CN102146422A - 一种丁二酸的发酵生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸，在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。利用本发明的方法，最终回收有机酸时，避免大量金属离子的污染处理问题，同时可以回收利用NH4Cl，或者由于废液成分简单，可以制成氮肥，用于农业生产，从而在产品处理上节约成本，同时降低环境污染。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及丁二酸的发酵生产工艺。
背景技术
丁二酸又称琥珀酸，是一种重要的C4平台化合物，是一种常用的工业原料，广泛用于合成塑料、橡胶、染料、制药、食品加工和其它领域中，现有的市场规模超过400万吨/每年。
传统的丁二酸生产方法，是使用不可再生的化石原料，经化学合成而来；由于化石原料的匮乏以及不可再生性，限制了丁二酸的进一步应用。丁二酸也可以由微生物使用可再生资源葡萄糖、秸秆等为原料，经生物加工固定CO2合成；由于发酵法效率高、可减缓温室效应以及原料可持续利用等优点，正被广泛深入的研究。然而目前只有食品行业的丁二酸是发酵生产的，若降低微生物发酵法生产丁二酸的成本，实现用丁二酸取代很多基于苯和石化中间产物的商品，这不仅可以减少超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，还可以缓解石油化石资源的压力，实现可持续发展，进一步扩大丁二酸的市场容量。
目前已经报道的用于发酵产丁二酸菌种主要有A.succiniciproducens，E.coli，C.glutamicum，M.succiniciproducens，A.succinogenes。这些微生物都是通过糖酵解途径，分解葡萄糖生成丙酮酸等中间体，再经羧化酶固定CO2生成草酰乙酸，进一步生成苹果酸、富马酸，最终还原成丁二酸。研究表明，在CO2供给不足的情况下，丁二酸的产量明显降低，而主要生成副产物乳酸、乙酸，而CO2主要通过添加MgCO3，CaCO3，Na2CO3，NaHCO3(持续通CO2并同时利用NaOH调节pH固定CO2)等碳酸盐的方式来供给。
目前，NaHCO3或者Na2CO3(持续通CO2并同时利用NaOH调节pH固定CO2)由于其生产效率高，效果好等优点已被广泛用于发酵产丁二酸。但是由于其发酵终点含有大量钠盐，造成钠盐污染，增加发酵终点废液处理的成本，同时大规模的发酵生产丁二酸需要大量的碳酸盐或者NaOH，选择低廉、可回收利用的碳酸盐成为降低工业生产成本的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种丁二酸的发酵生产工艺，该工艺使用可回收利用的碳酸盐以降低经济成本，利于废液处理。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸，在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。
其中，好氧富集阶段的发酵条件为：30～35℃下好氧发酵12～14h，通气1～2v/vm、搅拌转速为300～600rpm。
其中，好氧富集阶段，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl2 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH 6.5。
其中，厌氧发酵生产丁二酸阶段是在好氧富集阶段结束后，在培养基中继续添加葡萄糖至30～90g/L；同时添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2，或上述三种形式中任意两种或三种的组合，其添加总量约为30～100g/L；30～35℃下厌氧发酵12～40h，搅拌转速为300～600rpm，发酵生产丁二酸。
优选的，NH4OH与CO2的摩尔比相同。
NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2在发酵法生产丁二酸的工业生产中具有很大的市场潜力，主要表现在：首先，目前NH3的合成技术趋于成熟，年产量大，使得NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或利用NH4OH固定CO2生成NH4HCO3具有很大的储备量，保证其在碳酸氢盐化学物质中价格最低；其次，发酵终点时采用膜分离法，将发酵液经微滤、超滤后，得到澄清的琥珀酸溶液，利用盐酸调节pH2.0～3.5，浓缩结晶得到琥珀酸晶体，同时得到高纯度的NH4Cl晶体，可循环利用于其他工业生产，废液经蒸发结晶后作为氮肥应用为农业生产中，不仅降低了工业生产丁二酸的成本，还几乎对环境不造成压力。因此在工业生产中使用NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或者考虑使用NH4OH固定CO2，调控pH发酵生产丁二酸具有很大社会和经济效益。
工业中使用的产丁二酸菌株大多数不耐受高浓度的铵盐，如高浓度的NH4 +影响E.coli和A.succinogenes生长和抑制丁二酸的合成代谢。主要是因为在高浓度的NH4 +环境下，一方面细胞为了维持胞内PH的稳定，需要供应更多的能量，不利于细胞的生长甚至导致细胞的死亡；另一方面NH4 +通过作用于糖代谢途径中的多个位点抑制细胞的合成代谢，影响丁二酸的生产强度以及产率。而申请人意外发现谷氨酸棒杆菌却可以在高浓度的铵盐环境下生长，厌氧条件下分解葡萄糖主要生成丁二酸，副产物种类少产量低，整个产丁二酸的过程为净消耗。这些优势使得谷氨酸棒杆菌具有良好的丁二酸生产潜力。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：
1、与其他菌种相比，谷氨酸棒杆菌具有很高的NH4 +耐受性，这为使用以NH4HCO3形式固定CO2提供了前提。
2、与NaHCO3，MgCO3，CaCO3等其他中和剂相比，NH4HCO3价格低廉，工业生产上能够降低生产成本，并且以NH4OH来固定CO2发酵生产，方法简便，进一步降低成本，带来巨大的经济效益。
3、利用本发明的方法，最终回收有机酸时，避免大量金属离子的污染处理问题，同时可以回收利用NH4Cl，或者由于废液成分简单，可以制成氮肥，用于农业生产，从而在产品处理上节约成本，同时降低环境污染。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，补加至30g/L的葡萄糖与40g/L的NH4HCO3，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30℃。厌氧发酵12h。
其中，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH6.5。
发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为14.93g/L、2.37g/L、9.63g/L，丁二酸生产强度为1.24g*L-1*h-1，丁二酸综合质量产率为0.51g/g(glucose)。
实施例2：
将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC NO.3991)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，补加至80g/L的葡萄糖与30g/L的NH4HCO3，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30℃，并以2.5g*L-1*h-1的流量流加NH4HCO3，厌氧发酵40h。
其中，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH6.5。
发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为11.56g/L和55.47g/L，丁二酸的生产强度为1.39g*L-1*h-1，丁二酸综合质量产率为0.70g/g(glucose)。
实施例3：
将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC NO.3991)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，补加至60g/L的葡萄糖与30g/L的NH4HCO3，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30℃，持续通CO2，并以NH4OH调节pH值固定CO2，控制pH值为7.0，厌氧发酵36h。
其中，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH6.5。
发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为8.62g/L和41.32g/L，丁二酸的生产强度为1.15g*L-1*h-1，丁二酸综合质量产率为0.69g/g(glucose)。
实施例4：
将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC NO.3991)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，补加至30g/L的葡萄糖与30g/L的(NH4)2CO3，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30℃，厌氧发酵20h。
其中，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH6.5。
发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为5.53g/L和20.63g/L，丁二酸的生产强度为1.03g*L-1*h-1，丁二酸综合质量产率为0.69g/g(glucose)。
实施例5：
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum 1006)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入3L发酵培养基，通空气1v/vm，转速500rpm，30℃，好氧发酵12h后，补加至30g/L的葡萄糖，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30℃，并将CO2气体以0.2v/vm的通气速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，同时以NH4OH调节pH值，控制pH值为7.0，厌氧发酵12h后，补加葡萄糖至30g/L，厌氧发酵28小时后，继续补加葡萄糖至30g/L，厌氧发酵50h。
其中，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl21mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH6.5。
发酵结果，主要转化产物为乳酸，乙酸和丁二酸，其产量分别为37.59g/L，12.12g/L和33.73g/L，丁二酸的生产强度为0.67g*L-1*h-1，丁二酸综合质量产率为0.40g/g(glucose)。
Claims (5)
1.一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸，其特征在于在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。
2.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于好氧富集阶段的发酵条件为：30～35℃下好氧发酵12～14h，通气1～2v/vm、搅拌转速为300～600rpm。
3.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于好氧富集阶段，发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，尿素2.5g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO40.5g/L，无水MgSO4 0.4g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，ZnCl2 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，CaCl2 0.2mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，初始pH 6.5。
4.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于厌氧发酵生产丁二酸阶段是在好氧富集阶段结束后，在培养基中继续添加葡萄糖至30～90g/L；同时添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2，或上述三种形式中任意两种或三种的组合，其添加总量约为30～100g/L，30～35℃下厌氧发酵12～40h，搅拌转速为300～600rpm，发酵生产丁二酸酸。
5.根据权利要求1或4所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于NH4OH与CO2的摩尔比相同。
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