CN103642854B - 谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为生产菌株，好氧富集菌株的同时固定菌株。当菌体生长至对数期末期后，将种子培养基倒掉，加入发酵培养基厌氧发酵生产丁二酸，厌氧发酵过程中利用的CO2以Na2CO3和CO2的形式提供。厌氧发酵至葡萄糖含量小于5g/L时，换成新鲜发酵培养基培养。以此方法，可实现至少15批丁二酸的固定化发酵。通过本发明的方法，在不增加设备投入和节省能耗的前提下，菌株固定化后，可反复批次发酵产生丁二酸，节省了种子培养的时间，提高了发酵效率，节省了成本，为丁二酸的工业化生产提供了新的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸能作为合成许多通用化学品的基础原料，比如1,4-丁二醇、己二酸、四氢呋喃和一些可生物降解的聚合物，比如聚丁烯丁二酸和聚丁烯丁二酸己二酸酯。目前主要利用矿物燃料通过化学合成方法生产丁二酸，这种方法的环境成本很高，尤其是CO2的排放量很大。在矿物燃料的价格猛涨和环境意识增强的情况下，用生物过程合成丁二酸会变得更加经济和可行。
丁二酸是一些厌氧菌和兼性厌氧菌厌氧发酵时的终产物。发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在丁二酸厌氧螺菌，丁二酸放线杆菌以及大肠杆菌等。
为了让生物合成丁二酸可行和经济，必须培养更多既能高产丁二酸又能耐受高浓度的丁二酸同时能够利用简单的培养基的菌株，因为微生物的生长对氨基酸和复杂营养物质的需求会阻碍丁二酸的回复。为了达到这一目的，对上述产丁二酸微生物的改进或者利用其它微生物发展新的生物公艺是不可避免的。
谷氨酸棒状杆菌是一种生长迅速、不运动的革兰氏阳性菌，它在微生物发酵产氨基酸和核酸的工艺中有很长的历史。许多谷氨酸棒杆菌的基因组序列已经被公布。在厌氧条件下，谷氨酸棒杆菌的细胞生长被抑制，但是该细胞依然能够代谢糖类产有机酸，比如L-乳酸，丁二酸和乙酸。
Shohei Okino等人用发酵罐，蠕动泵和陶瓷过滤器组成细胞循环反应器。这个过程需要添加一个陶瓷过滤器组件，准备过程相对复杂。
最近，一种将细胞固定在纤维基质表面的生物膜反应器具有比表面积高，孔隙率高，成本低，稳定性强和吸附效果良好的特点，已成功地用于生产多种有机酸，如乳酸、丁酸、正丁醇和霉酚酸。此外，生物膜反应器可以为细胞提供对剪切应力的抵抗力，还能不断更新细胞群。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸；
其中，在好氧富集的种子培养基中添加40-60g/L的固定化材料，菌株在好氧富集阶段即开始边生长边固定，待菌体生长至对数期末期，将种子培养基过滤倒掉，保留固定化材料，加入发酵培养基生产丁二酸，厌氧发酵至葡萄糖含量小于5g/L时，将厌氧培养基过滤倒掉，保留固定化材料，然后加入新的发酵培养基，进行反复批次发酵。
其中，所述的固定化材料为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合。
其中，所述的种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/L，KH2PO4 5-10g/L，K2HPO4·3H2O10-20g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5g/L，FeSO4·H2O 0.1-0.5g/L，尿素20-30g/L，生物素100-300μg/100ml，维生素B1100-300μg/100ml，初始pH7.5。
其中，好氧富集培养过程采用摇瓶培养时，培养温度为30-35℃，培养时间为12-24h，转速为200rpm；好氧富集培养过程采用发酵罐培养时，培养温度为30-35℃，通气量为1-2vvm，培养时间为12-24h，转速为350rpm，发酵罐通气搅拌的溶氧范围控制在30%-60%，优选为45%。
其中，好氧富集培养过程采用摇瓶培养时，将固定化材料平铺在摇瓶底部，培养基装液量能将固定化材料浸没；好氧富集培养过程采用发酵罐培养时，将固定化材料固定在挡板内侧。
其中，发酵培养基的组分为：葡萄糖30-60g/L，Na2CO3 30-60g/L，NaCl 9g/L，初始pH7.5。
其中，厌氧发酵培养过程采用摇瓶培养时，培养温度为30-35℃，培养时间为30-50h，转速为150rpm；厌氧发酵培养过程采用发酵罐培养时，培养温度为30-35℃，CO2通气量为0.2-0.5vvm，培养时间为30-50h，转速为200rpm，发酵罐通气搅拌的溶氧范围控制在10%-20%，优选为15%。
其中，在厌氧发酵培养过程中通过添加6M NH3·H2O将pH值控制在7-8。
在本发明之前，生物膜反应器从未被使用在以谷氨酸棒杆菌生产丁二酸的研究中。申请人首先在摇瓶中尝试谷氨酸棒杆菌的固定化，发现固定化的菌株的生长速率及葡萄糖消耗速率高于游离培养的菌株，同时发现从零时刻开始固定的效果好于从对数生长期中期开始固定的菌株。
目前谷氨酸棒杆菌产丁二酸的研究中在厌氧阶段大多使用NaHCO3作为中和剂，但是NaHCO3存在热稳定性差、不能灭菌、溶解度小的缺点，使得实验过程费力且容易染菌。申请人对几种中和剂（NaHCO3、KHCO3、Na2CO3、CaCO3、碱式碳酸镁）进行对比实验，发现使用Na2CO3时葡萄糖的消耗速率甚至高于NaHCO3，且丁二酸产率高。Na2CO3热稳定性较强，可以经受121℃高温灭菌。
以Na2CO3作为中和剂在摇瓶及7.5L发酵罐中进行反复批次发酵实验时，谷氨酸棒杆菌菌体能保持较长时间的活性以及较高的丁二酸产率。
当菌株的生产能下降时，可以将发酵培养基过滤倒掉之后，再重新加入种子培养基先进行好氧富集，再进行多批次厌氧发酵生产丁二酸。
本发明的有益效果：
1.本发明发明了一种谷氨酸棒杆菌固定化发酵产丁二酸的方法，利用纤维（棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆）作为固定化材料，固定的菌体可以反复利用。能够进行反复批次发酵。
2.本发明筛选了一种高效且操作简便的中和剂Na2CO3用于厌氧发酵产丁二酸。Na2CO3热稳定性强，可以经受121℃高温灭菌。分批发酵时丁二酸产量可达30-40g/L，对葡萄糖的质量收率可达75-85%。与传统利用的NaHCO3相比菌体产酸能力稳定且不易染菌。
3.本发明采用的方法，能够以较高的葡萄糖消耗速率产丁二酸，且副产物乳酸、乙酸的产量很低。在发酵罐中进行反复批次发酵时，丁二酸产量可达30-40g/L，对葡萄糖的质量收率可维持在75%以上。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例使用的分析方法如下：
发酵液中的产物丁二酸、乙酸、乳酸、丙酮酸采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定，色谱柱为Sepax HP-C18柱(4.6*250mm,5μm)，流动相：含1%乙腈的500mM磷酸二氢钾溶液，pH以磷酸调至3.0，柱温：35℃，检测波长：210nm，流速：0.8mL·min-1，进样量：10μL。
葡萄糖含量用SBA分析仪测定(model SBA-40C,Jinan,China)。
实施例1：
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，其余为水。
种子培养基：葡萄糖12g/L，KH2PO4 5g/L，K2HPO4·3H2O 15g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，MnSO4·H2O 0.2g/L，FeSO4·H2O 0.2g/L，尿素25g/L，生物素100μg/100ml，维生素B1200μg/100ml，其余为水，初始pH7.5。
发酵培养基：葡萄糖38g/L，NaHCO3 35g/L，NaCl 9g/L，其余为水，初始pH7.5。
使用LB培养基活化甘油管保存的菌株ATCC13032，与培养箱中30℃培养24h后二次活化12h。用接种环各刮一大环菌于三种培养条件（游离、零时刻添加40g/L的纤维、8h添加40g/L的纤维）的1L摇瓶中，种子培养基装液量为150ml。瓶口以八层纱布扎口好氧培养。种子培养12h后，游离的种子经4000rpm,10min离心获取细胞后将菌体加入发酵培养基中。固定化的菌体皆将培养基倒掉后用镊子轻柔押挤尽量除去培养基，之后倒入发酵培养基。发酵培养基装液量为150ml。瓶口以保鲜膜、八层纱布及牛皮纸扎口以形成厌氧环境，每次取样时通CO2以除去空气。
游离培养、零时刻固定以及8h固定（对数生长期中期）的种子生长时初糖浓度均为12g/L，葡萄糖的消耗速率分别为0.625，0.833，0.667g/h，发酵培养基初糖浓度均为38g/L，丁二酸的产量分别为16.33，28.61，23.44g/L。可以看出零时刻固定的菌体葡萄糖消耗速率最快，且丁二酸产率最高。
实施例2：
LB培养基、种子培养基及发酵培养基的配方同实施例1，其中种子初糖提高到20g/L。种子按照零时刻固定的方法培养。分别添加相同质量的纤维材料用作菌体固定化，按照实施例1的方法进行分批发酵。
表1 用不同固定化材料进行分批发酵谷氨酸棒杆菌产丁二酸
从表1中可以看出，以棉纤维织物固定的效果最好。
实施例3：
LB培养基、种子培养基及发酵培养基的配方同实施例1。种子按照零时刻固定的方法培养。厌氧发酵时使用棉纤维织物作为固定化材料。厌氧发酵46h后，葡萄糖的浓度低于5g/L。丁二酸浓度达到33.74g/L，质量收率达到77.8%（g丁二酸/g葡萄糖）。将厌氧培养基倒掉后用镊子轻柔挤压尽量除去培养基，然后加入新的发酵培养基。进行第二批发酵。同样以葡萄糖的浓度判断发酵终点。在第三批时，通过HPLC测定发现乳酸含量异常，乳酸浓度达到29.2g/L，通过镜检发现染菌了。分析原因应该是由于NaHCO3无法灭菌且溶解度小，配成溶液过膜加入时对体系体积影响大且操作过程中易染菌。这一现象要求我们寻找能够有效替代NaHCO3的中和剂。
实施例4：
LB培养基、种子培养基的配方同实施例1。发酵培养基：葡萄糖36g/L，Na2CO333.6g/L，NaCl 9g/L，其余为水，初始pH7.5。
种子培养方法同实施例2。厌氧发酵36h时测得葡萄糖含量小于5g/L。按照实施例2的方法加入新的发酵培养基。发酵4批，初糖浓度均在35-50g/L范围内，丁二酸的产量分别为33.6，31.37，32.08，31.6g/L，丁二酸对葡萄糖的质量收率分别为76.25，70.05，69.02，68.57%。可以看出，随着发酵时间的延长，发酵时间有所延长（以葡萄糖含量小于5g/L为标准），丁二酸质量收率有所下降。
对比例1：
与实施例3的方法相同，所不同的是发酵培养基分别使用相应摩尔含量的KHCO3、CaCO3、碱式碳酸镁作为中和剂。KHCO3和CaCO3的含量分别为40g/L。所用碱式碳酸镁的分子式为C4H2Mg5O14·5H2O，分子量为485.8，含有4个C，按照摩尔含量相同算得的添加量为45g/L。KHCO3也无法经受121℃高温灭菌，所以在反复批次发酵时也会染菌。CaCO3会板结在纤维上阻碍细胞和气体的接触，发酵73h丁二酸产量只有4.8g/L。碱式碳酸镁因其粉末细且轻，也容易粘在纤维上，发酵34h丁二酸产量只有5.7g/L。
实施例5：
LB培养基、种子培养基及发酵培养基的配方同实施例3。第一批厌氧发酵结束后，倒掉发酵培养基，重新加入种子培养基，好氧培养12h后，再进行厌氧发酵。以此进行反复批次发酵。此方法下谷氨酸棒杆菌菌体能更长时间的保持产酸活性，丁二酸质量收率能保持在一定水平。进行10批发酵实验，丁二酸的产量为32-34g/L，丁二酸对葡萄糖的质量收率分别为70-75%。进行10批质量收率仍能保持在70%左右，稳定性得到提高。
实施例6：
LB培养基、种子培养基及发酵培养基的配方同实施例3。在7.5L发酵罐中进行培养。将纤维固定在挡板内侧。种子培养温度为30-32℃，通气量为1-2vvm，转速为350rpm，接种量为5-10%，培养过程不控pH。培养12-16h后，利用蠕动泵将种子培养基排出。将灭菌后的发酵培养基从发酵罐加料口加入。厌氧发酵培养温度为30-32℃，CO2通气量为1-2vvm，转速为200rpm，培养过程添加6M NH3·H2O将pH控制在7-8。
进行15批发酵实验，丁二酸的产量为34-36g/L，丁二酸对葡萄糖的质量收率为75-85%。丁二酸对葡萄糖的质量收率能保持在75%以上。丁二酸产量和对葡萄糖的质量收率相比摇瓶实验都有略微提高。
对比例2：
LB培养基、种子培养基及发酵培养基的配方同实施例6。在7.5L发酵罐中进行培养，外接1.7L不锈钢柱。将棉纤维织物固定在不锈钢柱中，通过硅胶管将发酵罐与不锈钢柱连接。在接种前通过蠕动泵将种子培养基打入不锈钢柱。种子培养条件同实施例6。培养12-16h后，利用蠕动泵将种子培养基排出。将灭菌后的发酵培养基从发酵罐加料口加入。再次通过蠕动泵将发酵培养基打入不锈钢柱。厌氧培养条件同实施例6。种子、发酵培养基葡萄糖初始含量同实施例6，但是种子培养基葡萄糖消耗速率只有0.1-0.3g/L/h，厌氧发酵丁二酸产量只有5-10g/L。外置固定效果远比内置固定效果差。
Claims (7)
1.谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸；
其中，在好氧富集的种子培养基中添加40-60g/L的固定化材料，菌株在好氧富集阶段即开始边生长边固定，待菌体生长至对数期末期，将种子培养基过滤倒掉，保留固定化材料，加入发酵培养基生产丁二酸，厌氧发酵至葡萄糖含量小于5g/L时，将厌氧培养基过滤倒掉，保留固定化材料，然后加入新的发酵培养基，进行反复批次发酵；
发酵培养基的组分为：葡萄糖30-60g/L，Na2CO330-60g/L，NaCl 9g/L，初始pH7.5。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，所述的固定化材料为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，所述的种子培养基组分为：葡萄糖10-30g/L，KH2PO45-10g/L，K2HPO4·3H2O10-20g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5g/L，FeSO4·H2O 0.1-0.5g/L，尿素20-30g/L，生物素100-300μg/100ml，维生素B1100-300μg/100ml，初始pH7.5。
4.根据权利要求1或2或3所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，好氧富集培养过程采用摇瓶培养时，培养温度为30-35℃，培养时间为12-24h，转速为200rpm；好氧富集培养过程采用发酵罐培养时，培养温度为30-35℃，通气量为1-2vvm，培养时间为12-24h，转速为350rpm。
5.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，好氧富集培养过程采用摇瓶培养时，将固定化材料平铺在摇瓶底部，培养基装液量能将固定化材料浸没；好氧富集培养过程采用发酵罐培养时，将固定化材料固定在挡板内侧。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，厌氧发酵培养过程采用摇瓶培养时，培养温度为30-35℃，培养时间为30-50h，转速为150rpm；厌氧发酵培养过程采用发酵罐培养时，培养温度为30-35℃，CO2通气量为0.2-0.5vvm，培养时间为30-50h，转速为200rpm。
7.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌固定化反复批次发酵产丁二酸的方法，其特征在于，在厌氧发酵培养过程中通过添加6M NH3·H2O将pH值控制在7-8。
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