CN113388551A - 一株戊糖片球菌NHB-PpA9601及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB‑PpA9601，该菌分离自白羽肉鸡肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22646，保藏日期为2021年5月31日。本发明的戊糖片球菌NHB‑PpA9601具有显著的益生性，可有效抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖。本发明的戊糖片球菌NHB‑PpA9601可用于湿基发酵饲料生产，可有效改善肠道健康，提升经济效益。

Description

一株戊糖片球菌NHB-PpA9601及应用
技术领域
本发明属于饲用益生菌领域，特别涉及一株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)NHB-PpA9601及其应用。
背景技术
乳酸菌通过代谢产物调节肠道pH，从而促进动物生长，调节肠道菌群结构和相对丰度，从而改善胃肠道功能、提高生长性能并降低发病率等。戊糖片球菌属于链球菌科片球菌属，能发酵葡萄糖产生乳酸，能抑制嗜水气单胞菌、李斯特菌、蜡样芽孢杆菌等病原菌。但还未见对猪链球菌的抑制效果报告，且目前多数拮抗病原菌的试验在体外进行，在复杂的动物体内是否能发挥有效地抗菌效果还未见报道。
当我国畜禽养殖过程中，抗生素的滥用，易造成环境污染、生物产品中抗生素的残留、动物肠道菌群平衡被打破等问题，甚至土壤环境恶化等一系列反应；戊糖片球菌具有良好的产酸和拮抗病原菌特性，并能促进营养物质代谢、吸收，可作为新型饲料添加剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有益生作用的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)NHB-PpA9601及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB-PpA9601是从健康白羽肉鸡肠道内容物中分离的戊糖片球菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为戊糖片球菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株具有耐酸性、耐胆盐性、存活能力强，产酸性和发酵性能强，且具有广谱抑制作用，能改善动物肠道健康等。
本发明提供的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB-PpA9601，已于2021年5月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，保藏编号为CGMCC No.22646。
本发明提供的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB-PpA9601具有以下微生物学特征：戊糖片球菌NHB-PpA9601是革兰氏阳性球菌，在MRS琼脂培养基上生长良好，培养48h，菌落直径0.5-1.5mm，呈白色，表面光滑，不透明，中间隆起，边缘整齐，易挑起，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈球状，无芽孢，兼性厌氧，pH值范围4.0-7.5，生长范围13℃-45℃，最适生长温度35℃，最高生长温度42-45℃。部分生理生化特性如表1。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601的液体菌剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601的湿基发酵饲料。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601的动物饮水用饲料添加剂。
饲料添加剂中戊糖片球菌NHB-PpA9601的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中戊糖片球菌NHB-PpA9601的活菌数为1×107CFU/g。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。
另外，本发明进一步提供了含戊糖片球菌NHB-PpA9601的湿基发酵饲料在肉鸡生产中的应用。
本发明中所述戊糖片球菌NHB-PpA9601的培养方法如下：
取戊糖片球菌NHB-PpA9601(保藏编号为CGMCC No.22646)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)1mL，接种于100mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行10L种子发酵罐培养，取70mL摇瓶发酵种子液接种到10L种子发酵罐中进行种子培养，10L发酵罐装液量为7L种子培养基。培养结束后，取3.5L种子液接种到100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为6.2×109CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：蔗糖1％，葡萄糖0.8％，酵母浸粉0.4％，大豆蛋白胨1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.02％，吐温-80 0.2％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量0.5-2％(体积比)，发酵温度为32-32℃、pH4.0-7.5、80-300r/min，发酵时间8-36h。
优选为：接种量1％(体积比)，发酵温度为35℃、pH5.8、120r/min，发酵时间16h。
所述100L发酵罐的培养基成分为：绵白糖0.5-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，玉米浆干粉0.5-4％，酵母膏0.2-3.0％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1％，葡萄糖0.5％，玉米浆干粉0.8％，酵母膏0.4％，大豆蛋白胨1％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.01％，吐温-80 0.1％，余量为水。
所述100L发酵罐的培养基成分为：初始pH4.0-7.5，装液量为60-70L培养基，控制罐压0.03-0.06MPa，接种量为700mL-7L，发酵温度为30-40℃，发酵时间20-48h，搅拌转速80-300r/min。
优选为：初始pH6.8，控制pH6.0，装液量为70L培养基，控制罐压0.05MPa，接种量为3.5L，发酵温度为35℃，发酵时间28h，搅拌转速150r/min。
本发明中所述湿基发酵饲料制备方法如下：
1、贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种活化
将保藏的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养10h，获得贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液备用。
2、酿酒酵母菌菌种活化
将保藏的酿酒酵母菌菌种，经PDA平板2-3次活化，然后接种于PDB培养基中，32℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得酿酒酵母菌种子液备用。
3、湿基发酵饲料制备
将贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液，戊糖片球菌NHB-PpA9601种子液和酿酒酵母菌种子液混合均匀，获得菌种混合液。然后和复合发酵原料混合均匀，混合均匀后装入呼吸袋中密封，发酵5-7天，获得戊糖片球菌NHB-PpA9601湿基发酵饲料。
所述菌种混合液由下述组分组成：贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液30％，戊糖片球菌NHB-PpA9601种子液(实施例2制备的发酵液)60％，酿酒酵母菌种子液10％。
所述复合发酵原料由下述组分组成：玉米粉40-70％，豆粕10-30％，麸皮10-30％，小苏打0.1-1.5％，微量矿物元素0.1-0.5％，磷酸氢钙0.1-1％，大豆油0.5-5％，赖氨酸0.5-5％。
优选为：玉米粉61％，豆粕20％，麸皮15％，小苏打0.5％，微量矿物元素0.2％，磷酸氢钙0.8％，大豆油1％，赖氨酸1.5％。
所述微量矿物元素由下述组分组成：碘化钾10-40％，氯化钴5-20％，亚硒酸钠5-35％，硫酸铜5-15％，硫酸亚铁10-45％，硫酸锌10-40％，硫酸锰5-30％。
优选为：碘化钾20％，氯化钴10％，亚硒酸钠15％，硫酸铜5％，硫酸亚铁15％，硫酸锌20％，硫酸锰15％。
所述贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，其保藏编号为CGMCC NO.21191，已在中国专利CN112574922A中公开；该菌已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明戊糖片球菌NHB-PpA9601的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
本发明戊糖片球菌NHB-PpA9601的抗逆性检验方法如下：
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
2、耐人工肠液性能测定
取1mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
本发明戊糖片球菌NHB-PpA9601预防和治疗腹泻的检验方法：
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加戊糖片球菌发酵液，添加浓度为1×107CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加戊糖片球菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×107CFU/mL浓度的戊糖片球菌NHB-PpA9601发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的戊糖片球菌NHB-PpA9601抑菌性能强、产酸能力强、抗逆性强、发酵力强、生长旺盛；经发酵培养基和工艺优化，37℃发酵28h，发酵液活菌数可达到6.2×109CFU/mL，和其他菌种组合后可用于湿基发酵饲料制备，在饲料原料处理上有广泛应用前景。
(2)本发明的戊糖片球菌NHB-PpA9601具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。
(3)本发明中的戊糖片球菌NHB-PpA9601可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠攻毒试验，试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组(P<0.05)；沙门氏菌攻毒后，试验组小鼠精神状态和存活率明显高于负对照组。表明饲喂戊糖片球菌NHB-PpA9601菌液可有效预防和治疗小鼠腹泻，提高小鼠受病原菌攻毒的存活率，并能够促进小鼠生长。
(4)本发明含戊糖片球菌NHB-PpA9601的湿基发酵饲料应用于肉鸡生产，可显著提高白羽肉鸡的生产性能及存活率，与对照组相比，料肉比降低11.73％，存活率提升4.87％。改善肉鸡屠宰性能，降低肠道pH值，促进动物肠道生长发育，改善了肠道健康，具有很好的经济效益。
(5)本发明含戊糖片球菌NHB-PpA9601的湿基发酵饲料应用于蛋鸡生产，可显著改善蛋鸡的产蛋情况及蛋品质，具体在生产性能方面，试验组蛋鸡平均蛋重显著增加(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05)，产蛋率极显著提高(P<0.01)；营养物质表观代谢率方面，试验组蛋鸡能量、干物质、粗蛋白表观代谢率均显著高于普通饲料组蛋鸡(P<0.05)；蛋品质方面，试验组显著提高了蛋品新鲜度(P<0.05)，极显著降低了蛋品的腥味(P<0.01)，可接受度显著增加(P<0.01)。能改善蛋鸡健康状态，具有巨大的经济效益。
附图说明
图1是戊糖片球菌NHB-PpA9601在MRS培养基上的菌落形态图。
图2是戊糖片球菌NHB-PpA9601菌株的革兰氏染色图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1戊糖片球菌NHB-PpA9601的分离、筛选及鉴定
1、乳酸菌的分离纯化：
将健康白羽肉鸡屠宰取肠道后迅速在无菌条件下采集肠道内容物2.5克，置于盛有22.5mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于改良的MRS琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养48h，用接种环挑取溶钙圈明显且大于5mm的疑似乳酸菌的菌落在MRS琼脂平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于MRS琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于-80℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察：
根据步骤1中溶钙圈大小，初步筛选出产酸能力强的菌株可初步确定为乳酸菌，共115株。将步骤1保存的甘油管菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的不产芽胞细菌作为备用。
3、乳酸菌菌悬液和发酵液制备
将步骤1获得的乳酸菌在MRS琼脂平板上划线37℃培养48h，从平板上挑取单菌落于100mL MRS液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养24h，获得乳酸菌菌悬液备用；继续37℃，180r/min震荡培养96h，获得乳酸菌发酵液备用。
4、抑菌性乳酸菌的筛选：
取致病菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的营养琼脂培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个(致病菌产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)。在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似乳酸菌菌株发酵液(步骤3获得)于牛津杯中，于37℃下恒温培养24h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有10株，并分别标号为3301、5704、7801、8604、9301、9601、11403、11405、11702、12001。其中3301、5704、7801、11405、11702、12001 6株菌为杆菌，8604、9301、9601、11403 4株菌为球菌，选择除去水产病原菌对其他病原菌抑菌圈最大的菌株9601进行下一步研究。
5、菌株属的鉴定：
对菌株9601进行了形态和生理生化鉴定，菌株9601在MRS平板上培养48h，形成圆形，菌落直径0.5-1.5mm，呈白色，表面光滑，不透明，中间隆起，边缘整齐，易挑起，菌落形态如图1，显微形态如图2，革兰氏阳性，呈球状，无芽孢，兼性厌氧，pH值范围4.0-7.5，生长范围13℃-45℃，最适生长温度35℃，最高生长温度42-45℃。通过对菌株9601进行生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株的种属。结果显示菌株9601为片球菌属。
表1菌株9601的部分生理生化特征
项目 9601 项目 9601
好氧生长 + 甘露醇 -
厌氧生长 + 七叶灵 +
运动性 - 半乳糖 +
接触酶 - 甘露糖 +
35℃生长 + 淀粉产酸 -
40℃生长 + 糊精产酸 -
50℃生长 - 精氨酸双水解 +
葡糖糖 + 葡萄糖产气 -
蔗糖 + 葡萄糖产酸 +
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
6、16S rDNA测序测定：
采用细菌DNA提取的试剂盒提取9601菌株基因组DNA。通过引物F和R对9601菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株9601与戊糖片球菌的同源性达到99.93％。通过菌株9601的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株9601为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，并正式标号为NHB-PpA9601。
7、菌株保藏：
上述经分离、纯化、筛选得到的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB-PpA9601已于2021年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.22646，分类命名为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。
所述改良MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO4 0.025％，琼脂1.8％，碳酸钙1％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，琼脂1.8％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS肉汤培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO40.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基组成为：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
实施例2戊糖片球菌NHB-PpA9601发酵液的制备
取戊糖片球菌NHB-PpA9601(保藏编号为CGMCC No.22646)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)1mL，接种于100mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行10L种子发酵罐培养，取70mL摇瓶发酵种子液接种到10L种子发酵罐中进行种子培养，10L发酵罐装液量为7L种子培养基。培养结束后，取3.5L种子液接种到100L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，100L发酵罐装液量为70L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为6.2×109CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：蔗糖1％，葡萄糖0.8％，酵母浸粉0.4％，大豆蛋白胨1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.02％，吐温-80 0.2％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量0.5-2％(体积比)，发酵温度为32-32℃、pH4.0-7.5、80-300r/min，发酵时间8-36h。
优选为：接种量1％(体积比)，发酵温度为35℃、pH5.8、120r/min，发酵时间16h。
所述100L发酵罐的培养基成分为：绵白糖0.5-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，玉米浆干粉0.5-4％，酵母膏0.2-3.0％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。
优选为：绵白糖1％，葡萄糖0.5％，玉米浆干粉0.8％，酵母膏0.4％，大豆蛋白胨1％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.1％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.01％，吐温-80 0.1％，余量为水。
所述100L发酵罐的培养基成分为：初始pH4.0-7.5，装液量为60-70L培养基，控制罐压0.03-0.06MPa，接种量为700mL-7L，发酵温度为30-40℃，发酵时间20-48h，搅拌转速80-300r/min。
优选为：初始pH6.8，控制pH6.0，装液量为70L培养基，控制罐压0.05MPa，接种量为3.5L，发酵温度为35℃，发酵时间28h，搅拌转速150r/min。
实施例3戊糖片球菌NHB-PpA9601益生性验证
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气荚膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
表2戊糖片球菌NHB-PpA9601对病原菌的抑菌效果
Figure BDA0003165705290000131
Figure BDA0003165705290000141
实施例4戊糖片球菌NHB-PpA9601抗逆性验证
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表3所示。从表3中可以看出，戊糖片球菌NHB-PpA9601在pH2.0的人工胃液(含酶)中处理3h存活率92.68％，表明该菌株NHB-PpA9601具有较高的耐酸性，可以耐受胃酸，能顺利到达肠道发挥作用。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。
表3戊糖片球菌NHB-PpA9601在人工胃液中处理后3h的存活情况
处理 pH1.5 pH2.0 pH2.5
初始活性CFU/mL 1.23×10<sup>9</sup> 1.23×10<sup>9</sup> 1.23×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 1.02×10<sup>9</sup> 1.14×10<sup>9</sup> 1.21×10<sup>9</sup>
处理后存活率％ 82.92 92.68 98.37％
2、耐人工肠液性能测定
取1mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果显示，戊糖片球菌NHB-PpA9601在人工肠液中存活率达到98.23％，表明该菌株能很好在肠液中生存并保存活力，从而发挥其益生作用。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表4所示。戊糖片球菌NHB-PpA9601在0.3％胆盐溶度的溶液中处理2小时，存活率为87.8％，表明该菌株具有较高的耐胆盐性，可以耐受十二指肠液中的胆盐，使菌株能到达肠道去发挥作用。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容，121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
表4戊糖片球菌NHB-PpA9601在不同浓度胆盐溶液中处理2h后的存活情况
处理 0.15％ 0.3％ 1％ 1.5％
初始活性CFU/mL 1.23×10<sup>9</sup> 1.23×10<sup>9</sup> 1.23×10<sup>9</sup> 1.23×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 1.19×10<sup>9</sup> 1.08×10<sup>9</sup> 1.01×10<sup>9</sup> 9.8×10<sup>8</sup>
处理后存活率％ 96.77 87.80 82.11 79.67
实施例5戊糖片球菌NHB-PpA9601急性毒性试验
戊糖片球菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标GB15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分三次对小白鼠进行灌胃，0.25g/mL戊糖片球菌NHB-PpA9601菌液(相当于15000mg/kg体重)，连续灌服2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。
试验期间，小鼠精神状态良好，无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。
实施例6小鼠攻毒试验
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加戊糖片球菌发酵液，添加浓度为1×107CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加戊糖片球菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×107CFU/mL浓度的戊糖片球菌NHB-PpA9601发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
所述贝戊糖片球菌发酵液为实施例2制备的发酵液，然后通过离心收集菌体，收集获得的菌体用生理盐水洗涤3-5次除去发酵液。
沙门氏菌攻毒后，通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出，发病严重小鼠眼睛带血，不能睁开。攻毒后，第1天，负对照组开始有发病症状，且死亡4只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。试验组仅在第1天死亡1只，其它小鼠3天内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常，恢复时间大约6天。
攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表6所示，试验组小鼠攻毒后中毒现象不严重，表明贝戊糖片球菌NHB-PpA9601对沙门氏菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受沙门氏菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。
表5小鼠增重情况
分组 平均始重(g/只) 平均末重(g/只) 平均增长率(％)
对照组 15.14±0.22 29.23±0.56 93.06<sup>b</sup>
负对照组 15.56±0.38 29.12±0.51 87.15<sup>c</sup>
试验组 15.63±0.56 39.22±0.69 150.92<sup>a</sup>
表6攻毒前、后的小鼠死亡情况
Figure BDA0003165705290000171
实施例7戊糖片球菌NHB-PpA9601湿基发酵饲料制备
4、贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种活化
将保藏的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养10h，获得贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液备用。
5、酿酒酵母菌菌种活化
将保藏的酿酒酵母菌菌种，经PDA平板2-3次活化，然后接种于PDB培养基中，32℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得酿酒酵母菌种子液备用。
6、湿基发酵饲料制备
将贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液，戊糖片球菌NHB-PpA9601种子液和酿酒酵母菌种子液混合均匀，获得菌种混合液。然后和复合发酵原料混合均匀，混合均匀后装入呼吸袋中密封，发酵5-7天，获得戊糖片球菌NHB-PpA9601湿基发酵饲料。
所述菌种混合液由下述组分组成：贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液30％，戊糖片球菌NHB-PpA9601种子液(实施例2制备的发酵液)60％，酿酒酵母菌种子液10％。
所述复合发酵原料由下述组分组成：玉米粉40-70％，豆粕10-30％，麸皮10-30％，小苏打0.1-1.5％，微量矿物元素0.1-0.5％，磷酸氢钙0.1-1％，大豆油0.5-5％，赖氨酸0.5-5％。
优选为：玉米粉61％，豆粕20％，麸皮15％，小苏打0.5％，微量矿物元素0.2％，磷酸氢钙0.8％，大豆油1％，赖氨酸1.5％。
所述微量矿物元素由下述组分组成：碘化钾10-40％，氯化钴5-20％，亚硒酸钠5-35％，硫酸铜5-15％，硫酸亚铁10-45％，硫酸锌10-40％，硫酸锰5-30％。
优选为：碘化钾20％，氯化钴10％，亚硒酸钠15％，硫酸铜5％，硫酸亚铁15％，硫酸锌20％，硫酸锰15％。
所述贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，其保藏编号为CGMCC NO.21191，已在中国专利CN112574922A中公开；该菌已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例8湿基发酵饲料在肉鸡生产中的应用
试验选取2000只体况良好的1日龄白羽肉鸡，随机分成2组，每组10个重复，每重复100只鸡。试验处理分别为：(1)对照组基础日粮(CON)；(2)试验组基础日粮+10％湿基发酵饲料(实施例7制备)。基础日粮饲料配方(表7所示)，试验鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照肉鸡饲养管理手册。本试验生长性能结果如表8所示，结果显示，添加由戊糖片球菌NHB-PpA9601制备的湿基发酵饲料可显著提高白羽肉鸡的生产性能及存活率，与对照组相比，料肉比降低11.73％，存活率提升4.87％。屠宰性能结果如表9所示，结果显示，湿基发酵原料组白羽肉鸡的屠宰率略微高于对照组，而半净膛率、全净膛率、胸肌率、腹脂率各组之间均差异不显著(P>0.05)。肠道健康结果如表10所示，结果显示，试验组十二指肠、空肠、回肠长度以及肠道总长均有高于对照组，而肠道评分则显著低于对照组(P<0.05)，这提示湿基发酵饲料的添加促进了肉鸡的肠道生长发育情况，改善了肠道健康。
表7基础日粮组成及营养水平(风干基础％)
Figure BDA0003165705290000191
表8湿基发酵饲料对肉鸡生长性能的影响
Figure BDA0003165705290000192
表9湿基发酵饲料对白羽肉鸡屠宰性能的影响
Figure BDA0003165705290000193
Figure BDA0003165705290000201
表10湿基发酵饲料对白羽肉鸡肠道健康的影响
Figure BDA0003165705290000202
注：肠道评分指标包括胀气、水分、肠壁、弹性、粘液、黏膜脱落、后端含料、出血性肠炎、气泡以及血便；评分标准：出现上述情况打1分，没有打0分。
实施例9湿基发酵饲料在罗曼白蛋鸡生产中的应用
试验选取体重相近、采食正常、产蛋率一致的4800羽罗曼白蛋鸡，随机分成2组，每组3个重复，对照组饲喂基础日粮(表11所示)，试验组饲喂基础日粮+5％湿基发酵饲料(实施例7制备)，试验全期90天。试验开始前，对鸡舍进行全面的消毒。试验采用阶梯式笼养(每笼4只鸡)，每个处理的各个重复均匀的分布在整个鸡舍内。采用人工光照为主，自然光照为辅的方法，自然通风和机械通风相结合的方式，自由采食和饮水，每天五点、十七点饲喂两次。预饲期让蛋鸡逐渐适应新的环境和饲养管理方式，到第7天完全改为正式期的试验日粮。结果表明：生产性能方面，试验组蛋鸡平均蛋重显著增加(P<0.05),料蛋比显著降低(P<0.05)，产蛋率极显著提高(P<0.01)；营养物质表观代谢率方面，试验组蛋鸡能量、干物质、粗蛋白表观代谢率均显著高于普通饲料组蛋鸡(P<0.05)；蛋品质方面，试验组显著提高了蛋品新鲜度(P<0.05)，极显著降低了蛋品的腥味(P<0.01)，可接受度显著增加(P<0.01)。
表11基础日粮原料组成及营养水平(风干基础％)
原料组成 基础日粮 营养水平 基础日粮
玉米(禽) 59.45 DM 87.4
豆粕46％ 13.00 CP 16.28
玉米DDGS(10/26) 7.00 Ash 12.69
石粉(粒状) 5.42 CF 3.03
花生粕48 4.00 EE 5.08
贝壳粉 4.00 NDF 8.96
玉米蛋白粉60 2.20 Ca 3.7
豆油 1.40 P-total 0.5
大豆磷脂油 1.00 Salt 0.2
小料 2.53
Total 100.00
表12湿基发酵饲料对蛋鸡生产性能的影响
指标 对照组 试验组
产蛋率(％) 84.21±2.63<sup>B</sup> 87.63±2.57<sup>A</sup>
平均蛋重(g) 64.17±0.99<sup>b</sup> 64.91±0.74<sup>a</sup>
ADFI(g/d) 111.16±7.96 111.35±6.78
料蛋比 2.06±1.47<sup>a</sup> 1.96±1.33<sup>b</sup>
不合格蛋率(％) 7.41±2.41 6.45±1.67
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
表13湿基发酵饲料对蛋鸡营养成分表观代谢率的影响
指标(％) 对照组 试验组
能量 71.46±1.71<sup>B</sup> 81.06±3.03<sup>A</sup>
干物质 65.9±1.96<sup>b</sup> 74.99±2.39<sup>a</sup>
粗蛋白 66.67±2.24<sup>b</sup> 75.57±3.07<sup>a</sup>
钙 48.67±4.42 61.46±4.63
总磷 52.27±9.12 68.69±9.44
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
表14湿基发酵饲料对鸡蛋品质的影响
指标 对照组 试验组
蛋壳硬度 3.99±0.05 4.13±0.12
蛋白高度 6.03±0.32<sup>b</sup> 6.35±0.24<sup>a</sup>
哈氏单位 76.52±2.19<sup>b</sup> 82.07±3.76<sup>a</sup>
蛋黄比色 13.22±0.03 13.17±0.08
蛋黄比重(％) 28.72±0.15 28.71±0.23
蛋壳比重(％) 11.78±0.08 11.79±0.14
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
表15湿基发酵饲料对鸡蛋黄中三甲胺含量的影响
阶段 对照组 试验组
0d 9.10±1.12<sup>a</sup> 7.95±1.46<sup>b</sup>
30d 6.34±0.78<sup>a</sup> 4.56±1.03<sup>b</sup>
60d 14.39±2.34<sup>A</sup> 10.6±3.26<sup>B</sup>
90d 10.21±1.83<sup>a</sup> 8.70±2.04<sup>b</sup>
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
表16湿基发酵饲料对蛋品品尝指标的影响
指标 对照组 试验组
气味评分 9.96±1.11<sup>b</sup> 11.24±1.71<sup>a</sup>
香味评分 9.56±0.87 10.28±0.25
风味评分 10.50±0.56<sup>b</sup> 11.94±1.03<sup>a</sup>
余味评分 10.20±1.28<sup>b</sup> 11.46±0.84<sup>a</sup>
腥味评分 11.74±0.34<sup>A</sup> 9.74±1.01<sup>B</sup>
可接受度 9.96±0.79<sup>B</sup> 11.82±0.89<sup>A</sup>
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新希望六和股份有限公司
四川新希望畜牧科技有限公司
成都枫澜科技有限公司
<120> 一株戊糖片球菌NHB-PpA9601及应用
<130> 2029
<141> 2021-05-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> Pediococcus pentosaceus
<400> 1
tgcagtcgaa cgaacttccg ttaattgatt atgacgtact tgtactgatt gagattttaa 60
cacgaagtga gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccaga agtaggggat 120
aacacctgga aacagatgct aataccgtat aacagagaaa accgcatggt tttcttttaa 180
aagatggctc tgctatcact tctggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta 240
aaggctcacc aaggcagtga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac 300
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca 360
agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt 420
taaagaagaa cgtgggtaag agtaactgtt tacccagtga cggtatttaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtctt ttaagtctaa tgtgaaagcc ttcggctcaa 600
ccgaagaagt gcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720
tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccatgccg taaacgatga ttactaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840
ctaacgcatt aagtaatccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatcttc tgacagtcta agagattaga ggttcccttc ggggacagaa 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttattac tagttgccag cattaagttg ggcactctag tgagactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagtcgcgag accgcgaggt taagctaatc 1260
tcttaaaacc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagccggtgg ggtaaccttt taggagctag 1440
ccgtctaa 1448

Claims (10)

1.一株戊糖片球菌NHB-PpA9601，分类命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)NHB-PpA9601，于2021年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22646，保藏地址为中国北京。
2.一种含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601的液体菌剂。
3.一种含有保藏编号为CGMCC No.22646的戊糖片球菌NHB-PpA9601的湿基发酵饲料。
4.如权利要求1-3之一所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601在动物饮水用饲料添加剂上的应用。
5.如权利要求4所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601在动物饮水用饲料添加剂上的应用，其特征在于饲料添加剂中戊糖片球菌NHB-PpA9601的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中戊糖片球菌NHB-PpA9601的活菌数为1×107CFU/g。
6.如权利要求1-3之一所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
7.如权利要求1-3之一所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
8.如权利要求1-3之一所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
9.如权利要求4所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用，其特征在于所述的广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
10.如权利要求1-3之一所述的戊糖片球菌NHB-PpA9601或含有其的菌剂在食品制造中的应用，所述的食品为动物用食品，优选的是在肉鸡生产中的应用。
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