CN101942486A - 一种利用味精发酵废弃菌体生产有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用味精发酵废弃菌体生产有机酸的方法，以味精生产中谷氨酸棒杆菌在好氧条件下发酵生产L-谷氨酸好氧过程结束后的废弃菌体回收转入厌氧条件生产有机酸。以厌氧培养基重悬菌泥，接种后将CO2气体通入发酵罐的发酵培养基中，30℃，搅拌培养24～48小时，并维持发酵液的pH在5.5-7.0。对制得的产品进行分析结果，谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下，能显著的积累丁二酸、乳酸、乙酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域中的有机酸的发酵方法，具体地说，涉及利用味精发酵废弃菌体谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来生产有机酸的方法。
背景技术
谷氨酸棒杆菌是目前味精行业中L-谷氨酸发酵的一种非常重要的生产菌种，谷氨酸棒杆菌发酵生产谷氨酸是一个好氧过程，产生大量的生物质菌体。目前的工艺中，发酵结束后产生的大量生物质(废弃的菌体)被用于生产菌体蛋白饲料用于畜牧业，或者用于提取核苷酸等低价值产品，资源利用率低下。一般味精发酵一吨废弃菌体中可回收核苷8-10公斤(150元/公斤)，其余再作为蛋白饲料(2000元/吨)，且该过程需要对菌体进行生化处理，消耗一定的物能，也会增加对环境的污染，所以如何更加合理的处理味精发酵的废弃菌体是味精产业中资源高效利用的关键问题。近几年，日本科学家研究发现，谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下培养具有良好的有机酸生产潜力，积累大量的乳酸、丁二酸和乙酸。谷氨酸棒杆菌生长迅速、培养条件简单、耐受性强、发酵条件成熟，同时由于其厌氧代谢途径中部分酶的缺失，使得其在厌氧条件下副产物较少，成为最具潜力的生产有机酸的工业菌种。但是该过程中的厌氧发酵需要高产量的菌体积累，所消耗的大量物能使得该应用还不能满足工业生产的经济要求，如果能够将味精生产的废弃菌体资源化利用，来作为谷氨酸棒杆菌厌氧发酵有机酸的菌体积累，则可有效解决有机酸发酵的高成本问题，使其具备产业化的价值。
丁二酸又称琥珀酸，是一种二元有机酸，它是一种重要的C4平台化合物，可作为合成复杂有机化合物的中间体，广泛应用于合成塑料、橡胶和染料、制药、食品加工和其它工业中，其市场需求量与日俱增。传统的化学合成丁二酸法因为使用化石原料、环境污染等原因受到较大限制，而微生物发酵法由于效率高、污染小等优点，正在被广泛深入的研究。但目前用于发酵生产丁二酸的菌株主要是从特征性厌氧环境(瘤胃、肠胃等)中筛选出的菌株或基因工程菌，由于在理想状态下丁二酸产率伴随着菌体浓度而增加，为了保持一个相对稳定丁二酸高产率，必须使发酵菌体达到一个高浓度的细胞密度，这个过程在实际生产中要耗费大量的培养时间与物能消耗，所以如何能够降低菌体富集的成本成了有机酸发酵产业化需要解决的关键问题。
D-乳酸作为一个重要的手性中间体，已被用于多种手性物质的合成。近年来高光学纯度的D-乳酸因为在提高聚乳酸材料性能方面的实际应用而得到了更多的关注。微生物发酵法是目前制备D-乳酸的最主要方法之一，现有的生产工艺都是利用细菌将碳水化合物经厌氧发酵而成，生产差异主要在菌种，而这个过程中提高D-乳酸生产效率的关键仍是菌体的高密度培养。目前国内外研究较多的D-乳酸生产菌主要集中在乳杆菌属和芽孢乳杆菌属，这两类菌都是专性或兼性厌氧菌，大规模高产量的D-乳酸生产依赖于菌体富集的发酵耗能，使得D-乳酸生产的关键问题同样集中在获得大量的发酵菌体，这同样也关系到聚乳酸产品的生产成本的降低，使得作为环保塑料的聚乳酸有机会取代传统塑料。
除谷氨酸以外，谷氨酸棒杆菌在其它氨基酸及其衍生物(如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺等)工业生产中一直占据中坚地位。这些氨基酸的理化性质与谷氨酸相似，在生产工艺上可以借鉴味精生产成熟的路线，因而其废弃菌体的处理也成为了发酵产业资源化高效利用的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种利用生产味精发酵废液中的菌体回收再次发酵来生产有机酸的方法，方法简便，设备要求不高，易于自动化控制，具有广泛的社会和经济效益。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
收集味精发酵废弃菌体谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，厌氧发酵培养基重悬该菌泥，然后转入发酵罐中，向发酵罐中的厌氧发酵培养基中通入CO2气体维持罐内正压(一般可控制通气量在0.2～0.5v/vm)，30℃下，搅拌培养24～40小时，并维持厌氧发酵液的pH在5.5～7.0，发酵生产有机酸；其中，所述的厌氧发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40～80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO342g/L，初始pH7.0；所述的有机酸为丁二酸、乳酸和乙酸。其中，使用碳酸盐、氨水和碱液中的任意一种或几种的组合维持厌氧发酵液的pH在5.5～7.0。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势。
1、对本发明制得的产品进行分析，结果，谷氨酸棒杆菌在厌氧条件下，能显著的积累丁二酸、乳酸、乙酸，有机酸生产强度最高可达2.48g*L-1*h-1，综合质量产率最高可达1.05g/g(glucose)，因此其产业化的经济效益是明显的。
2、利用本发明的方法，味精好氧发酵阶段结束时产生大量的菌体，直接利用其生产有机酸，省去了厌氧过程之前需要富集菌体的过程，有效的利用了生物质资源，降低了生产成本。发酵有机酸后的废弃菌体，仍可利用现有工艺再生产蛋白饲料添加剂、核酸等，同样可满足实现工业生产在经济上的要求。
3、利用本发明的方法，在厌氧产酸阶段，厌氧环境降低了整个过程中的能量消耗，同时每产生一分子丁二酸相对应的将固定一分子的CO2，对于控制碳排放具有极其重要的意义。
4、本发明的生产工艺较原有的单纯发酵有机酸没有增加新的辅料，因此不会造成对环境的二次污染，同时减少了原有工艺中味精发酵废弃菌体的后处理与有机酸发酵富集菌体的过程，减少了对环境的污染，是环境友好的工艺方法。
5、除L-谷氨酸以外，谷氨酸棒杆菌也广泛的应用于多种氨基酸及其相关衍生物的生产，其主要的产品包括L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺等。这些产品的废弃菌体同样可利用该方法实现有机酸的发酵，这为谷氨酸棒杆菌在工业生产中的综合开发利用，乃至微生物发酵工业中生物资源的充分利用提供了一种新的思路。
具体实施方式
实施例1：
收集味精工业用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10128)发酵L-谷氨酸的废弃菌体，最终获得生物量10g-dry cell×L-1。(OD600nm＝0.25g-dry cell×L-1)。
将菌泥用好氧结束时等体积的厌氧培养基充分悬浮，转移至厌氧发酵罐中，之后将CO2气体以0.2v/vm的通气速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度控制在30℃，厌氧发酵24小时。
厌氧发酵培养基：葡萄糖40g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L。初始pH7.0。
发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为6.72g/L、1.34g/L、30.5g/L，有机酸生产强度1.6g*L-1*h-1，综合质量产率为0.96g/g(glucose)。
实施例2：
收集味精工业用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10128)发酵L-谷氨酸的废弃菌体，最终获得生物量10g-dry cell×L-1。(OD600nm＝0.25g-dry cell×L-1)。
将菌泥用好氧结束时等体积的厌氧培养基充分悬浮，转移至厌氧发酵罐中，之后将CO2气体以0.2v/vm的通气速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度控制在30℃，厌氧发酵32小时。
厌氧发酵培养基：葡萄糖80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L。初始pH7.0。
发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为56.82g/L、3.15g/L、19.28g/L，有机酸生产强度2.48g*L-1*h-1，综合质量产率为0.99g/g(glucose)。
实施例3：
收集味精工业用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10129)发酵L-谷氨酸的废弃菌体，最终获得生物量10g-dry cell×L-1。(OD600nm＝0.25g-dry cell×L-1)。
将处理过的菌泥用好氧结束时等体积的厌氧培养基充分悬浮，转移至厌氧发酵罐中，之后将CO2气体以0.2v/vm的通气速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度控制在30℃，厌氧发酵28小时。
厌氧发酵培养基：葡萄糖40g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L。初始pH7.0。
发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为16.84g/L、1.26g/L、20.64g/L，有机酸生产强度1.38g*L-1*h-1，综合质量产率为0.97g/g(glucose)。
实施例4：
收集味精工业用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10129)发酵L-谷氨酸的废弃菌体，最终获得生物量10g-dry cell×L-1。(OD600nm＝0.25g-dry cell×L-1)。
将处理过的菌泥用好氧结束时等体积的厌氧培养基充分悬浮，转移至厌氧发酵罐中，之后将CO2气体以0.2v/vm的通气速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，搅拌转速为200rpm，温度控制在30℃，厌氧发酵40小时。
厌氧发酵培养基：葡萄糖80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L。初始pH7.0。
发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为33.98g/L、2.26g/L、47.88g/L，有机酸生产强度2.1g*L-1*h-1，综合质量产率为1.05g/g(glucose)。
注：本发明实施例中所采用的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC10128)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 10129)均为常规使用的菌种，可市售获得。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种利用味精发酵废弃菌体生产有机酸的方法，其特征在于收集味精发酵废弃菌体谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，厌氧发酵培养基重悬该菌泥，然后转入发酵罐中，向发酵罐中的厌氧发酵培养基中通入CO2气体维持罐内正压，30℃下，搅拌培养24～40小时，并维持厌氧发酵液的pH在5.5～7.0，发酵生产有机酸；其中，所述的厌氧发酵培养基包括如下组分：葡萄糖40～80g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·H2O 6mg/L，生物素0.2mg/L，维生素B1 200μg/L，NaHCO3 42g/L，初始pH7.0；所述的有机酸为丁二酸、乳酸和乙酸。
2.根据权利要求1所述的利用味精发酵废弃菌体生产有机酸的方法，其特征在于使用碳酸盐、氨水和碱液中的任意一种或几种的组合维持厌氧发酵液的pH在5.5～7.0。
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