表面的呈规则的圆形，白色扁平；在液体培养基中浑浊，菌体沉淀到培养基底部，呈白色。

戊糖片球菌在厌氧或兼性厌氧条件下生长并产生乳酸等代谢产物，对酸有较强的耐受范围（pH4.5-8），且产生片球菌素（pediocin）以抑制有害肠道细菌的生长；但该菌对温度的耐受范围相对较低，高于50℃时细菌失活；健康鸡体温为41.5℃，因此该菌只能作为微生物添加剂添加入饲料中，而不能经过高温，制粒等加工过程。而枯草芽孢杆菌属于不致病的需氧芽孢杆菌，其芽孢形式的活菌能够耐酸、耐高温，稳定性较好。

研究发现，即使是物种相同不同株系的益生菌对肠道不同区域的特异性粘附有差，发挥的特异免疫作用也有差。微生物饲料添加剂具有特异的宿主范围，超出宿主范围对添加剂的作用效果不大。同时，在动物个体发育各个阶段，将乳酸菌和芽孢杆菌配合使用，不仅能有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，同时产生各种消化酶（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）的活性，使对饲料的利用效率高于单一菌株。

常见禽用益生菌使用方式主要是饮水或饲料。但如果用饮水方式添加时，容易受到空气、紫外线、自来水中消毒剂和金属离子等作用而降低活性甚至失活，且该种方式受到地域和气候的影响，对使用量无法控制直接影响发挥的作用。因此，制成微生物粉状制剂直接饲喂动物，受外界环境的影响更易控制并降低，对饲喂量的确定更易被普通养殖户掌握，便于推广。

禽用饲料的主要原料成分主要包括玉米粉和豆粕；麦麸蛋白质含量很高，氨基酸组成可与整粒小麦相比，因此在禽用饲料中也占有一定比例；但其高纤维、低容重等特征限制其使用比例。通过微生物在固体发酵过程中提高对饲料原料中蛋白质的水解，形成更多可直接被动物肠道吸收利用的小肽（二、三肽），对家禽生长起到促进作用；同时，益生菌以活菌形式进入肠道后，改变肠道微生物区系，产生的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等酶活作用也促进了对饲料原料的水解和小肽的形成，提高氨基酸、矿物元素的吸收利用，从而提高动物生长或生产性能。因此，通过模拟人工胃肠道环境优选出的枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌以饲料原料为培养基的固体发酵条件的优化，并混合两微生物菌剂饲喂鸡群，提高动物个体生长性能的应用意义重大。

发明内容

本发明提供两株从鸡盲肠分离得到、并通过人工胃肠道环境耐受试验的枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌，并直接以饲料原料为培养基优化固体发酵技术，制备得到含优选鸡源枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌的微生物制剂及其混合菌剂的应用方法。

鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂的制备方法，菌种选择：选用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SCS4562菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.6565,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.6566,分类命名：戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus；；两个菌株经过发酵，获得发酵产物即为固体发酵菌剂。

所述的发酵方法为：

（1)种子培养：将所述的两个菌株经斜面活化后，分别在无菌条件下用接种环接1～2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2～3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养36小时，得二级种子液；

(2)固体发酵培养：以3%～10%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体发酵培养基中，按照料水比1︰0.9-1.5g/ml和容量比为8%～24%在发酵瓶进行混合后置于恒温培养箱上，控制环境温度在35～42℃，并用带4层灭菌纱布封口；时常拍打发酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，发酵72小时，发酵结束；

(3) 含枯草芽孢杆菌活菌的发酵产物晾干：将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵产物；

含戊糖片球菌活菌的发酵产物晾干：将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含戊糖片球菌活菌的固体发酵产物。

枯草芽孢杆菌SCS4562斜面活化培养基为牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖2.5%，磷酸二氢钾0.03%，补水至100%；调节pH值至6.8，置于37℃培养箱培养20h；

戊糖片球菌SC4560斜面活化培养基为葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1g，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至5.4，置于37℃培养箱培养22h；

上述液体种子培养基为：

枯草芽孢杆菌（按质量百分含量计）：2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，磷酸二氢钾0.03%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至6.8～7，高压120℃灭菌30分钟后冷却备用；

戊糖片球菌（按质量百分含量计）：葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1g，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至5.4，高压113℃灭菌30分钟后冷却备用；

上述固体发酵培养基为：枯草芽孢杆菌与戊糖片球菌相同，将玉米、豆粕、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g，豆粕300g，麦麸50g的比例，高压115℃灭菌15分钟，冷却后无菌条件下加磷酸缓冲液1000ml混匀，自然pH即可。

上述以优选鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵优化生产工艺及其组合菌剂的应用中，步骤（2）所述接种量优选5%；步骤（2）所述料水比优选1︰1.1 g/ml；步骤（2）所述容量比优选16%；步骤（2）所述枯草芽孢杆菌发酵温度优选39℃；步骤（2）所述戊糖片球菌发酵温度优选37℃。

上述以优选鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵优化生产工艺及其组合菌剂的应用中，步骤（9）所述枯草芽孢杆菌蛋白水解度DH为14.62%；步骤（9）所述戊糖片球菌蛋白水解度DH为63.41%。

本发明将三种常见饲料原料玉米粉、豆粕、麦麸作为优选的鸡源枯草芽孢杆菌、戊糖乳杆菌的固体培养基，按照合理的培养基配方和发酵条件的优化，不仅提高了固体发酵菌株有效活菌数含量，枯草芽孢杆菌活菌数达到1.6×10⁹亿/克,戊糖片球菌活菌数达到6.9×10⁹亿/克；并测定各自发酵产物的蛋白水解程度，发现戊糖片球菌的蛋白水解度高达63.41%，枯草芽孢杆菌的蛋白水解度为14.62%。

应用本发明通过人工模拟鸡胃肠道情况优选出枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌。并制备以三种常见饲料原料为培养基的、含优选的鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌活菌的固体发酵产物，成本低且易操作。并且本发明测定含枯草芽孢杆菌、戊糖片球菌发酵产物中蛋白质水解程度（DH），产生的短肽产物更易于肠道的吸收。通过本发明以粉状微生物活菌制剂直接添加入饲料，维持了肠道微生态健康并帮助肠道吸收饲料中营养成分，从而表现为鸡群生长性能的提高。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：

（1）菌种优选：本发明枯草芽孢杆菌SCS4562和戊糖片球菌SCS4560分离于健康鸡盲肠部位，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.6565,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株已于2012年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.6566,分类命名：戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus；

（2）人工胃液耐受试验：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法在pH2～4的人工胃液中培养2小时，并进行稀释平板计数计算活菌数，以0小时活菌数为参照。

人工胃液配方为：依据中国药典2010版，取稀盐酸16.4毫升，加水约800毫升与胃蛋白酶10克，摇匀后，加水稀释成1000毫升即得，放入4℃冰箱备用；

（3）菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，结果为：

上述步骤（1）所述菌种枯草芽孢杆菌经人工胃液耐受试验后活菌数在pH2人工胃液中培养0小时后活菌数为3.9×10⁷ CFU/mL，两小时后活菌数为7.8×10⁶CFU/mL；在pH3人工胃液中培养0小时后活菌数为1.7×10⁷ CFU/mL，两小时后活菌数为3.59×10⁶CFU/mL；在pH4人工胃液中培养0小时后活菌数为3.6×10⁷ CFU/mL，两小时后活菌数为1.25×10⁷CFU/mL；

上述步骤（1）所述菌种戊糖片球菌经人工胃液耐受试验后活菌数在pH2人工胃液中培养0小时后活菌数为3.6×10⁶ CFU/mL，培养两小时后为6.5×10⁵ CFU/mL；在pH3人工胃液中培养0小时后活菌数为7.0×10⁶ CFU/mL,培养两小时后为1.72×10⁶ CFU/mL；在pH4人工胃液中培养0小时后活菌数为2.7×10⁷ CFU/mL，培养两小时后为5.6×10⁶ CFU/ml。

（4）人工胰液耐受试验：将（1）所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法在人工肠液中培养0～3小时三个时间梯度，并进行稀释平板计数计算活菌数，以0小时活菌数为参照。

人工胰液配方为：依据中国药典2010版，取磷酸二氢钾6.8克，加水500毫升溶解，用0.4%氢氧化钠回调pH至6.8，每100毫升液体加入1克胰蛋白酶，混匀，用0.2微米的无菌滤头过滤后即得，放入4℃冰箱备用。

（5）菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，结果为：

上述步骤（1）所述菌种枯草芽孢杆菌经人工胰液耐受试验后活菌数在0小时培养后为1.38×10⁷CFU/mL，培养两小时后为4.5×10⁷CFU/mL；培养3小时后为1.53×10⁷CFU/mL；

上述步骤（1）所述菌种枯草芽孢杆菌经人工胰液耐受试验后活菌数在0小时培养后为2.6×10⁷ CFU/mL,培养2小时后为4.3×10⁶ CFU/mL，培养3小时后为3.0×10⁶ CFU/mL；

（6）人工胆盐溶液耐受试验：将（1）所述菌株，在无菌条件下按照系列稀释法在0%～0.3%四个浓度梯度的人工胆盐溶液培养0～4小时，并进行稀释平板计数计算活菌数，以0%浓度下培养0小时的活菌数为参照。

人工胆盐溶液配方为：依据中国药典2010版，称取1.5克猪胆盐加入到有100毫升0.5%灭菌氯化钠溶液的三角瓶中，再加入0.1克胰蛋白酶，摇匀，调pH值至7.0，即制备成含胆盐1.5%的胆盐溶液，放入4℃冰箱备用；

（7）菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，结果为：（1）所述菌种枯草芽孢杆菌经人工胆盐溶液耐受试验后活菌数在0.1%浓度人工胆盐液培养0小时后为2.0×10⁶ CFU/mL，培养4小时后为2.2×10⁶ CFU/mL；活菌数在0.2%浓度人工胆盐液培养0小时后为3.1×10⁶ CFU/mL，培养4小时后为1.3×10⁶ CFU/mL；在0.3%浓度人工胆盐液培养0小时活菌数为2.1×10⁶ CFU/mL,培养4小时后为2.3×10⁵ CFU/mL。

上述（1）所述菌种戊糖片球菌经人工胆盐溶液耐受试验后活菌数在0.1%浓度人工胆盐液培养0小时后为1.39×10⁷ CFU/mL，培养4小时后为3.2×10⁶ CFU/mL；在0.2%浓度人工胆盐液培养0小时后活菌数为2.3×10⁷ CFU/mL，培养4小时后为4.0×10⁵ CFU/mL；在0.3%浓度人工胆盐液培养0小时后活菌数1.5×10⁷ CFU/mL，培养4小时后为4.0×10⁴ CFU/mL。

（8）枯草芽孢杆菌种子培养：将（1）所述枯草芽孢杆菌SCS4562斜面活化；培养基：2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，磷酸二氢钾0.03%，加灭菌水至100%溶解，调节pH值至6.8～7，置于35～37℃生化培养箱培养18h，接种1～2环于40ml液体种子培养基中，进行种子摇瓶培养；37℃恒温，摇床转速120转/分钟，时间48h；以接种环接2～3环于同样配方的液体种子培养基中， 37℃恒温，摇摇床转速120转/分钟培养36小时，得二级种子液。

菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，二级种子液活菌含量为9×10⁹/ml发酵液。

（6）戊糖片球菌种子培养：将（1）所述戊糖片球菌SCS4560斜面活化；培养基：葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1g，酵母膏0.5%，吐温-800.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至100%溶解，调节pH值至5.4，置于35～37℃生化培养箱培养18h，接种1～2环于40ml液体种子培养基中，进行种子摇瓶培养；37℃恒温，摇床转速120转/分钟，时间48h。

菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，二级种子液活菌含量为12×10⁹/ml发酵液。

上述液体发酵种子培养基及制备方法为：

枯草芽孢杆菌（按质量百分含量计）：2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，磷酸二氢钾0.03%，加灭菌水至100%溶解，调节pH值至6.8-7，高压120℃灭菌30分钟后冷却备用；

戊糖片球菌（按质量百分含量计）：葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至5.4，高压113℃灭菌30分钟后冷却备用；

(7)固体发酵培养：以3%～10%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体发酵培养基中，按照料水比1︰0.9 g/ml、1︰1.1 g/ml、1︰1.3 g/ml、1︰1.5 g/ml和容量比为8%～24%在发酵瓶进行混合后置于恒温培养箱上，控制环境温度在35～42℃，并用带4层灭菌纱布封口；时常拍打发酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，发酵72小时，发酵结束；

(8) 含枯草芽孢杆菌活菌的发酵产物晾干：将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵产物；

(9) 含戊糖片球菌活菌的发酵产物晾干：将发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含戊糖片球菌活菌的固体发酵产物。

实施例2：

（1）菌种同实施例1

（2）种子培养：将（1）所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养48h，得一级种子液；

（3）以接种环接2～3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养36小时，得二级种子液。

（4）固体发酵培养：

将所述枯草芽孢杆菌的二级种子液以5%质量比接种于经121℃、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比为1︰1.1 g/ml和容量比为16%接入发酵瓶，混合后置于生化培养箱内，并用带4层灭菌纱布瓶口，温度控制为39℃；时常拍打发酵瓶壁，使培养基舒散、上下料混合，发酵72小时，发酵结束；

将所述戊糖片球菌的二级种子液以5%质量比接种于经115℃、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比为1︰1.1 g/ml和容量比为16%接入发酵瓶，混合后置于生化培养箱内，并用带4层灭菌纱布瓶口，温度控制为37℃；时常拍打发酵瓶壁，使培养基舒散、上下料混合，发酵72小时，发酵结束；

（5）发酵产物晾干：

将步骤（4）发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品。

将步骤（4）发酵产物于干净搪瓷盘，加入两倍量饲用玉米粉（过40目筛）混合均匀，平摊散开放置于通风处自然风干，当含水率低于10%时结束风干过程，收集产物并粉碎，过40目筛，所得粉末即为含戊糖片球菌活菌的固体发酵成品。

（6）菌落计数：利用系列稀释法对含枯草芽孢杆菌活菌和戊糖片球菌活菌的固体发酵成品分别进行菌落计数，结果为：枯草芽孢杆菌有效活菌数为1.6×10⁹/克发酵成品；戊糖片球菌有效活菌数为6.9×10⁹/克发酵成品。

上述液体发酵种子培养基及制备方法为：

枯草芽孢杆菌（按百分含量计），2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.5%牛肉膏，磷酸二氢钾0.03%，加灭菌水至100%溶解，调节pH值至6.8～7，高压120℃灭菌30分钟后冷却备用；

戊糖片球菌（按百分含量鸡），葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至100%溶解，调节pH值至5.4，高压113℃灭菌30分钟后冷却备用；

上述固体发酵培养基配方及制备方法为：以百分比计，将玉米、豆粕、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g，豆粕300g，麦麸50g的比例，高压115℃灭菌15分钟，冷却后无菌条件下加磷酸缓冲液1000ml混匀，自然pH即可。

实施例3：

（1）菌种同实施例1。

（2）种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养48h，得一级种子液；

（4）固体发酵培养：

将步骤（1）所述枯草芽孢杆菌以5%质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比为1︰1.1 g/ml和容量比为16%接入发酵瓶，混合后置于生化培养箱内，并用带4层灭菌纱布瓶口，温度控制为39℃；时常拍打发酵瓶壁，使培养基舒散、上下料混合，发酵72小时，发酵结束；

将步骤（1）所述戊糖片球菌以5%质量比的接种量，将二级种子液接种于经115℃、30分钟灭菌的固体培养基中，按照料水比为1︰1.1 g/ml和容量比为16%接入发酵瓶，混合后置于生化培养箱内，并用带4层灭菌纱布瓶口，温度控制为37℃；时常拍打发酵瓶壁，使培养基舒散、上下料混合，发酵72小时，发酵结束；

（5）发酵产物晾干：

（6）发酵产物蛋白水解程度的测定：

将步骤（5）所述发酵产物进行蛋白质水解程度的测定，包括对枯草芽孢杆菌发酵产物粗蛋白和氨基酸态氮含量、戊糖片球菌发酵产物粗蛋白和氨基酸态氮含量的测定；

上述发酵产物中粗蛋白含量测定方法采用凯式定氮法，公式为

；V₂为试样滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；V₁为空白滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；c为盐酸标准溶液的浓度（mol/L）；m为试样的质量（g）；V为试样的分解液总体积（ml）；V＇为试样分解液蒸馏用体积（ml）；0.0140为N的毫摩尔质量（g/mol）；6.25为氮换算成蛋白质的平均系数；

上述发酵产物中氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法，公式为

；V₁为测定用的样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；V₂为实际空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；V₃为样品稀释液取用量（ml）；c为氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）；0.014为1ml浓度为1.000mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量（g）；

上述发酵产物蛋白水解程度测定公式：，其中h为采用甲醛滴定法测定的发酵产物中-NH2或-COOH基团的含量（mmol/g）；h_o为采用甲醛滴定法测定的水解前原料中的-NH2或-COOH基团的含量（mmol/g）；h_tot为每克原料蛋白的肽键毫摩尔数（mmol/g）。

(7) 上述以优选鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵优化生产工艺及其组合菌剂的应用中，步骤（6）所述枯草芽孢杆菌蛋白水解度DH为14.62%；步骤（6）所述戊糖片球菌蛋白水解度DH为63.41%。

实施例4：

本发明发酵产品的动物试验使用效果。

本实例在四川农业大学家禽育种场进行，选择健康1日龄雏鸡80只（公鸡），随机分成2个处理，每个处理2个重复，每个重复20只雏鸡，分别为空白对照组和本发明发酵组，试验期74天；

本发明发酵组：本发明含枯草芽孢杆菌的发酵制剂和含戊糖片球菌的发酵制剂，活菌数≥10⁹CFU/克，育雏阶段（1日龄～42日龄）按0.1wt%枯草芽孢杆菌制剂和0.1wt%戊糖片球菌制剂1:1添加入饲料中；育成阶段到上市日龄（43日龄～74日龄）按0.05wt%枯草芽孢杆菌和0.05wt%戊糖片球菌1:1添加入饲料中；

试验结果如下表

组别	空白对照组	本发明发酵组
			初始均重（g）	38.49±3.91	40.50±3.31
终末均重（kg）	2.93±0.26	3.13±0.21
			平均日增重（g）	39.56±3.47	42.26±2.86
料重比	2.55︰1	2.29︰1
			死淘率	1	1
利润比较(元)	55.80	92.70

结论：以上的试验结果表明，使用本发明技术生产的发酵产品——含枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌固体发酵菌剂的发酵组合能够有效地提高鸡生长速度，改善饲料利用效率，提高上市日龄的群体均重，增加养鸡利润。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种鸡源枯草芽孢杆菌和戊糖片球菌的固体发酵菌剂的制备方法，其特征在于，菌种选择：选用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SCS4562菌株保藏编号：CGMCC NO.6565；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SCS4560菌株保藏编号：CGMCC NO.6566；两个菌株经过发酵，获得发酵产物即为固体发酵菌剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵方法为：（1)种子培养：将所述的两个菌株经斜面活化后，分别在无菌条件下用接种环接1～2环于40ml液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养48h，得一级种子液；以接种环接2～3环于同样配方的液体种子培养基中，以120转/分钟的转速、37℃恒温摇床培养36小时，得二级种子液；

(3) 含枯草芽孢杆菌活菌的发酵产物晾干、粉碎，过40目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵产物；

含戊糖片球菌活菌的发酵产物晾干、粉碎，过40目筛，所得粉末即为含戊糖片球菌活菌的固体发酵产物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌SCS4562斜面活化培养基为牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨1.0%，葡萄糖2.5%，磷酸二氢钾0.03%，补水至100%；调节pH值至 6.8，置于37℃培养箱培养20h；

戊糖片球菌SC4560斜面活化培养基为葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1g，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至5.4，置于37℃培养箱培养22h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的液体种子培养基为：

戊糖片球菌（按质量百分含量计）：葡萄糖2%，牛肉膏1%，蛋白胨1g，酵母膏0.5%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.025%，水合硫酸镁0.05%，水合硫酸锰0.025%，柠檬酸铵0.2%，乙酸钠0.5%，加灭菌水至全部溶解，调节pH值至5.4，高压113℃灭菌30分钟后冷却备用。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基为：枯草芽孢杆菌与戊糖片球菌相同，将玉米、豆粕、麦麸打碎过40目筛，按照玉米600g，豆粕300g，麦麸50g的比例，高压115℃灭菌15分钟，冷却后无菌条件下加磷酸缓冲液1000ml混匀，自然pH即可。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）所述接种量优选5%；步骤（2）所述料水比优选1︰1.1 g/ml；步骤（2）所述容量比优选16%；步骤（2）所述枯草芽孢杆菌发酵温度优选39℃；步骤（2）所述戊糖片球菌发酵温度优选37℃。

7.根据权利要求1至6任一所述方法获得的固体发酵菌剂。

8.权利要求7所述的固体发酵菌剂的应用，其特征在于，育雏阶段按0.1wt%枯草芽孢杆菌制剂和0.1wt%戊糖片球菌制剂1:1添加入饲料中；育成阶段到上市日龄按0.05wt%枯草芽孢杆菌和0.05wt%戊糖片球菌1:1添加入饲料中。