CN114806975B - 一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用，本发明的微生态制剂中含有肠源性益生菌，所述益生菌命名为嗜酸乳杆菌LA18，其发酵代谢产物中富含的乳酸菌素能够对常见的致病菌的生长和繁殖产生抑制和杀灭作用，而且嗜酸乳杆菌LA18还具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性，有助于维护动物肠道微生物群落平衡，提高生产性能。该微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：菌株的活化培养，摇瓶种子培养，种子的扩大培养，发酵罐培养，喷雾干燥，即得到含有乳酸菌素嗜酸乳杆菌LA18的微生态制剂。该微生态制剂用于动物养殖，能有效保证动物肠道健康，为“饲料禁抗、养殖减抗和食品无抗”的防治提供新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生态制剂的技术领域，具体涉及一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着禁抗政策的落实，新的绿色、安全、有效、无公害的抗生素替代品的开发与应用成为降低饲料“禁抗”后对养殖业影响的有利措施，也是畜禽养殖发展的必然趋势。研究抗生素及其替代品，大多数是通过研究肠道内微生态变化来探索其对动物机体影响的作用机制。所以，新型抗生素的替代品至少应具备以下几个重要特征：1）调整肠道共生物微生物群落结构；2）保证动物肠道结构完整，促进营养物质吸收；3）维护肠道免疫系统稳态，保持动物健康度。这些作用互相关联，并且它们都与肠道健康直接相关。功能型微生态制剂是新一代替抗产品的典型代表之一，它们种类繁多、活性独特、功能多样，通过调节肠道微生态平衡、竞争性抑制肠道内的病原微生物，从而帮助动物建立有利于宿主的肠道微生态区系，提高机体免疫机能，改善饲料利用效率，促进动物生长，预防疾病。乳酸杆菌属作为动物肠道中的优势菌群，是常见的益生菌，已作为微生态制剂广泛应用于畜牧养殖，不仅可以抑制致病菌在肠道中定植，维持肠道微生物区系平衡，而且可以调控宿主的免疫力，还可以改善肠道形态结构，是动物肠道微生态平衡与肠道健康的关键指标。其中，嗜酸乳杆菌作为具备较好过胃并在肠道内存活能力益生菌，能够有效的定植于动物肠道上皮细胞，并通过产生乳酸、乳酸菌素等抑制肠道内的有害菌，从而保护胃肠道，提高动物的抗病能力。但是由于不同来源的嗜酸乳杆菌的定植能力、代谢产物功能以及抗逆性差异大，大大影响了其在生产实践中的应用，也限制了其该类菌株益生功能的发挥。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种含有肠源性益生菌的微生态制剂，微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌LA18，其发酵代谢产物中富含的乳酸菌素能够对金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌等动物常见的致病菌的生长和繁殖产生抑制和杀灭作用，有助于维护动物肠道微生物群落平衡，提高生产性能；本发明的目的之二在于提供一种含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种含有肠源性益生菌的微生态制剂的应用，该微生态制剂用于动物养殖，在减抗、替抗等方面具备良好的应用前景。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种含有肠源性益生菌的微生态制剂，所述微生态制剂含有肠源性益生菌，所述肠源性益生菌株命名为嗜酸乳杆菌LA18（Lactobacillus acidophilus LA18），保藏号为GDMCC No: 62222，保藏日期为2022年1月13日，保藏分类命名为嗜酸乳杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体地，所述嗜酸乳杆菌LA18的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供的嗜酸乳杆菌LA18是通过如下方法分离、选育获得的：取健康成年猪小肠段部分，取部分内容物装入含有无菌生理盐水的三角瓶中，水浴振荡，将水浴液采用梯度稀释的方式涂布于含有的猪胆盐和碳酸钙的选择性培养基，特异性筛选具备一定产酸能力和胆盐耐受能力的乳酸菌属，然后挑取菌落形态、大小、色泽以及碳酸钙圈等明显有差异的菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌作为检菌的平板中进行对峙培养，挑取明显具有透明圈的菌株进行摇瓶发酵复筛，并采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能，选取抑菌圈直径最大的菌株进行进一步的ARTP诱变选育，结合96孔板初筛、摇瓶发酵复筛进一步优选抑菌性能显著提高的菌株，再进行热稳定性测试、酸碱度稳定性测试和蛋白酶稳定性测试，筛选得到同时具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性的优良突变菌株LA18，并对优良突变菌株LA18进行分子鉴定及遗传稳定性的考察，最终获得优良菌株LA18并进行保藏。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将所述嗜酸乳杆菌LA18菌株进行活化培养；
2）活化后的菌株进行摇瓶种子培养，得到摇瓶种子；
3）将摇瓶种子移接至种子培养基进行种子扩大培养；
4）将扩大培养后的种子移送至发酵罐培养，得到发酵液后，再进行喷雾干燥，得到含有肠源性益生菌的微生态制剂。
进一步，步骤1）中，所述活化培养是采用MRS琼脂培养基对所述嗜酸乳杆菌LA18菌株斜面培养，具体步骤为：接种甘油菌至MRS琼脂培养基平皿，培养箱中于35~37℃培养36~48h，再用无菌生理盐水洗下，转接于MRS培养基，于培养箱中35~37℃培养24~48h。
再进一步，步骤2）中，所述摇瓶种子培养的具体步骤为：将活化培养后的菌种，加入无菌生理盐水洗脱制备菌悬液，转接于装有MRS肉汤培养基的摇瓶中，在转速为80~100r/min和温度为35~37℃的条件下培养12~14h，然后再在35~37℃下静置培养12~24h。
进一步，步骤3）中，所述种子扩大培养的具体步骤为：采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，种子摇瓶按接种量2~10%移接含有种子培养基的种子罐；其中，罐压为0.05~0.1Mpa，罐温为35~37℃，搅拌转速为100~150r/min，溶氧为自然下降，底糖选用质量浓度为5~10%的还原糖，移种量为10~20%，培养周期为12~18h，所述摇瓶种子的菌落数＞109cfu/mL。
再进一步，所述种子培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉1~2%、蔗糖2~5%、葡萄糖0.5~1.5%、甘蔗糖蜜0.5~1%、酵母膏0.5~2%、乙酸钠0.5~1%、柠檬酸氢二铵0.1~0.5%、硫酸铵0.1~0.5%、轻质碳酸钙0.5~1%、硫酸镁0.01~0.05%、硫酸锰0.001~0.005%、吐温80 0.05~0.2%、豆油0.1~0.2%，由水补足100%；其中，种子培养基的pH为6.0~6.5。
进一步，步骤4）中，所述发酵罐培养的具体步骤为：扩大培养后的种子移种至发酵罐中的液体培养基内，移种量为10~20%；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150~200mL/min，搅拌转速为100~200rpm，温度为35~37℃，初始还原糖的浓度为50~100g/L，溶氧控制自然；全过程通过控制流加质量浓度为50~70%的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.5~1.0g/100mL再进行好氧发酵，好氧发酵的周期为18~24h，好氧发酵完成后关闭搅拌，维持发酵罐内正压，再进行厌氧发酵12~18h，停止发酵，在发酵液中加入碳酸钙和脱脂米糠，然后直接进行喷雾干燥，出口温度120~130℃。
再进一步，所述液体培养基按以下重量份百分计的原料：黄豆饼粉4~5%、玉米淀粉1~2%、蔗糖1~3%、葡萄糖0.1~0.5%、甘蔗糖蜜1~2%、酵母膏1~2%、柠檬酸氢二铵0.1~0.5%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、乙酸钠0.1~0.5%、硫酸铵0.1~0.2%、硫酸镁0.01~0.05%、硫酸锰0.001~0.005%，加水补足100wt%；再加入0.1~0.5mL/100mL的吐温80。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的应用，所述含有肠源性益生菌的微生态制剂在动物养殖上的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明的微生态制剂中含有肠源性益生菌，所述益生菌命名为嗜酸乳杆菌LA18，嗜酸乳杆菌LA18的发酵代谢产物中富含的乳酸菌素能够对金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌等动物常见的致病菌的生长和繁殖产生抑制和杀灭作用，而且嗜酸乳杆菌LA18还具备温度、酸碱以及蛋白酶稳定性，有助于维护动物肠道微生物群落平衡，提高生产性能。
（2）本发明的微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：菌株的活化培养，摇瓶种子培养，种子的扩大培养，发酵罐培养，喷雾干燥，即得到含有乳酸菌素嗜酸乳杆菌LA18的微生态制剂。
（3）本发明的微生态制剂用于动物养殖，能有效保证动物肠道健康，为“饲料禁抗、养殖减抗和食品无抗”的防治提供新的思路。
实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
优良突变菌株嗜酸乳杆菌LA18的选育
1、嗜酸乳杆菌出发菌株L18的筛选
（1）肠道内容物样品的制备及菌株分离
取健康成年猪十二指肠、空肠、回肠，分别选择长约5cm的各部分，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在1小时内进行菌种分离工作，其中，样品的处理及菌株的分离工作均在无菌操作台完成：无菌环境中将各肠段内容物挤出，称取5~6g的肠道内容物，加入含有50mL无菌生理盐水三角瓶中。为了能够特异性筛选耐受一定温度的菌株，将含有内容物的三角瓶在80℃水浴中100rpm振荡5min。处理结束后，将水浴液采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-4，取稀释液涂布于含有0.5%的猪胆盐3.0%的碳酸钙MRS培养基平板，37℃培养48h以上，至有单菌落长出。其中，MRS培养基组成包括: K2HPO4 2.0 g，无水乙酸钠 5.0 g，酵母粉 5.0 g，MgSO4 0.5 g，牛肉膏 10.0g，柠檬酸铵 2.0 g，胰蛋白胨 10.0g，葡萄糖20.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0 g，蒸馏水 1000 mL，pH值6.4±0.2。121 ℃灭菌 15 min。
（2）菌株的特异性筛选
在筛选平板上挑取菌落呈乳黄色至乳白色、表面有凸起、湿润无褶皱、有明显溶钙圈、革兰氏染色为阳性的菌株255株，并重复划线于MRS固体培养基，37℃培养，进行菌株纯化，保存。同时，挑取纯化菌株点殖于含有金黄色葡萄球菌ATCC25923作为指示菌的肉汤培养基平板中进行对峙培养（肉汤培养基组成包括：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.8±0.2，121 ℃灭菌 20 min），37℃培养24h，其中，金黄色葡萄球菌作为指示菌，按照每100mL培养基加入10μL指示菌（108CFU/mL）的比例制备对峙平板。
根据不同的菌株对指示菌抑制作用的不同，挑取能够形成明显透明圈的菌株24株，它们的抑菌能力大小跟菌株差异以及菌落直径的大小有关，抑菌能力一般按照抑菌圈直径与菌落直径的比值做抑菌能力的初步排序，比值越大，抑菌性能越强。具体如表1所示。
表1 24株菌株抑菌圈直径与菌落大小的比值
（3）菌株的摇瓶发酵复筛
挑取上述比值＞4的菌株进行进一步的摇瓶发酵复筛。其中摇瓶发酵培养基组成包括：黄豆饼粉 45.0，玉米淀粉 15.0g，蔗糖25.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵 2.0g，硫酸胺 1.0g，轻质碳酸钙 6.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0g，甘蔗糖蜜 15.0g，蒸馏水1000mL，pH至6.0-6.5，121℃灭菌20min。每个250mL的摇瓶装液量为50 mL, 150rpm，37℃发酵48h。发酵结束，利用20%氢氧化钠调节pH至5.5-6.0，排除有机酸对抑菌活性检测的干扰，8000r/min离心10min收集发酵上清液，采用琼脂扩散法检测上清液对金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠杆菌CMCC44103的抑菌。
其中，发酵液对金黄色葡萄球菌ATCC25923（G+）抑菌活性测定：使用LB固体培养基，加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量金黄色葡萄球菌ATCC25923（按照每100mL培养基加入10μL指示菌（108CFU/mL）的比例），混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul发酵上清液加入点样孔中，放入4℃冷藏吸收1h后于37℃培养箱中培养24h，取出平板测量抑菌圈直径。
发酵液对大肠杆菌CMCC44103（G-）抑菌活性测定：使用LB固体培养基，加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量大肠杆菌CMCC44103（按照每100mL培养基加入10μL指示菌（108CFU/mL）的比例），混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul发酵液加入点样孔中，放入4℃冷藏吸收2h后于30℃培养箱中培养24h，取出平板测量抑菌圈直径，数据如表2所示。
抑菌圈直径（mm）=抑菌圈外径-6.0mm孔径
表2 10株初筛菌株摇瓶发酵复筛的抑菌性能
如表2的摇瓶发酵复筛结果显示：相较其它菌株来说，L18菌株不仅具有对金黄色葡萄球菌ATCC25923（G+）具备最好的抑制效果，对大肠杆菌CMCC44103（G-）的抑制效果也最好，其中对G+菌的抑制效果优于G-菌。将L18菌株进保存，备用，此即为肠道内容物样品分离获得的菌株L18。
2、LA18菌株的选育
（1）菌株活化
取上述分离获得的L18菌株作为出发菌株，取其甘油菌接种于MRS培养基的斜面，37℃培养48h，培养结束后，从中取一环菌株划线至另一支新鲜的MRS斜面培养基中，37℃培养24h，进一步强化菌株活力，复壮菌株，达到菌株活化的目的。
（2）菌株ARTP诱变参数的确定
活化培养好的斜面中加入无菌生理盐水，洗脱，制备菌悬液，控制菌悬液OD600nm值在0.5-0.7之间。取10μL的菌悬液，均匀涂布在金属载片的表面，干燥后用灭菌镊子将装有样品载片的平板转移至ARTP操作仓。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，设置不同的处理组，各组的处理时间分别为 0（对照）、30、60、90、120、150、180s，每组设置三次重复。将处理后的载片转移到装有1mL灭菌生理盐水的EP管中，振荡器洗脱60s，把附着在载片上的微生物洗脱到无菌生理盐水中，形成菌悬液。将菌悬液适当稀释后涂布至相应的平板，置于37℃培养箱内培养72h后进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：
致死率%＝（未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数）/未经诱变菌落数×100%
通过统计各处理组的致死率，选择致死率约85%的照射处理时间进行正式实验，即保证一定的突变丰富度，又提供一定的存活率。
结果显示：L18的菌悬液经ARTP诱变，以未经ARTP处理的（处理时间0s）的菌株为对照，ARTP处理30s，致死率为65.9%；处理60s，致死率上升至84.1%；处理90s，致死率为99.9%细胞存活率基本为0。所以，在保证诱变损伤的同时又有一定的细胞存活率进行后续筛选，选择致死率约为85%的条件进行ARTP处理，所以L18菌株的ARTP的最有处理时间确定为60s。
（3）诱变菌株的筛选
96孔板初筛：将上述诱变平板中生长较快、抑菌圈直径/菌落直径＞1.5的菌株288株，分别点殖至含有1.0mL初筛培养基的96孔培养板中（初筛培养基组成包括：蔗糖25.0，葡萄糖5.0，酵母膏20.0，乙酸钠 5.0，柠檬酸二铵 2.0，硫酸胺 1.0，轻质碳酸钙 6.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温80 10.0g，蒸馏水1000mL，pH至6.0-6.5，121℃灭菌20min），37℃，200rpm培养48h。4000r/min离心15min，收集上清液，琼脂扩散法检测培养液上清对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌活性。挑取其中抑菌圈直径较出发菌株L18明显大的菌株10株进行保存，备用。结果如表3所示。
表3 L18菌株ARTP诱变初筛结果（部分）
摇瓶发酵复筛：选取初筛抑菌圈大于＞18mm的突变菌株进行斜面传代，然后转接含有摇瓶发酵培养基的摇瓶，250mL的摇瓶装液量为50 mL, 200rpm，30℃发酵48h。发酵结束，20%氢氧化钠调节pH至5.5-6.0，排除有机酸对后续测定的干扰，8000r/min离心收集发酵上清液，测定上清液对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌活性，结果如表4。
如表3~4所示，LA18菌株的不论是对G+菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923还是对G-菌株大肠杆菌CMCC44103都展现了较好的抑制活性。将LA18菌株进行斜面保存及甘油保种，编号LA18，简称嗜酸乳杆菌LA18。
表4. 摇瓶发酵复筛结果
热稳定性的考察：将LA18菌株的发酵上清液调节pH值至6.0后，分别在60℃、80℃和100℃水浴中处理30min，冷却至室温后，用琼脂扩散法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以未处理的作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923，考察不同温度对菌株发酵上清液抑菌性能的影响，数据如表5。
如表5所示：嗜酸乳杆菌LA18的发酵上清液在不同的温度下处理一定的时间，其抑菌圈结果如下表5所示，100℃处理后抑菌圈直径仍保持在26.4mm，体现了非常好的热稳定性，作为饲料添加剂，常规的热加工对其的抑菌性能影响不大。
表5 嗜酸乳杆菌LA18菌株发酵液上清的热稳定性
酸碱稳定性的考察：将LA18菌株的发酵上清液分别调节pH为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0，处理2h，然后再调回至6.0，再同样用琼脂扩撒法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以pH调为6.0的作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923，考察不同酸碱度对菌株发酵上清液抑菌性能的影响，数据如表6。
如表6所示：嗜酸乳杆菌LA18的发酵上清液在不同的酸碱度下处理一定的时间，其抑菌圈结果如下表6所示，发酵上清液处理之后都保持着较好的抑菌活性，抑菌圈直径变化不大，表明LA18菌株发酵液上清具有较好的酸碱稳定性，常规来说，不会受到动物胃肠道的生理pH的影响。
表6 嗜酸乳杆菌LA18菌株发酵液上清的酸碱稳定性
蛋白酶稳定性的考察：将LA18菌株发酵上清液分别调至pH3.0和pH7.0，并分别加入来自猪胃液的胃蛋白酶（1:3000）和来自猪胰腺的胰蛋白酶（1:2500），使之终浓度分别为1.0mg/mL，37℃处理2h，然后再调回至6.0，再同样用琼脂扩散法检测抑菌活性，测量抑菌圈直径，并以pH调为6.0未酶处理的发酵上清液作为对照进行比较，指示菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923，考察不同蛋白酶对菌株发酵上清液抑菌性能的影响，结果见表7。
如7所示：用胰蛋白酶与胃蛋白酶处理发酵液后抑菌圈保持在95%以上，说明LA18发酵液上清中的抑菌物质受蛋白酶的影响较小，具备一定的动物胃肠道蛋白酶的耐受性。
表7 嗜酸乳杆菌LA18菌株发酵液上清的蛋白酶的稳定性
（4）LA18菌株的分子鉴定
最终获得能够代谢产生较高含量抑菌活性乳酸菌素的优良突变菌株LA18，利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒( 购自于上海生工) 提取LA18菌株的基因组 DNA，并采用通用引物 27F( 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') /1492R( 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增其16S rDNA部分序列 。反应体系如下：Pre-mix Ex Taq( Takara 公司) 12. 5 μL，27F引物( 10 μmol /L) 1 μL，1492R引物( 10 μmol /L) 1 μL，LA18基因组 DNA 模板 0.5μL，超纯水10 μL。PCR条件: 95 ℃预变性 5 min; 94 ℃ 变性 40 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸 1 min30s，进行30个循环管，最后 72 ℃延伸 10 min，并在4℃保存。得到特异性扩增产物后采用PCR回收试剂盒（购自于上海生工）回收目的片段，送样至生工生物技术有限公司测序。
测序结果在NCBI 核酸库中进行Blast分析和比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），结果显示：LA18菌株亲缘关系最近的为乳杆菌属，相似度最高的为Lactobacillus acidophilus DSM 20079（CP020620.1），相似度达到99.77%，确认分离、选育获得的优良突变菌株LA18为嗜酸乳杆菌LA18（Lactobacillusacidophilus LA18），嗜酸乳杆菌的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
（5）LA18菌株的遗传稳定性验证
所述的遗传稳定性，指的是指将上述嗜酸乳杆菌LA18进行传代培养，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵抑菌活性检测。
将筛选得到的优良突变菌株嗜酸乳杆菌LA18进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌株的抑菌活性，测量发酵上清液抑菌圈直径，考察菌株在传代过程中的稳定性。结果显示：嗜酸乳杆菌LA18传代过程中发酵液抑菌性能无明显变化，具备良好的遗传稳定性。
获得遗传稳定的优良突变菌株嗜酸乳杆菌LA18于2022年1月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC；地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075），保藏编号为GDMCC No: 62222。嗜酸乳杆菌LA18（Lactobacillus acidophilus LA18），简称为嗜酸乳杆菌LA18。
含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将所述嗜酸乳杆菌LA18菌株进行活化培养；具体步骤为：接种嗜酸乳杆菌LA18甘油菌至MRS琼脂培养基斜面（18×180mm），培养箱中于37℃培养48h，此即为F1代。然后，再用5ml无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有MRS培养基的茄瓶培养基，于培养箱中37℃培养24h，此即为F2代活化菌株；
2）活化后的菌株进行摇瓶种子培养，具体步骤为：将活化培养后的菌种，加入20mL无菌生理盐水洗脱制备菌悬液，转接于装有1000mL的MRS肉汤培养基的5L摇瓶中，在转速为80~100r/min和温度为35℃的条件下培养12h，然后再在37℃下静置培养12h，，进一步提高菌落总数，同时强化菌株活力，得到摇瓶种子；
3）采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，种子摇瓶按接种量6%移接含有种子培养基的种子罐；其中，罐压为0.06Mpa，罐温为37℃，搅拌转速为100r/min，溶氧为自然下降，底糖选用质量浓度为5%的还原糖，移种量为20%，培养周期为18h，所述摇瓶种子的菌落数＞109cfu/mL。
其中，所述种子培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉1.5%、蔗糖3%、葡萄糖1%、甘蔗糖蜜1%、酵母膏1%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、硫酸铵0.1%、轻质碳酸钙0.6%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、吐温80 0.1%、豆油0.1%，由水补足100%；其中，种子培养基的pH为6.0~6.5，种子培养基调配完成后在121℃下进行高压灭菌20min。
4）扩大培养后的种子移种至发酵罐中的液体培养基内，移种量为20%；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150~200mL/min，搅拌转速为100~200rpm，温度为35℃，初始还原糖的浓度为70g/L，溶氧控制自然；全过程通过控制流加质量浓度为70%的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.6g/100mL再进行好氧发酵，好氧发酵的周期为24h，好氧发酵完成后关闭搅拌，维持发酵罐内正压，再进行厌氧发酵12h，停止发酵，在发酵液中加入5.0%（w/v）碳酸钙和10%（w/v）脱脂米糠，然后直接进行喷雾干燥，出口温度为125℃，得到含有乳酸菌素等代谢产物以及含有肠源性益生菌的微生态制剂，测定微生态制剂中嗜酸乳杆菌LA18菌株的活菌数和抑菌性能，测量结果为：LA18微生态制剂产品中水分含量小于10%，LA18菌株的活菌数107cfu/g以上，产品的对G+菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌圈直径达到20mm以上。本实施例的含有肠源性益生菌的微生态制剂中含有的代谢产物种类非常多，包括乳酸、乙酸等有机酸，乳酸菌素等蛋白或多肽类，以及多糖类产物。本申请制备的是全代谢产物（包括菌株和代谢产物的制剂），所以没有特别的产物分离措施，经济实惠，便于饲料应用。
其中，所述液体培养基按以下重量份百分计的原料：黄豆饼粉4.5%、玉米淀粉1.5%、蔗糖2%、葡萄糖0.5%、甘蔗糖蜜1.5%、酵母膏1.0%、柠檬酸氢二铵0.2%、磷酸二氢钾0.15%、乙酸钠0.1~0.5%、硫酸铵0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%，加水补足100wt%；再加入0.1mL/100mL的吐温80。
含LA18菌株的微生态制剂在养殖上的应用
1、在仔猪上的应用
选择160头25d断奶仔猪，按体重和性别相近的原则随机分为4组，每组4个重复，每个重复10头。其中①为基础日粮对照组，②为抗生素对照组：基础日粮+抗生素组（那西肽5+喹烯酮50+金霉素75mg/kg），③为添加LA18微生态制剂200mg/kg的试验组，④为添加LA18微生态制剂500mg/kg的试验组。其中，基础日粮均含有氧化锌和酸化剂。每组饲喂对应的日粮，试验期28 d。自由采食和饮水。数据见表8。
表8 含LA18菌株的微生态制剂替代抗生素对仔猪生长性能的影响
注：同行数据上标有不同的小写字母表示各处理间差异显著（p＜0.05）；标有相同小写字母表示差异不显著（p＞0.05）。
由表8可知，LA18微生态制剂能够提高仔猪的采食量、日增重，促进仔猪的生长性能，并且500gm/kg的添加量要好于200mg/k
g的添加量；LA18微生态制剂在仔猪饲料中应用能够达到抗生素的应用效果，并且降低腹泻率方面较抗生素组效果要好。
2、在白羽肉鸡中的应用
选择0日龄健康体重约42克罗斯308肉鸡12000只，随机分为2个处理，每个处理4个重复，每个重复1500只。分为小鸡（0-21d）、中大鸡（22-42d）两个阶段。分别统计小鸡阶段、中大鸡及全程的日增重，及料肉比，试验数据采用SPSS16.0 for Windows软件进行统计，采用单因素方差分析，差异显著性采用独立样本T检验。试验设计见下表9。测试结果见表10。
表9 试验设计
表10 LA18微生态制剂对罗斯308肉鸡生产性能的影响
注：同列数据上标有不同的小写字母表示各处理间差异显著（p＜0.05）；标有相同小写字母表示差异不显著（p＞0.05），下同。
结果如表10，试验表明：LA18微生态制剂能够提高白羽肉鸡的生产性能和降低死淘率；在白羽肉鸡饲粮中使用LA18微生态制剂，可以达到抗生素亚甲基水杨酸杆菌肽的应用效果。
3、在蛋鸡中的应用
选择48周龄、健康的京红蛋鸡2400只，随机分为2个处理，其中一组饲喂基础日粮（对照组），一组饲喂试验日粮（基础日粮+200mg/kg的LA18微生态制剂），每个处理3个重复，每个重复400只。预试期7d，正试期28d。实验组的蛋鸡基础日粮组成及营养水平见表11。测试结果见表12。
表11 蛋鸡基础日粮组成及营养水平
表12 LA18微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响
结果表12所示：LA18微生态制剂能够显著提高蛋鸡产蛋率；LA18微生态制剂能够显著降低料蛋比、破蛋率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 广东容大生物股份有限公司、广西大学
<120> 一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 867
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)
<400> 1
cctttccccc tccggtactg gttcactatc ggtcactaac tagtatttag ccttgcgaga 60
tggtcctcgc ggcttcaacc gggattcctc gtgtcccggc ctactcagga ttctgctagg 120
cgcgctcgca atttcgctta cggggctctc accctctctg gcttaccttc ccagataatt 180
caactatcgc ttacgctacc actttgcagt cctacaaccc caaatgataa atcacttggt 240
ttgggctctt tcctcttcgc tcgccgctac taaggaaatc gatttttctt tctcttcctg 300
cagctactta gatgtttcag ttcactgcgt cttcctttga ttgactatct attcatcaac 360
caataatgca tcgctgcatt gggttccccc attcggacat ctccggatca ctgcgtactt 420
accgctcccc gaagcttttc gtagttcgtc acgtccttca tcggctgtta gtgcctaggc 480
attcaccgtg cgcccttttc tacttgacct tacccaagaa ttctcttctc ggtcgctcta 540
caatctgttc tctttgattg tctcggtttt ttgcttggat tatattcagt tttcaatgta 600
ctaactcttt tgaggtacta ccctcaaaac taaacaaagt ttcttagtgt gcttccgctt 660
gctctggata cttctcttag tatttctact ctccatatcc ttcgcttcct tagaaaggag 720
gtgatccagc cgcaggttct cctacggcta ccttgttacg acttcacccc agtcatctgc 780
cctgccttag acggctcctt cccgaaggtt aggccaccgg ctttgggcat tgcagactcc 840
catggtgtga cgggcgggtg tgtacaa 867
Claims (9)
1.一种含有肠源性益生菌的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂含有肠源性益生菌，所述肠源性益生菌株命名为嗜酸乳杆菌LA18，保藏号为GDMCC No: 62222，保藏日期为2022年1月13日，保藏分类命名为嗜酸乳杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA18的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将所述嗜酸乳杆菌LA18菌株进行活化培养；
2）活化后的菌株进行摇瓶种子培养，得到摇瓶种子；
3）将摇瓶种子移接至种子培养基进行种子扩大培养；
4）将扩大培养后的种子移送至发酵罐培养，得到发酵液后，再进行喷雾干燥，得到含有肠源性益生菌的微生态制剂。
4.如权利要求3所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述活化培养是采用MRS琼脂培养基对所述嗜酸乳杆菌LA18菌株斜面培养，具体步骤为：接种甘油菌至MRS琼脂培养基平皿，培养箱中于35~37℃培养36~48h，再用无菌生理盐水洗下分生孢子，转接于MRS培养基，于培养箱中35~37℃培养24~48h。
5.如权利要求3所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述摇瓶种子培养的具体步骤为：将活化培养后的菌种，加入无菌生理盐水洗脱制备菌悬液，转接于装有MRS肉汤培养基的摇瓶中，在转速为80~100r/min和温度为35~37℃的条件下培养12~14h，然后再在35~37℃下静置培养12~24h。
6.如权利要求3所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述种子扩大培养的具体步骤为：采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，种子摇瓶按接种量2~10%移接含有种子培养基的种子罐；其中，罐压为0.05~0.1Mpa，罐温为35~37℃，搅拌转速为100~150r/min，溶氧为自然下降，底糖选用质量浓度为5~10%的还原糖，底糖的移种量为10~20%，培养周期为12~18h，所述摇瓶种子的菌落数＞109cfu/mL。
7.如权利要求6所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下按重量百分比计的原料：玉米淀粉1~2%、蔗糖2~5%、葡萄糖0.5~1.5%、甘蔗糖蜜0.5~1%、酵母膏0.5~2%、乙酸钠0.5~1%、柠檬酸氢二铵0.1~0.5%、硫酸铵0.1~0.5%、轻质碳酸钙0.5~1%、硫酸镁0.01~0.05%、硫酸锰0.001~0.005%、吐温80 0.05~0.2%、豆油0.1~0.2%，由水补足100%；其中，种子培养基的pH为6.0~6.5。
8.如权利要求3所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述发酵罐培养的具体步骤为：扩大培养后的种子移种至发酵罐中的液体培养基内，移种量为10~20%；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150~200mL/min，搅拌转速为100~200rpm，温度为35~37℃，初始还原糖的浓度为50~100g/L，溶氧控制自然；全过程通过控制流加质量浓度为50~70%的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.5~1.0g/100mL再进行好氧发酵，好氧发酵的周期为18~24h，好氧发酵完成后关闭搅拌，维持发酵罐内正压，再进行厌氧发酵12~18h，停止发酵，在发酵液中加入碳酸钙和脱脂米糠，然后直接进行喷雾干燥，出口温度120~130℃。
9.如权利要求8所述的含有肠源性益生菌的微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基按以下重量份百分计的原料：黄豆饼粉4~5%、玉米淀粉1~2%、蔗糖1~3%、葡萄糖0.1~0.5%、甘蔗糖蜜1~2%、酵母膏1~2%、柠檬酸氢二铵0.1~0.5%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、乙酸钠0.1~0.5%、硫酸铵0.1~0.2%、硫酸镁0.01~0.05%、硫酸锰0.001~0.005%，加水补足100%；再加入0.1~0.5mL/100mL的吐温80。
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| 钟登科 ; 牛明福 ; 魏建超 ; 张家 ; 张训海 ; 路振香 ; 金光明 ; 王立克 ; .猪肠道乳杆菌的筛选及其生物学特性研究.中国微生态学杂志.2009,(第06期),全文. * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN114806975A (zh) | 2022-07-29 |
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