CN117305381B - 一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 - Google Patents
一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117305381B CN117305381B CN202311601752.9A CN202311601752A CN117305381B CN 117305381 B CN117305381 B CN 117305381B CN 202311601752 A CN202311601752 A CN 202311601752A CN 117305381 B CN117305381 B CN 117305381B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- culture
- clostridium butyricum
- butyrate
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 120
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 103
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 103
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 title claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 49
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 42
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 42
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 67
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 35
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 26
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 12
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 10
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 10
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 10
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 8
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 5
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000006012 monoammonium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 abstract description 18
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 abstract description 18
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 abstract description 18
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 abstract description 12
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 abstract description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 35
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 30
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 27
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 21
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 15
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 14
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 14
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 14
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 4-(bromomethyl)phenol Chemical compound OC1=CC=C(CBr)C=C1 MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 8
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 8
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 3
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 229960002129 cefixime Drugs 0.000 description 3
- OKBVVJOGVLARMR-QSWIMTSFSA-N cefixime Chemical compound S1C(N)=NC(C(=N\OCC(O)=O)\C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(C=C)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)=C1 OKBVVJOGVLARMR-QSWIMTSFSA-N 0.000 description 3
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 3
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 3
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 3
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 3
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 3
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 3
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 3
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N (-)-Florfenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CF)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 AYIRNRDRBQJXIF-NXEZZACHSA-N 0.000 description 2
- WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N (6r,7r)-7-[[(2r)-2-azaniumyl-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-8-oxo-3-[(e)-prop-1-enyl]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)/C=C/C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 WDLWHQDACQUCJR-ZAMMOSSLSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N Bromocresolgreen Chemical compound CC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C(=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 2
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- DMUAPQTXSSNEDD-QALJCMCCSA-N Midecamycin Chemical compound C1[C@](O)(C)[C@@H](OC(=O)CC)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N(C)C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)CC)CC(=O)O[C@H](C)C/C=C/C=C/[C@H](O)[C@H](C)C[C@@H]2CC=O)OC)O[C@@H]1C DMUAPQTXSSNEDD-QALJCMCCSA-N 0.000 description 2
- 239000004384 Neotame Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 2
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 2
- 229960004682 cefoperazone Drugs 0.000 description 2
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 2
- 229960002580 cefprozil Drugs 0.000 description 2
- 229960002588 cefradine Drugs 0.000 description 2
- 229960000484 ceftazidime Drugs 0.000 description 2
- NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N ceftazidime pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 NMVPEQXCMGEDNH-TZVUEUGBSA-N 0.000 description 2
- RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N cephradine Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CCC=CC1 RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960000740 enrofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 229960003760 florfenicol Drugs 0.000 description 2
- 229960000308 fosfomycin Drugs 0.000 description 2
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N fosfomycin Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 description 2
- 229960001625 furazolidone Drugs 0.000 description 2
- PLHJDBGFXBMTGZ-WEVVVXLNSA-N furazolidone Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)OCC1 PLHJDBGFXBMTGZ-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 2
- 229960002757 midecamycin Drugs 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- HLIAVLHNDJUHFG-HOTGVXAUSA-N neotame Chemical compound CC(C)(C)CCN[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 HLIAVLHNDJUHFG-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 235000019412 neotame Nutrition 0.000 description 2
- 108010070257 neotame Proteins 0.000 description 2
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002292 piperacillin Drugs 0.000 description 2
- WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M piperacillin sodium Chemical compound [Na+].O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C([O-])=O)C(C)(C)S[C@@H]21 WCMIIGXFCMNQDS-IDYPWDAWSA-M 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000010796 biological waste Substances 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FYPVXEILSNEKOO-UHFFFAOYSA-L calcium;butanoate Chemical compound [Ca+2].CCCC([O-])=O.CCCC([O-])=O FYPVXEILSNEKOO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法，本发明选择了丁酸梭菌RD268用于制备丁酸盐，该菌株能有效耐受高浓度产物，杂质（特别是乙酸）积累少、且能够充分利用廉价底物的菌株正成为发酵法生产丁酸及其盐，而且能合成一定的淀粉酶和纤维素酶，可进行一定程度的边糖化边发酵。同时还能够代谢产生一定含量的丁酸菌素，能够有效抑制竞争性的其它菌株，有助于防治发酵染菌，提高产率，在丁酸发酵方面具备良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法。
背景技术
作为短链脂肪酸中的典型代表，丁酸被认为是一种非常有潜力的化学生产原料，可以转化为生物丁醇，也被认为是一种很有前途的特种化学品。全球的年需求量已达到 8万吨以上，年市场规模超过1.5 亿美元。目前，丁酸的生产方式主要有两种：化学合成法和微生物发酵法，其中尤以化学法占绝对主导地位。化学法生产主要依赖正丁醛作为前体，通过氧化法制备，其极度依赖石油化工产品，同时反应条件苛刻，对环境污染严重，不符合现在绿色环保的理念。随着原油供应的减少、对天然产品需求的增加和对环境的日益关注，微生物发酵技术利用可再生生物质生产丁酸已引起许多研究人员的注意，因为生物丁酸可能是最有希望的可持续生物燃料之一，以满足替代化石燃料的绿色能源供应的愿望。此外，大量木质纤维素生物质作为低价值农产品的存在，或有义务妥善处置生物废弃物以摆脱污染困扰，为丁酸发酵创造了有利的商业环境。丁酸发酵生产一直被认为是非常复杂和难以控制的。微生物丁酸发酵过程中不仅受到终产物抑制、预处理抑制作用增强、菌种生长速度慢等多种工艺难题的影响，而且丁酸发酵的生产菌株往往也产生其它类型的酸，这些酸很难分离。总的来说，基质成本高、产丁酸菌株易退化、生产能力有限、浓度低、产量低、产品回收成本高是制约发酵生产丁酸的主要因素。为了改善丁酸的发酵法生产，降低整体生产成本，需要在菌种选育及发酵过程控制参数和优化等方面进行大量工作。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用，丁酸梭菌RD268能够高效合成丁酸和丁酸菌素，具备耐胃酸、胆盐及产酶的优点，该菌株利用发酵法能用于生产丁酸盐；本发明的目的之二在于提供一种生产丁酸盐的方法，步骤简单，适合大规模制备。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用，所述丁酸梭菌为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RD268，已于2023年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 63539。
优选地，所述丁酸梭菌RD268的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，发酵生产丁酸盐的原料为糖蜜。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种生产丁酸盐的方法，包括以下步骤：
1）对所述的丁酸梭菌进行种子培养，得到种子培养液；
2）将种子培养液置于发酵培养基中培养，得到发酵液；其中，发酵培养基中包括糖蜜；
3）将发酵液进行升温，过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩，得到浓缩液；
4）在浓缩液中添加碱溶液进行反应，得到反应液；对反应液进行蒸发浓缩和干燥，得到含有丁酸盐的产品。
优选地，所述步骤1）中，所述种子培养包括以下步骤：
S1菌株活化：先将接种所述肠源性丁酸梭菌的甘油菌至梭菌增菌培养基斜面，进行厌氧培养，得到F1代菌株；将F1代菌株制备菌悬液，转接含有梭菌增菌培养基，进行厌氧培养，得到F2代活化菌株；
S2种子培养：对F2代活化菌株进行摇瓶种子培养，得到摇瓶培养液；
S3种子扩大培养：将摇瓶培养液移接含有种子培养基的种子罐进行摇瓶种子扩大培养，得到所述种子培养液。
优选地，所述种子培养基包括以下按重量百分比计的原料：葡萄糖2~4%、玉米淀粉0.4~0.6%、蛋白胨0.4~0.6%、酵母膏0.8~1.2%、磷酸二氢铵0.2~0.3%、氯化钠0.2~0.4%、轻质碳酸钙0.8~1.2%、硫酸镁0.01~0.03%、硫酸锌0.005~0.015%和硫酸亚铁0.002~0.006%，水补足100wt%；和/或，种子培养基的pH为6.0-6.5。
优选地，所述步骤2）中，将种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，在发酵培养起始阶段，通入惰性气体保持压力为0.02~1Mpa，并进行搅拌；发酵培养1~3h后停止搅拌；在发酵全过程控制发酵液pH值为5.5-6.0，并控制发酵罐中的总糖含量在10-20g/L；发酵的时间为48~72h，直至培养液中的总糖含量为0.1~1.0g/L停止发酵。
优选地，所述发酵培养基包括以下按重量百分比计的原料：糖蜜45~55%、葡萄糖2~4%，酵母膏0.4~0.6%、蛋白胨0.4~0.6%，玉米浆4~6%、玉米淀粉0.5~1.5%、硫酸铵0.05~0.15%、磷酸氢二钾0.1~0.2%和氯化钠0.2~0.4%，由水补足100%；初始pH调节至6.0-6.5。
优选地，所述步骤3）中，将发酵液升温至60~70℃处理0.5~2h，然后采用陶瓷膜过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩，得到浓缩液。
优选地，所述步骤4）中，浓缩液中加入碱溶液，控制温度为40-50℃，待完全反应后，进行蒸发浓缩和喷雾干燥；其中，喷雾塔的入口温度为160~180℃，出口温度为100~110℃，得到含有丁酸盐的产品。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明选择了丁酸梭菌RD268用于制备丁酸盐，该菌株能有效耐受高浓度产物，杂质（特别是乙酸）积累少、且能够充分利用廉价底物的菌株正成为发酵法生产丁酸及其盐。同时，优良菌株的选育也能够为后续利用合成生物学策略建立生产效率更高、鲁棒性更强的丁酸梭菌基盘细胞及可用基因元件奠定基础。
本发明的丁酸盐的生产方法，先对丁酸梭菌RD268进行种子培养，得到种子培养液；再将种子培养液置于发酵培养基中培养，得到发酵液；其中，发酵培养基中包括糖蜜；丁酸梭菌RD268能充分利用糖蜜等廉价底物发酵生成丁酸盐；接着将发酵液进行升温，过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩，得到浓缩液；最后，在浓缩液中添加碱溶液进行反应，得到反应液；对反应液进行蒸发浓缩和干燥，得到含有丁酸盐的产品。利用上述方法制备得到的产品中杂质明显降低，生产效率提高。
本发明提供的丁酸梭菌RD268能够高效利用甘蔗制糖的废弃物——糖蜜，发酵生产高浓度的丁酸，而且能合成一定的淀粉酶和纤维素酶，可进行一定程度的边糖化边发酵。同时还能够代谢产生一定含量的丁酸菌素，能够有效抑制竞争性的其它菌株，有助于防治发酵染菌，提高产率，在丁酸发酵方面具备良好的应用前景。
附图说明
图1为丁酸梭菌特异引物PCR扩增产物电泳结果；其中，M为DL2000 DNA leaderMarker；1-8分别为D01-D08菌落；
图2为 RD268菌株基于16s rDNA序列的系统进化树。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明提供的肠源性益生菌株为丁酸梭菌RD268（Clostridium butyricumRD268），已于2023年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC；地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075），保藏编号为GDMCC No: 63539。丁酸梭菌RD268（Clostridium butyricum RD268）GDMCC No: 63539，简称为丁酸梭菌RD268，或RD268。
本发明提供的丁酸梭菌RD268是通过如下方法分离、选育获得的：取健康哺乳母猪粪便，酸性生理盐水充分混匀、过滤，并将滤液进行高温耐受处理，将处理液采用梯度稀释的方式涂布于含有碳酸钙和丁酸钠的选择性培养基进行厌氧培养，特异性筛选具备一定耐温、耐终产物和产酸能力的菌株，然后挑取菌落形态、大小、色泽以及碳酸钙圈明显有差异的菌株分别点值于含有羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、可溶性淀粉及酪素为底物的平板中进行产酶特性的复筛，挑取具备不同生长速率和底物水解圈能力的丁酸梭菌菌株在含有溴甲酚绿-甲基红培养基的三角瓶中，厌氧静置培养，比较菌浓、产酸能力，并采用琼脂扩散法检测培养液上清液的抑菌性能，分别选取产酸快、生长速率高、产丁酸能力强、抑菌圈较大的作为出发菌株，制备原生质体，并进行亲本灭活，以聚乙二醇（PEG）为促融剂，进行不同特性菌株的多亲本细胞融合与再生，并对长出的融合子进行摇瓶发酵，筛选能够同时高效产生丁酸、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶以及丁酸菌素能力的优良突变菌株RD268，并对优良突变菌株RD268进行分子鉴定、遗传稳定性及药物耐受性的考察，最终获得优良菌株RD268并进行保藏。
所述的健康哺乳母猪粪便是指采食量大、生长、泌乳性能良好，无任何病兆的长白猪种的粪便混合物，样品采集后封装于灭菌的离心管中，并存于冻存盒中，在4小时内带回实验室进行下一步的工作。
所述的生理盐水充分混匀、过滤，并将滤液进行高温处理，指的是取粪便样品5.0g加入至含有灭菌玻璃珠和pH值2.5（0.1mol/L的稀盐酸调制）的50mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分涡旋振荡，纱布过滤，取滤液至新的灭菌三角瓶，20%氢氧化钠调pH值至5.5-6.0后，于80℃水浴处理10min。
所述的梯度稀释，指的是将80℃水浴处理后的滤液采用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，并最终稀释至104。
所述的含有碳酸钙和丁酸钠的选择性培养基，指的是在分离培养基中添加1.0%（w/v）碳酸钙和1.0%（w/v）的丁酸钠。
上述选择性培养基，用于丁酸梭菌的分离培养，其配方组成为：胰蛋白胨17g/L、大豆蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，pH6.5，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20 min。
所述的特异性筛选，指的是通过观察选择性培养基平板中生长菌落周围的溶钙圈大小，特异性选择菌落呈乳白色、较大、溶钙圈清晰且直径大的菌株备进一步的筛选。
所述产酶特性的复筛，指的是将分离获得的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基，37℃厌氧培养24 h，再分别加入0.1%的刚果红或碘溶液，以测定淀粉酶、纤维素酶及蛋白酶的活性，记录底物水解圈直径（H）和菌落直径（C）的比值。
上述的产酶筛选培养基，指的是在梭菌增值培养基（购自于广东环凯微生物科技有限公司，若配置为固体，额外添加2%的琼脂粉）的基础上，分别添加0.5%羧甲基纤维素钠（纤维素酶筛选）、1.0%的可溶性淀粉（淀粉酶筛选）和0.5%的酪素（蛋白酶筛选）进行产酶能力的筛选。
所述的挑取具备不同生长速率和底物水解圈能力的菌株，指的是选取菌落生长速率较快，产酶的种类较多或酶活性较强的菌株。同时，根据丁酸梭菌的16S rDNA序列特征，设计特异的丁酸梭菌鉴定引物，并对这些菌株进行PCR扩增和电泳验证，能够扩增出大约400bp条带的可初步判定为丁酸梭菌。
上述特异的丁酸梭菌鉴定引物选用CB-F和CB-R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体核苷酸序列如（CB-F）SEQ ID NO:2和（CB-R）SEQ ID NO:3所示。上述PCR的反应体系和条件为：Pre-mix Ex Taq( Takara 公司) 12. 5 μL，CB-F引物( 10 μmol /L) 1μL，CB-R引物( 10 μmol /L) 1 μL，不同菌菌落为模板，超纯水10.5 μL。PCR条件: 98 ℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 40 s，55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸 40s，进行30个循环，最后 72℃延伸 10 min，并在4℃保存。PCR反应结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。
所述的在含有溴甲酚绿-甲基红培养基的三角瓶中，厌氧静置培养，指的是对具有不同的性能的菌株，在含有溴甲酚绿-甲基红指示剂的筛选培养基的三角瓶中，37℃厌氧静置培养48h，并在12h之后每隔4h观察培养基颜色变化，进一步筛选生长快、生物量大（OD600nm）、产酸早和产酸高（颜色变化早、且呈淡红色至红色的菌株），备进行复筛。
上述的筛选培养基，包括：梭菌增菌培养基及溴甲酚绿-甲基红溶液0.2%（V/V），121℃高压灭菌20min。
其中，上述溴甲酚绿-甲基红的是按照如下方法进行配制的：准确称取0.1g溴甲酚绿，0.06g甲基红溶于95%乙醇，并用95%乙醇定容至100mL。
所述的采用琼脂扩散法检测培养液上清液的抑菌性能，指的是10000r/min离心2min收集摇瓶培养上清液，再用0.2%氢氧化钠溶液调上清液pH至5.5-6.0左右，排除酸对后续测定的干扰，以金黄色葡萄球菌ATCC25923或大肠杆菌ATCC25922作为指示菌，制备抑菌平板，通过抑菌直径的大小测定上清液对指示菌抑制作用的强弱。
上述抑菌平板，指的是将灭菌的LB固体培养基加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量指示菌悬液（指示菌终浓度为1×106cfu/mL），混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul培养上清液加入点样孔中，4℃静置约1-3h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，测量抑菌圈直径。
上述的LB固体培养基，组成包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，离子水定容至1L，质量分数20%的NaOH溶液调pH至7.0，若配置固体培养基，额外添加2.0%的琼脂粉即可，121℃灭菌20min，备用。
上述的指示菌悬液，指的是通过LB斜面培养指示菌，并采用无菌生理盐水洗脱斜面菌株制备浓度为（1~2）×108CFU/mL的指示菌悬液，然后按照琼脂平板要求的指示菌的终浓度，加入一定量的指示菌悬液。
所述的制备原生质体，指的是将具备不同特性（产酶、产酸、生物量）菌株首先进行斜面活化，然后制备菌体悬液，最后在一定条件下进行酶解破壁，制备原生质体。
上述的斜面活化，制备菌体悬液，指的是将分离获得的菌株转接至梭菌增菌培养基斜面（18×180mm试管斜面），37℃厌氧培养24h，即得活化的菌株斜面，然后用无菌生理盐水将斜面中活化的菌株洗下制备斜面菌株悬液，按照3.3%（V/V）的接种量转接至含有4.5%甘氨酸的梭菌增菌培养基（液体），厌氧静置培养12h，后8000r/min离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水清洗两次，接着用高渗溶液SMM（SMM高渗溶液组成包括：蔗糖0.5mol/L，MgCl2·6H2O 0.02mol/L，顺丁烯二酸 0.02mol/L 蒸馏水配制，pH7.0，121℃，灭菌22min，4℃保存备用）离心、洗涤两次，去上清，最终菌体重悬于5ml的SMM溶液中，获得菌体悬液，菌落数为1.0×107CFU/mL。
上述的一定条件下进行酶解破壁，指的是采用组合酶的形式进行细胞的酶解。具体为：采用溶菌酶和溶壁酶的进行组合消化，取上述菌体悬液分别加入过滤除菌后的酶母液（SMM溶液配制），制备含有酶的菌体悬液，置于摇床，80r/min反应，每隔5min镜检一次，观察原生质体形成情况，当90%左右的细胞转化为原生质体时，2000rpm离心收集细胞，用SMM洗涤离心两次，用适量的SMM重悬。其中溶菌酶最佳酶解浓度为0.1%，溶壁酶最佳酶解浓度为0.05%（购自于广东省微生物研究所），最佳酶解温度为30℃，最佳酶解时间为30min，最终原生质体浓度达到6.6×106个/mL，原生质体形成率达到66.0%，而且原生质体的再生率也最好，达到15.0%。
所述的亲本灭活，指的是采用加热的方式进行原生质体的灭活，原生质体的最佳热灭活条件为：50℃-60℃热灭活处理，时间分别为15-20min，每隔5min 轻轻振荡1 次，使原生质体受热均匀，灭活率达到100%。
所述的细胞融合，指的是在以0.05 mol/L 氯化钙溶液配制的35%聚乙二醇( PEG-6000) 溶液为促融剂，分别取灭活的不同亲本原生质体各1mL，混合并离心，加入1mL促融剂重悬，并在30℃水浴中预热5min 后，再迅速置于35℃水浴摇床中，60转/分钟，振荡融合30min。
所述的再生，是在细胞融合结束之后， 2000转/分，4℃离心10min，弃上清液，再用0.6mol/L KCl 渗稳剂洗涤三次，去除PEG。将得到的原生质体沉淀用0.6mol/L KCl 渗透压稳定剂稳剂稀释至105个/mL浓度，取其稀释液涂布于再生培养基上，置于37℃恒温培养箱中，厌氧培养，长出再生融合菌落。
其中，融合子再生培养基(g/L)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉1.0、蔗糖5.0、蛋白胨10.0、酵母浸粉3.0、牛肉膏10.0、氯化钠 3、醋酸钠3、L-半胱氨酸盐酸盐0.5、琼脂15.0、甘露醇109.3，121℃高压灭菌20min。
所述的融合子摇瓶发酵筛选，指的将原生质体融合后的菌株，接种至发酵培养基中，250mL摇瓶装量150mL，37℃厌氧静置培养48h，发酵结束后，取发酵液5μL分别点植于不同的产酶筛选培养基，筛选同时具备淀粉酶、纤维素酶及/或蛋白酶能力的菌株。另外，同时取发酵液 10.0m L，加入5.0%稀硫酸溶液，调发酵液pH值为2.0，充分摇匀使其完全酸化。再用等体积的色谱纯二氯甲烷进行萃取（v/v=1:1），萃取液用0.22μm滤膜过滤后采用气相色谱检测丁酸含量。选择其中具备多种产酶能力，且积累丁酸最高的融合菌株，编号RD268。
上述的摇瓶发酵培养基包括：豆粕粉2.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖3.0%，糖蜜2.0%，玉米淀粉1.0%，碳酸钙1.5%，硫酸铵0.1，磷酸氢二钾0.15%，初始pH调节至6.0-6.5，121℃高压灭菌15min。
所述丁酸菌素的生产能力，指的是采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能，指的是对分离获得的融合子的摇瓶发酵液，10000转/分离心2min收集发酵上清液，再用10%氢氧化钠溶液调上清液pH至5.5-6.0左右，排除酸对后续测定的干扰，以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为指示菌，通过抑菌圈的大小测定上清液对指示菌的抑制作用强弱，即为丁酸菌素的生产能力。
所述的分子鉴定，指的是以上述分离、筛选到的优良融合菌株RD268的菌落基因组为模板，通用引物27F和1492R为引物对，通过PCR的方式扩增菌株的16S rDNA的部分序列，并将PCR扩增的目标基因序列进行测序和比对分析，确定菌株的分类单元：该菌株经扩增16S rDNA序列，NCBI BLAST比对分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），其亲缘关系最近的为梭菌属（Clostridia ），结合菌株RD268的形态特征，鉴定为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），编号为Clostridium butyricum RD268，简称为丁酸梭菌RD268，或RD268。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。上述的通用引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4（27F）以及SEQ ID NO:5（1492R）所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
所述的遗传稳定性，指的是指将上述丁酸梭菌RD268进行传代培养，每3天传代一次，传代7次，每隔一代进行摇瓶发酵，测量发酵液丁酸含量，考察菌株在传代过程中的稳定性。
所述的药物耐受性的考察，指的是参照美国临床实验标准委员会NCCLS，采用药敏片琼脂扩散法（K-B）进行RD268菌株的抗生素药物敏感性实验。
上述的药敏片琼脂扩散法（K-B），具体方法包括：活化RD268菌株，用无菌PBS缓冲液将新鲜过夜培养的菌液浊度于浊度仪中调整至0.5麦氏浊度（OD625=0.1）的菌悬液，取100 μL菌悬液均匀涂布在梭菌增菌培养基上。选取相应抗生素试纸片（购自于杭州滨和微生物试剂有限公司，抗生素包括：青霉素、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林、羧苄西林、苯唑西林、头孢克肟、头孢唑林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松、丁胺卡那、甲氧苄啶、麦迪霉素、四环素、米诺环素、多粘菌素B、万古霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、复方新诺明、氟苯尼考、氯霉素、链霉素、呋喃唑酮、磷霉素）。将抗生素试纸片置于固体培养基表面，37℃厌氧培养48 h。用观察是否有抑菌圈产生并测量抑菌圈的直径，根据NCCLS标准判读结果。
所述的保藏，指的是将鉴定为丁酸梭菌RD268的菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC；地址：中国广州，广东微生物研究所；邮编：510075），保藏编号为GDMCCNo: 63539。
实施例1：优良融合菌株丁酸梭菌RD268选育与鉴定
1、健康哺乳母猪粪便样品的预处理及菌株分离
在无菌操作台中，取不同时间段的健康哺乳母猪粪便5.0g，加入由0.1mol/L的盐酸调pH至2.5的50mL无菌生理盐水三角瓶中，充分涡旋振荡，纱布过滤，取滤液至新的灭菌三角瓶，并用灭菌的20%氢氧化钠回调pH值至5.5-6.0后，为了能够特异性筛选能够耐受一定温度的菌株，将含有内容物的三角瓶继续在80℃水浴中处理10min。
预处理结束后，将水浴液采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-4，取稀释液涂布于含有1.0%的碳酸钙和1.0%的丁酸钠的选择性培养基平板，37℃厌氧培养48h以上，至有单菌落长出。其中，选择性培养基，用于丁酸梭菌的分离培养，其配方组成为：胰蛋白胨17g/L、大豆蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，pH6.5，琼脂粉20g/L，121 ℃灭菌20 min。
菌株的特异性筛选
（1）选择性初筛
在选择性培养基平板上挑取菌落生长较快，菌落较大、边缘锯齿状呈乳白色，溶钙圈清晰且直径大，革兰氏染色为阳性的菌株共8株，并重复划线于增菌培养基平板，37℃厌氧培养，进行菌株纯化，保存。同时，挑取纯化菌株分别点植于含有不同底物的产酶筛选培养基，37℃厌氧培养24 h，再分别加入0.1%的刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶（CMC）、蛋白酶（PRO）、淀粉酶（AMY）活性，记录菌株酶解圈直径（H）和菌落直径（C）的比值。
其中，产酶筛选培养基是在梭菌增值培养基（购自于广东环凯微生物科技有限公司，若配置为固体，额外添加2%的琼脂粉）的基础上，分别添加0.5%羧甲基纤维素钠（纤维素酶筛选）、1.0%的可溶性淀粉（淀粉酶筛选）和0.5%的酪素（蛋白酶筛选）进行产酶能力的筛选。
根据不同的菌株产酶能力的差异，挑取能够对多种底物形成明显酶解圈的菌，并对它们形成酶解圈直径与菌落直径的比值做产酶能力的初步排序，比值越大，酶活性越强。
如表1所示，D08菌株的淀粉酶（AMY）活性最强，D06菌株不仅具备AMY活性，其纤维素酶（CMC）也是相对最强的，D02菌株则具备最好的蛋白酶（PRO）活性。
值得注意的是，D07菌株虽然给个酶活均不是最好的，但却是唯一具备三种酶活的菌株。
另外，根据NCBI公开的丁酸梭菌的16S rDNA序列特征，设计特异的丁酸梭菌鉴定引物，并对上述8个菌株进行PCR扩增和电泳验证，上述特异的丁酸梭菌鉴定引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体核苷酸序列如（CB-F）SEQ ID NO:2和（CB-R）SEQ IDNO:3所示。
PCR的反应体系和条件为：Pre-mix Ex Taq( Takara 公司) 12. 5 μL，CB-F引物( 10 μmol /L) 1 μL，CB-R引物( 10 μmol /L) 1 μL，不同菌菌落为模板，超纯水10.5 μL。PCR条件: 98 ℃预变性 2 min；95 ℃ 变性 40 s，55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸 40s，进行30个循环，最后 72 ℃延伸 10 min，并在4℃保存。PCR反应结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。
如图1所示，编号D07的菌株未能扩增出目的大小的条带，其余7个菌株均能够扩增出大小约400bp的目的条带。提示D07菌株可能不是丁酸梭菌，其它菌株则为丁酸梭菌。
（2）摇瓶发酵复筛
采用摇瓶发酵的方式对上述7个具备不同产酶能力的丁酸梭菌菌株进行繁殖及产酸能力的验证。分别制备上述7个菌株的斜面菌悬液，按1.0%（v/v）的量接种至含有溴甲酚绿-甲基红指示剂筛选培养基的三角瓶中，37℃厌氧静置培养48h，并在12h之后每隔4h观察培养基颜色变化，根据颜色变化快慢与深浅，快速判断不同菌株的产酸能力。培养结束后，采用10000转/分离心2min收集摇瓶培养上清液，再用0.2%氢氧化钠溶液调上清液pH至5.5-6.0左右，排除酸对后续测定的干扰，以金黄色葡萄球菌ATCC25923或大肠杆菌ATCC25922作为指示菌，琼脂扩散法检测培养液上清液的抑菌性能，通过抑菌圈直径的大小测定上清液对指示菌抑制作用的强弱。另外，取培养液 10.0m L，加入5.0%稀硫酸溶液，调发酵液pH值为2.0，充分摇匀使其完全酸化。再用等体积的色谱纯二氯甲烷进行萃取（v/v=1:1），萃取液用0.22μm滤膜过滤后采用气相色谱检测丁酸含量。
上述的筛选培养基，包括：梭菌增菌培养基及溴甲酚绿-甲基红溶液0.2%（V/V），121℃高压灭菌20min。
其中，上述溴甲酚绿-甲基红的是按照如下方法进行配制的：准确称取0.1g溴甲酚绿，0.06g甲基红溶于95%乙醇，并用95%乙醇定容至100mL。
所述的，琼脂扩散法，指的是将灭菌的LB固体培养基加热后放置室温冷却至45-55℃，加入适量指示菌悬液（指示菌终浓度为1×106cfu/mL），混匀后倒平板，用直径6.0mm无菌打孔器在平板上打孔，移去琼脂块，取50ul培养上清液加入点样孔中，4℃静置约1-3h，后于37℃培养箱中培养24h，取出平板，测量抑菌圈直径。
上述的LB固体培养基，组成包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，离子水定容至1L，质量分数20%的NaOH溶液调pH至7.0，若配置固体培养基，额外添加2.0%的琼脂粉即可，121℃灭菌20min，备用。
上述的指示菌悬液，指的是通过LB斜面培养指示菌，并采用无菌生理盐水洗脱斜面菌株制备浓度为（1~2）×108CFU/mL的指示菌悬液，然后按照琼脂平板要求的指示菌的终浓度，加入一定量的指示菌悬液。
由表2可知，编号D08、D06、D02菌株摇瓶培养时，颜色变化较早，而且在培养20h左右时呈现的红色较深，说明其菌株繁殖及代谢速度较快。不仅如此，发酵结束后，不论是丁酸产量还是抑菌性能，均是这三个菌株表现较好，选择并保存编号为D08、D06和D02的菌株作为出发菌株，备进行后续细胞融合。
融合菌株RD268的选育
（1）出发菌株原生质体的制备与再生
首先，进行出发菌株的活化，并制备菌体悬液。将分离获得的编号为D08、D06和D02的出发菌株，转接至梭菌增菌培养基斜面（18×180mm试管斜面），37℃厌氧培养24h，即得活化的菌株斜面。
然后，采用无菌生理盐水将斜面中活化的菌株洗下制备斜面菌株悬液，按照3.3%（V/V）的接种量转接至含有4.5%甘氨酸的梭菌增菌培养基（液体），厌氧静置培养12h，后8000r/min离心5min收集菌体，并用无菌生理盐水清洗两次，接着用高渗溶液SMM（SMM高渗溶液组成包括：蔗糖0.5mol/L，MgCl2·6H2O 0.02mol/L，顺丁烯二酸 0.02mol/L 蒸馏水配制，pH7.0，121℃，灭菌22min，4℃保存备用）离心、洗涤两次，去上清，最终菌体重悬于5ml的SMM溶液中，获得菌体悬液，菌落数为1.0×107CFU/mL。
接着，采用组合酶的形式进行出发菌株的酶解。具体为：采用溶菌酶和溶壁酶的进行组合消化，取上述菌体悬液分别加入过滤除菌后的酶母液（SMM溶液配制），制备含有酶的菌体悬液，置于摇床，80r/min反应，每隔5min镜检一次，观察原生质体形成情况，当90%左右的细胞转化为原生质体时，2000rpm离心收集细胞，用SMM洗涤离心两次，用适量的SMM重悬。其中溶菌酶最佳酶解浓度为0.1%，溶壁酶最佳酶解浓度为0.05%（购自于广东省微生物研究所），最佳酶解温度为30℃，最佳酶解时间为30min，最终原生质体浓度达到6.6×106 个/mL，原生质体形成率达到66.0%，而且原生质体的再生率也最好，达到15.0%，此即为制备好的亲本原生质体。
（2）原生质体的灭活与多亲本融合
首先，进行原生质体的灭活，主要是为了便于后续融合子的互补筛选。原生质体融合目的是将亲本的遗传物质进行转化和互补，从而获得兼具亲本优良性状的新菌株。采用加热的方式进行亲本原生质体的灭活，原生质体的最佳热灭活条件为：50℃-60℃热灭活处理，时间分别为15-20min，每隔5min 轻轻振荡1 次，使原生质体受热均匀，灭活率达到100%。
然后，进行灭活后的多亲本融合，以0.05 mol/L 氯化钙溶液配制的35%聚乙二醇( PEG-6000) 溶液为促融剂，分别取灭活的不同亲本原生质体各1mL，混合并离心，加入1mL促融剂重悬，并在30℃水浴中预热5min 后，再迅速置于35℃水浴摇床中，60转/分钟，振荡融合30min。
最后，进行融合细胞的再生。细胞融合结束之后，2000转/分，4℃离心10min，弃上清液，再用0.6mol/L KCl 渗稳剂洗涤三次，去除PEG。将得到的原生质体沉淀用0.6mol/LKCl 渗透压稳定剂稳剂稀释至105个/mL浓度，取其稀释液涂布于再生培养基上，置于37℃恒温培养箱中，厌氧培养，长出再生融合菌落。
其中，融合子再生培养基(g/L)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉1.0、蔗糖5.0、蛋白胨10.0、酵母浸粉3.0、牛肉膏10.0、氯化钠 3、醋酸钠3、L-半胱氨酸盐酸盐0.5、琼脂15.0、甘露醇109.3，121℃高压灭菌20min。
（3）融合子的筛选
将上述再生平板上的生长快速的融合菌株转接种到梭菌增菌培养基斜面（18×180mm试管斜面），37℃，厌氧培养48天，进行融合菌株的进一步活化。
活化后的融合菌株制备种子悬液（每个试管斜面加入5mL无菌生理盐水，洗脱即为种子悬液），接种至发酵培养基中，250mL摇瓶装量150mL，种子悬液添加量5mL，37℃厌氧静置培养48h，发酵结束后，取发酵液5μL分别点植于不同的产酶筛选培养基，筛选同时具备淀粉酶、纤维素酶及/或蛋白酶能力的菌株。另外，同时取发酵液 10.0m L，加入5.0%稀硫酸溶液，调发酵液pH值为2.0，充分摇匀使其完全酸化。再用等体积的色谱纯二氯甲烷进行萃取（v/v=1:1），萃取液用0.22μm滤膜过滤后采用气相色谱检测丁酸含量。选择其中具备多种产酶能力，且积累丁酸最高的融合菌株，编号RD268。
其中，摇瓶发酵培养基包括：豆粕粉2.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖3.0%，糖蜜2.0%，玉米淀粉1.0%，碳酸钙1.5%，硫酸铵0.1，磷酸氢二钾0.15%，初始pH调节至6.0-6.5，121℃高压灭菌15min。
其中，丁酸菌素的生产能力，指的是采用琼脂扩散法检测摇瓶发酵上清液的抑菌性能，指的是对分离获得的融合子的摇瓶发酵液，10000转/分离心2min收集发酵上清液，再用10%氢氧化钠溶液调上清液pH至5.5-6.0左右，排除酸对后续测定的干扰，以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为指示菌，通过抑菌圈的大小测定上清液对指示菌的抑制作用强弱，即为丁酸菌素的生产能力。
结果显示：30个融合子（即30株融合菌株），仅有1个融合菌株表现同时出了淀粉酶（AMY）、纤维素酶（CMC）和蛋白酶的活性，其中淀粉酶（AMY）的活性较其出发亲本D08（AMY活性最好的亲本）要高30%，纤维素酶（CMC）的活性较其出发亲本D06（CMC活性最好的亲本）要高约15%，蛋白酶（PRO）的活性较其出发亲本D02（PRO活性最好的亲本）要高约12%，而其丁酸含量达到6.5g/L，较同样条件下的产丁酸最高亲本菌株提高36%，说明该菌株融合了三个亲本菌株的优良属性，具备较好的特性，将该菌株重新编号为：RD268，并进行斜面保存及甘油保种。
4、RD268菌株的分子鉴定及保藏
以上述分离、筛选到的优良融合菌株RD268的菌落为模板，通用引物27F和1492R为引物对，通过PCR的方式扩增菌株的16S rDNA的部分序列，并将PCR扩增的目标基因序列进行测序和比对分析，确定菌株的分类单元：该菌株经扩增16S rDNA序列，NCBI BLAST比对分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），由图2可知，其亲缘关系最近的为梭菌属（Clostridia ），结合菌株RD268的形态特征，鉴定为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），编号为Clostridium butyricum RD268，简称为丁酸梭菌RD268，或RD268。其中，通用引物27F和1492R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
5、RD268的遗传稳定性
将丁酸梭菌RD268进行传代培养，每3天传代一次，传代7次，每隔一代进行摇瓶发酵，测量发酵液丁酸含量，考察菌株在传代过程中的稳定性。
结果显示：RD268传代过程中培养液的丁酸含量均无明显变化，显示良好的遗传稳定性。
6、融合菌株RD268的药物耐受性考察
参照美国临床实验标准委员会NCCLS，采用药敏片琼脂扩散法（K-B）进行RD268菌株的抗生素药物敏感性实验。具体方法包括：活化RD268菌株，用无菌PBS缓冲液将新鲜过夜培养的菌液浊度于浊度仪中调整至0.5麦氏浊度（OD625=0.1）的菌悬液，取100 μL菌悬液均匀涂布在梭菌增菌培养基上。选取相应抗生素试纸片（购自于杭州滨和微生物试剂有限公司，抗生素包括：青霉素、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林、羧苄西林、苯唑西林、头孢克肟、头孢唑林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松、丁胺卡那、甲氧苄啶、麦迪霉素、四环素、米诺环素、多粘菌素B、万古霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、复方新诺明、氟苯尼考、氯霉素、链霉素、呋喃唑酮、磷霉素）。将抗生素试纸片置于固体培养基表面，37℃厌氧培养48 h。用观察是否有抑菌圈产生并测量抑菌圈的直径，根据NCCLS标准判读结果。
/>
/>
由表3可知，融合菌株RD268对多数抗生素敏感，对链霉素、多粘菌素B、丁胺卡那、头孢克肟、头孢氨苄、敏感，对苯唑西林、头孢曲松、米诺环素中度敏感。说明融合菌株RD268不可与多种抗生素合用，具备非常好的生物安全性，抗生素耐药性传播风险小。
实施例2、丁酸梭菌RD268的发酵制备丁酸盐的应用
丁酸梭菌作为应用最为广泛的丁酸发酵生产菌株，其厌氧发酵过程中往往不仅产生丁酸，还包括乙酸、乳酸、己酸等等，不同来源的菌株、不同的原料都对其有机酸的组成带来影响。本发明提供的融合菌株RD268能够高效利用甘蔗制糖的废弃物——糖蜜，发酵生产高浓度的丁酸，而且能合成一定的淀粉酶和纤维素酶，可进行一定程度的边糖化边发酵。同时还能够代谢产生一定含量的丁酸菌素，能够有效抑制竞争性的其它菌株，有助于防治发酵染菌，提高产率，在丁酸发酵方面具备良好的应用前景。
1、种子培养
（1）菌株活化
首先，接种丁酸梭菌RD268甘油菌至梭菌增菌培养基斜面（18×180mm），厌氧培养箱中37℃培养24h，此即为F1代。
然后，再用5ml无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有梭菌增菌培养基的茄瓶培养基，于厌氧培养箱中37℃培养16h，此即为F2代活化菌株。
（2）摇瓶种子培养
将活化培养的茄瓶菌种，加入20ml无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有2000mL的梭菌增菌培养基的的5L的摇瓶中，于37℃厌氧静置培养12h，进一步提高菌落总数，同时强化菌株活力。
（3）种子扩大培养
采用种子罐进行摇瓶种子的扩大培养，种子摇瓶按接种量10%移接含有种子培养基的种子罐，控制工艺如下：培养基灭菌后冲入高纯氮气保持罐压0.02-0.04Mpa，罐温：37℃，初搅拌： 100r/min，pH自然下降，培养3h，然后停止搅拌，其本身能够产生氢气、挥发性有机酸及二氧化碳等保持罐体正压，并通过流加10%的饱和氢氧化钙溶液维持培养液的pH在6.0-6.5，培养周期12h，移种标准为活菌数≥5×107cfu/mL。
上述的种子培养基包括：葡萄糖3.0%，玉米淀粉0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%，磷酸二氢铵0.25%，氯化钠0.3%，轻质碳酸钙1.0%，硫酸镁0.02%，硫酸锌0.01%，硫酸亚铁0.005%。调初始pH值为6.0-6.5, 121℃高压灭菌20min。
2、发酵培养
将种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，移种量为20-30%。在发酵培养起始阶段，通入高纯氮气保持罐压在0.02Mpa以上，并控制初搅拌100-150转/分，主要是为了尽量排出罐体内的空气，温度控制在37℃，发酵培养2h后停止搅拌。发酵全过程通过流加20%的氢氧化钠溶液控制发酵液pH值为5.5-6.0，并通过流加葡萄糖（70%）溶液，维持发酵罐中的总糖含量在10-20g/L。直至发酵60h，停止发酵，发酵结束时培养液中的总糖含量小于1.0g/L。
上述发酵培养基组成包括：糖蜜50.0%，葡萄糖3.0%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，玉米浆5.0%，玉米淀粉1.0%，硫酸铵0.1%，磷酸氢二钾0.15%，氯化钠0.3%，初始pH调节至6.0-6.5，121℃高压灭菌15min。
4、发酵液预处理
发酵结束后，60-70℃加热处理1h，然后进行陶瓷膜过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩。
5、丁酸盐的制备
浓缩液中流加20%的氢氧化钠溶液，控制温度40-50℃，待完全反应后，进行蒸发浓缩和喷雾干燥，喷雾塔的入口温度为170℃，出口温度为105℃。即得到含有丁酸盐（以丁酸钙和丁酸钠计）的产品。
结果显示：同样条件下，融合菌株RD268制备的丁酸盐含量达到20%以上，而且乙酸盐（以乙酸钠和乙酸钙计）小于0.5%，未检测到己酸盐。而出发菌株D08的丁酸盐仅为13.5%，同时乙酸盐含量达到3.1%；D06仅为丁酸盐为10.3%，乙酸盐含量为2.2%，己酸盐含量为0.3%；D02仅丁酸盐为9.5%，己酸盐为1.1%。融合菌株RD268具备更好丁酸形成能力，体现了非常好的发酵制备丁酸盐的能力。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RD268，已于2023年6月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 63539，所述丁酸梭菌RD268的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用，其特征在于，发酵生产丁酸盐的原料为糖蜜。
3.一种生产丁酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对权利要求1~2任一项所述的丁酸梭菌进行种子培养，得到种子培养液；
2）将种子培养液置于发酵培养基中培养，得到发酵液；其中，发酵培养基中包括糖蜜；
3）将发酵液进行升温，过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩，得到浓缩液；
4）在浓缩液中添加碱溶液进行反应，得到反应液；对反应液进行蒸发浓缩和干燥，得到含有丁酸盐的产品。
4.如权利要求3所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述种子培养包括以下步骤：
S1菌株活化：先将接种肠源性丁酸梭菌的甘油菌至梭菌增菌培养基斜面，进行厌氧培养，得到F1代菌株；将F1代菌株制备菌悬液，转接含有梭菌增菌培养基，进行厌氧培养，得到F2代活化菌株；
S2种子培养：对F2代活化菌株进行摇瓶种子培养，得到摇瓶培养液；
S3种子扩大培养：将摇瓶培养液移接含有种子培养基的种子罐进行摇瓶种子扩大培养，得到所述种子培养液。
5.如权利要求4所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下按重量百分比计的原料：葡萄糖2~4%、玉米淀粉0.4~0.6%、蛋白胨0.4~0.6%、酵母膏0.8~1.2%、磷酸二氢铵0.2~0.3%、氯化钠0.2~0.4%、轻质碳酸钙0.8~1.2%、硫酸镁0.01~0.03%、硫酸锌0.005~0.015%和硫酸亚铁0.002~0.006%，水补足100wt%；和/或，种子培养基的pH为6.0-6.5。
6.如权利要求3所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述步骤2）中，将种子培养液移种至装有发酵培养基的发酵罐，在发酵培养起始阶段，通入惰性气体保持压力为0.02~1Mpa，并进行搅拌；发酵培养1~3h后停止搅拌；在发酵全过程控制发酵液pH值为5.5-6.0，并控制发酵罐中的总糖含量在10-20g/L；发酵的时间为48~72h，直至培养液中的总糖含量为0.1~1.0g/L停止发酵。
7.如权利要求3或6所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下按重量百分比计的原料：糖蜜45~55%、葡萄糖2~4%，酵母膏0.4~0.6%、蛋白胨0.4~0.6%，玉米浆4~6%、玉米淀粉0.5~1.5%、硫酸铵0.05~0.15%、磷酸氢二钾0.1~0.2%和氯化钠0.2~0.4%，由水补足100%；初始pH调节至6.0-6.5。
8.如权利要求3所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述步骤3）中，将发酵液升温至60~70℃处理0.5~2h，然后采用陶瓷膜过滤去除菌体，并进行纳滤浓缩，得到浓缩液。
9.如权利要求3所述的生产丁酸盐的方法，其特征在于，所述步骤4）中，浓缩液中加入碱溶液，控制温度为40-50℃，待完全反应后，进行蒸发浓缩和喷雾干燥；其中，喷雾塔的入口温度为160~180℃，出口温度为100~110℃，得到含有丁酸盐的产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311601752.9A CN117305381B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311601752.9A CN117305381B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117305381A CN117305381A (zh) | 2023-12-29 |
| CN117305381B true CN117305381B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=89288766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311601752.9A Active CN117305381B (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117305381B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234664A (zh) * | 2010-04-20 | 2011-11-09 | 新奥（厦门）农牧发展有限公司 | 发酵丁酸梭菌与丁酸盐的复合物及其制法和在饲料添加剂中的应用 |
| CN110218676A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-10 | 华南理工大学 | 一种丁酸梭菌及其应用 |
| CN114806975A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-07-29 | 广东容大生物股份有限公司 | 一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用 |
| WO2023163318A1 (ko) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | (주) 바이노텍 | 단쇄 지방산을 포함하는 발효 생성물 및 그의 과체중 개선, 예방 또는 치료 용도 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108060182A (zh) * | 2016-11-08 | 2018-05-22 | 鼎唐能源科技股份有限公司 | 制备含有丁酸及／或丁酸盐的饲料原料的方法 |
-
2023
- 2023-11-28 CN CN202311601752.9A patent/CN117305381B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234664A (zh) * | 2010-04-20 | 2011-11-09 | 新奥（厦门）农牧发展有限公司 | 发酵丁酸梭菌与丁酸盐的复合物及其制法和在饲料添加剂中的应用 |
| CN110218676A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-10 | 华南理工大学 | 一种丁酸梭菌及其应用 |
| WO2023163318A1 (ko) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | (주) 바이노텍 | 단쇄 지방산을 포함하는 발효 생성물 및 그의 과체중 개선, 예방 또는 치료 용도 |
| CN114806975A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-07-29 | 广东容大生物股份有限公司 | 一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Butyrate-producing human gut symbiont, Clostridium butyricum, and its role in health and disease;Magdalena K. Stoeva等;Gut Microbes;第13卷(第1期);第1-28页 * |
| 丁酸及丁酸盐在肉鸡生产中的应用;安沙等;中国家禽;第40卷(第18期);第45-48页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117305381A (zh) | 2023-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115873754A (zh) | 一株肠源凝结魏茨曼氏菌rs804及其应用 | |
| US20120315678A1 (en) | Microalga highly accumulating starch, a method for producing glucose using the same, and a method for producing a target substance | |
| CN110241043B (zh) | 一株高温发酵生产乳酸的菌株及生产乳酸的方法 | |
| CN102321682A (zh) | 一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法 | |
| CN103642854B (zh) | 谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法 | |
| CN114686407A (zh) | 一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法 | |
| CN108251476B (zh) | 从酶制剂废水中提取维生素b12的方法 | |
| US8148133B2 (en) | Fossil fuel-free process of lignocellulosic pretreatment with biological hydrogen production | |
| CN116716231B (zh) | 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产色氨酸中的应用 | |
| CN116731933B (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用 | |
| CN117305381B (zh) | 一种丁酸梭菌在发酵生产丁酸盐中的应用及生产丁酸盐的方法 | |
| CN109266578B (zh) | 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用 | |
| CN109136313B (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法 | |
| CN109136314B (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法 | |
| CN111748480A (zh) | 一种维斯假丝酵母及其应用 | |
| CN110004081B (zh) | 一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用 | |
| CN110184228B (zh) | 一种玉米秸秆厌氧干发酵菌剂及沼液回流增产甲烷的方法 | |
| CN116064239A (zh) | 一株富含油脂的微芒藻及其培养应用 | |
| CN208182976U (zh) | 一种差位双螺旋搅拌一体化固体发酵装置 | |
| CN117286079B (zh) | 一种肠源性凝结魏茨曼氏菌及其应用、包括该菌株的饲用微生态制剂及其制备方法 | |
| CN117286044A (zh) | 一株肠源凝结魏茨曼氏菌rs711及其应用 | |
| CN117625469A (zh) | 一种肠源性丁酸梭菌及其应用、包括该菌株的饲用微生态制剂及其制备方法 | |
| CN116355814B (zh) | 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-精氨酸中的应用 | |
| CN116590202B (zh) | 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-亮氨酸中的应用 | |
| CN116590203B (zh) | 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-异亮氨酸中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |