CN103509747B - 一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于厌氧转化生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因及来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶克隆到谷氨酸棒杆菌（ATCC13032）中，并且用同源重组的方式敲除该谷氨酸棒状杆菌的乳酸脱氢酶基因。本发明构建的乳酸脱氢酶缺陷型并共表达羧化酶基因的谷氨酸棒状杆菌，以细胞重复利用的方式进行丁二酸的厌氧生产，能大大提高丁二酸的产量，产量达到75g/L，糖酸转化率75%，具有很好的应用前景；且根据丁二酸生物转化的最适条件，构建发酵模型，尤其是细胞重复利用的发酵模型，细胞重复批次转化过程中产酸性能基本保持稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于微生物基因工程技术领域。
背景技术
丁二酸，又名琥珀酸，被广泛用于食品，制药，化学等工业，并且可作为聚合材料的前体，目前琥珀酸大多是通过化学合成的方法，该方法是建立在依赖于石油，高污染，高成本的基础之上的。生物法制备丁二酸利用的是可再生能源，不依赖于日渐枯竭的石油资源，并且通过微生物发酵制备丁二酸的过程中可以吸收温室气体CO2，而传统化学法制备丁二酸会释放大量的CO2。
微生物发酵生产丁二酸，大多采用从反刍动物的胃中分离的微生物菌株、大肠杆菌及其经人工改造过的菌株。已知的高产菌株有产琥珀酸放线杆菌、曼海姆菌、厌氧螺菌及经改造过的大肠杆菌。其发酵方式多为厌氧发酵，生长和发酵阶段都在厌氧的条件下进行，而厌氧条件下除严格厌氧微生物外一般微生物的生长都会受到限制。并且直接从自然界筛选的菌种其丁二酸的产量一般都不太高，要想提高产量除培养方式上的优化外主要是通过对微生物的遗传特性进行改造修饰。
通过分子生物学手段构建工程菌是一个较为有效的微生物菌种遗传特性改造的方法之一。目前丁二酸的工程菌上大多是针对大肠杆菌的特性进行修饰或改造的。但相关实验及报道显示谷氨酸棒状杆菌有着更为强劲的丁二酸生产潜力。为降低谷氨酸棒状杆菌中的副产物的含量并提高丁二酸的产量，构建了谷氨酸棒状杆菌工程菌，进行两阶段丁二酸的生产。韩国有研究人员将大肠杆菌W3110进行pta、ldhA双重突变，两阶段进行生产丁二酸，有效地提高了丁二酸的产量（潘在龟，申秀安，朴赞圭等.ptaldhA双重突变大肠杆菌SS373及由其生产琥珀酸的方法.申请号98808709.X）。但丁二酸的产量只达到11g/L，有待进一步改进。且一次厌氧转化后丢弃的细胞是一种巨大的浪费。
目前以大肠杆菌为出发菌构建产丁二酸的基因工程菌已经有较多报道，包括乙酰磷酸转移酶(pta)和乳酸脱氢酶(ldh)缺陷、丙酮酸羧化酶的外源表达等。但大肠杆菌的初糖及盐的耐受度都不高，且副产物较多，不仅降低了碳的有效转化效率，而且大幅增加分离提取工艺的复杂度，提高了发酵工艺的难度。近年来随着谷氨酸棒状杆菌的遗传背景的研究越来越清晰，通过分子生物学手段对谷氨酸棒状杆菌进行代谢工程育种的遗传操作方式也变得多样化。选择以谷氨酸棒状杆菌作为背景，进行遗传改造。谷氨酸棒状杆菌在厌氧环境中进行丁二酸生产时主要副产物为乳酸，谷氨酸棒杆菌中乳酸的形成是以丙酮酸作为底物在乳酸脱氢酶的催化下合成的，并且谷氨酸棒状杆菌中并未有乳酸脱氢酶的同工酶。谷氨酸棒状杆菌中乳酸脱氢酶的失活导致胞内丙酮酸的累积，使得更多的碳源流向了C4途径。从而一方面降低了乳酸的产量，另一方面还提高了丁二酸的产量。姜岷等公开了将大肠杆菌经分子生物学改造后，重组大肠杆菌能够高效利用多种单糖，同时高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长，大幅提高了丁二酸的合成效率（姜岷，刘嵘明，梁丽亚等.产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法.申请号201210143174.4）。但总体产酸水平较低，还需添加价格较为昂贵的碱式碳酸镁，提高了生产成本。
丙酮酸羧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒状杆菌在厌氧条件下丁二酸合成前体物质草酰乙酸形成的关键酶。丙酮酸羧化酶催化丙酮酸转化为草酰乙酸，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸。谷氨酸棒状杆菌中同时存在这两种酶，为最大化丁二酸合成的前体物质草酰乙酸将上述两种酶的基因同时在谷氨酸棒状杆菌中进行外源表达。
谷氨酸棒状杆菌为好氧菌，在厌氧的环境下其生长受到很大的限制。而丁二酸的积累大多是发生在厌氧的环境下进行。采用两阶段厌氧转化的方式是一种较为有效的办法。为简化丁二酸生产工艺路线，降低丁二酸生产成本。通过细胞重复利用的生产方式进行细胞循环利用连续产酸，该项技术不仅节省了大量的生产成本，而且大大的提高了产酸效率。在好氧环境下用营养丰富的培养基将让细胞大量繁殖，得到大量的谷氨酸棒状杆菌细胞。收集的细胞在不含氮源的培养基中置于厌氧的环境条件下，该环境下谷氨酸棒状杆菌的细胞生长受到限制处于一种静态状态，但细胞的代谢保持活跃状态，以葡萄糖作为底物细胞能将糖类完全代谢为有机酸等产物。并且厌氧转化结束后收集细胞可再次用于丁二酸的生产。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌。
一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）工程菌，其特征在于包括：
1）通过同源重组的方式敲除了ldh基因；
2)通过启动子Ptac表达外源pyc和ppc基因。
其特征在于所述ppc基因核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。
其特征在于所述pyc基因核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。
其特征在于所述pyc和ppc基因的表达包括在同一载体上分别使用启动子Ptac表达或者同一载体上使用一个启动子Ptac顺序表达。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法。
一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）构建基因敲除质粒PK18mobsacB/Δldh，转化后得到谷氨酸棒杆菌的ldh基因的缺失突变株；
2)构建重组表达质粒pDXW-8/ppc/pyc；
3）将重组表达质粒转化到ldh基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株后，得到高产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌；
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的在生产中的应用。
一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌在丁二酸生产中的应用。
其特征在于所述丁二酸生产包括如下步骤：
1)在有氧条件下培养谷氨酸棒状杆菌Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌，然后离心收集菌体；
2)在厌氧条件下降收集到菌体用于发酵生产丁二酸。
其特征在于所述有氧培养条件：培养基（g/L）:葡萄糖25、玉米浆35、K2HPO4·3H2O1.5、MgSO4·7H2O4、尿素5、pH7.0-7.2。一级种子经摇床培养，培养温度32℃，摇床转速100r/min，培养时间12h。二级种子转接到发酵罐中装液量5L，接种量5%，控制相对溶氧20-50%，控制pH6.5-7.5，培养时间约14h。
其特征在于所述厌氧培养条件：培养基（g/L）：葡萄糖122g/L、生物素0.2mg/L、KH2PO40.5mg/L、K2HPO4·3H2O0.5mg/L、MgSO4·7H2O0.5mg/L、VB10.2mg/L，碳酸氢钠80g/L；溶氧控制在0.01mg/L以下，葡萄糖分两次流加，当葡萄糖低于20g/L时，开始连续流加800g/L葡萄糖溶液。碳酸氢钠直接在0h、6h、12h、20h直接加入等量粉末碳酸氢钠中浓度80g/L。32℃，缓慢搅拌厌氧发酵40h。
其特征在于所述发酵离心等到的谷氨酸棒状杆菌Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌可以连续用于丁二酸的发酵生产。
本发明通过分子生物学的手段使得谷氨酸棒状杆菌中基因组上的乳酸脱氢酶基因缺失，并将谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因及来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶克隆到谷氨酸棒杆菌（ATCC13032）中表达，得到高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌。根据棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵方式，先采用适合细胞生长及外源基因表达的条件进行，进行细胞的培养，然后采用细胞循环利用的方式进行丁二酸的生产。经40h厌氧发酵，最终丁二酸产量在75g/L，糖酸转化率75%。不仅丁二酸的产量得到很大的提高，而且减少了副产物的产生，提高了转化率。细胞重复利用进行生产丁二酸的发酵方式大大降低了生产成本提高了生产效率。本发明可用于棒状杆菌进行丁二酸的生产。
附图说明
图1谷氨酸棒杆菌厌氧产酸代谢途径
图2重组质粒pk18mobsacB/Δldh构建示意图
图3同源双交换进行基因敲除原理图
图4共表达质粒构建示意图
图5细胞重复利用产酸过程曲线图
具体实施方式
作为本发明的一种典型应用方式，本发明的技术方案可以包含:
本发明所述的谷氨酸棒状杆菌为ATCC13032。
本发明所述的基因敲除质粒是pK18mobsacB。
本发明所述的表达质粒为pDXW-8。
如下详细说明本发明的实现途径：
1.产丁二酸棒状杆菌代谢途径改造
用于本发明方法中编码乳酸脱氢酶的基因具有缺失突变，降低了碳源流向乳酸的代谢。野生型谷氨酸棒状杆菌上的乳酸脱氢酶基因全长约为900bp，基因缺失突变株的乳酸脱氢酶基因全长约为300bp。乳酸脱氢酶基因缺失突变使得乳酸脱氢酶的失活，阻断了乳酸的形成代谢（谷氨酸棒状杆菌中无乳酸脱氢酶同工酶）。
乳酸脱氢酶基因缺失是通过同源重组的方式进行基因敲除，缺失突变时通过两次同源重组筛选后经PCR获得的，方法参考《MolecularCloning：ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，2001。
2..棒状杆菌产丁二酸合成途径关键酶基因的制备与表达
PPC基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶促进磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸，PYC基因编码的丙酮酸羧化酶促进丙酮酸转化为草酰乙酸。将上述获得的乳酸脱氢酶缺陷型的谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶基因(pyc)及大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)与合适的谷氨酸棒状杆菌表达载体相连，如pDXW-8（参阅公开号为CN101693901A的发明专利），其中ppc在pyc之前，即pDXW-8/ppc/pyc。谷氨酸棒状杆菌丙酮酸羧化酶基因(pyc)及大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)在载体上形成一个操纵子。表达质粒上的基因pyc、ppc同受一个启动子Ptac控制，也可在各自基因前加入一个启动子，构建双启动子的表达系统。
将所构建的表达质粒pDXW-8/ppc/pyc，转化大肠杆菌JM109宿主菌，构建JM109/pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌。
表达质粒的基因可用于构建基因工程菌的棒状杆菌宿主菌是棒状杆菌，如：谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌。将上述构造的重组表达质粒pDXW-8/ppc/pyc转化乳酸脱氢酶缺陷的上述宿主菌中。
3..利用构建的丁二酸棒状干杆菌基因工程菌发酵生产丁二酸
首先采用常规方法进行细胞培养，采用经典培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质及所维生素等有机营养物质。另外，合成或天然培养基均可采用，只要菌株可以利用的培养基均可进行细胞的培养，但需在培养基中添加相应的抗性。培养条件为好氧培养，相对溶氧控制在20-50%，培养温度32℃，培养过程控制pH6.5-7.5，培养13h后培养基中会累积大量的菌体。
菌体培养结束后，可采用离心等方法从培养液中收集菌体。
4..利用构建的丁二酸棒状杆菌基因工程菌进行连续丁二酸发酵模型的建立
培养收集的菌体为有活力的菌体，菌体可用于厌氧条件下进行有机酸的生产。有机酸生产所用的培养基为基本碳源、无机盐、维生素、生物素及碳酸氢钠。
就碳源而言，可以包含多种糖类如：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，果糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类均可作为生产丁二酸的底物。
无机盐、生物素、维生素在维持渗透压，提供一些酶的辅酶等。
碳酸氢盐为必须添加物，一方面调节pH值，一方面为有机酸生产提供一种共底物。碳酸氢盐可以是碳酸氢钠、碳酸氢钾等，或者在产酸过程中同时通入CO2。碳酸氢盐溶解度较低，需分批次加入。以防止pH值改变过大。
产酸过程中用高浓度的氢氧化钠维持pH值7.0-7.5，温度维持在32℃，溶氧维持在0.01mg/L以下。
发酵过程中，检测OD600、残糖、有机酸浓度，并间歇性添加碳酸氢盐，绘制发酵过程曲线。
以下为本发明的技术方案的详细说明：
实施例1大肠杆菌JM109感受态的制备和转化
①将用20%甘油冷冻保藏的菌液，在相应抗性的LB平板上划线，于37℃恒温箱隔夜培养，待长出单菌落后，接单菌落于15mL相应抗性的LB液体培养基，于37℃，100r/min摇床隔夜培养；
②将隔夜培养物按1%的接种量转接于50mL/500mL新鲜LB液体培养基，于37℃，100r/min摇瓶培养约1.5-2h，待OD600约为0.6，冰浴10min；
③4℃，5,000r/min离心10min，丢弃上清，收集菌体；将菌体重悬于20ml100mmol/L的CaCl2溶液中，冰浴20min；4℃，5,000r/min离心10min，丢弃上清，收集菌体；
⑤取1mL100mmol/L的CaCl2溶液(含有15%甘油)慢慢吹吸轻柔悬浮菌体；
⑥取70μL分装于灭菌1.5mL离心管中，直接用于转化或者-20℃保存；
⑦取2μL质粒或10μL酶连产物，待感受态于冰上融化后，慢慢吹吸轻柔混匀后冰浴30min；
⑧42℃热激90s后冰浴1min，加入1mL新鲜LB或者SOC培养基，37℃复苏1h；
⑨8,000×g离心1min，弃上清，取100μL，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板。
⑩于37℃恒温箱培养10-12h，待长出转化子后挑取转化子于相应抗性的LB液体培养基37℃培养12h后，抽提质粒进行酶切验证质粒连接是否正确
实例2基因缺失质粒的构建及基因缺失
ldh基因敲除质粒是通过酶连的方法将用于同源重组的左右同源臂依次连接到pk18mobsacB上。过程如下，通过引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2以野生型的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组为模板进行常规PCR获得左同源臂基因片段(1175bp)，获得的基因片段用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。将pk18mobsacB质粒和纯化后的左同源臂基因片段用EcoRI和SalI双酶切后，两者通过琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒进行基因片段回收。用T4连接酶将左同源臂连接到质粒上。同样的方式引物SEQIDNO:3、SEQIDNO:4以野生型的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组为模板进行常规PCR获得右同源臂(1155bp)，将连接有左同源臂的重组质粒和右同源臂进行SalI和HindIII双酶切后进行酶连，获得重组质粒pk18mobsacB/Δldh。重组质粒转化JM109后，抽提质粒进行酶切验证质粒连接正确性。
谷氨酸棒状杆菌基因敲除实验[60]：
(1)将用于基因敲除的质粒转化入谷氨酸棒状杆菌，在转化后涂布在抗性平板上生长的谷氨酸棒状杆菌单菌落转接到LB+kan(卡那霉素25mg/L)抗性平板上。
(2)有卡那霉素抗性的谷氨酸棒状杆菌既是已经过第一次同源重组将重组质粒同源交换到谷氨酸棒状杆菌的基因组上。将带有抗性的谷氨酸棒状杆菌用新鲜的液体LB培养基，32℃，100r/min，培养过夜。
(3)培养过夜的培养物用LB培养基进行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释，取100μL培养液进行如下表的方式进行涂板。
| 菌液稀释度 | 平板 |
| 10-2和10–4 | on LB-10%suc |
| 10–2 | on LB-kan25-10%suc |
| 10–4 | on LB-kan25 |
注：10%suc为培养基中蔗糖终浓度10%，kan25为培养基中卡那霉素终浓度为25mg/L
(4)将以上的平板在32℃恒温培养箱正置1h后，倒置培养24h，观察实验结果。
(5)实验结果分析是对每个平板上的菌落单位进行统计和分析。若果出现以下实验结果时，则说明实验是理想状态可以进行下一步实验。
稀释度为10–4的菌液在LB-kan25平板上的单菌落个数明显比稀释度为10–2的菌液在LB-kan25-100g/Lsuc(卡那霉素25mg/L＋蔗糖浓度100g/L)平板上多，稀释较多的长出的单菌落反而较多，说明蔗糖对基因组上有sacB基因的谷氨酸棒状杆菌有一定的致死作用。在LB-kan25(卡那霉素25mg/L)平板上能够生长的是没有发生第二次同源重组的谷氨酸棒状杆菌，在LB-kan25-100g/Lsuc(卡那霉素25mg/L＋蔗糖浓度100g/L)平板上生长的也是没有发生第二次同源重组的谷氨酸棒状杆菌并且是非蔗糖致死的菌落，及经过了第一次同源重组但蔗糖致死是无效的。
(6)如果出现以上所述的情况，则将LB-100g/Lsuc(蔗糖浓度为100g/L)平板上的单菌落分别在LB和LB+kan(卡那霉素25mg/L)平板上划线，每个单菌落分别划线在LB和LB+kan(卡那霉素25mg/L)平板对应编号的区域内。32℃恒温培养箱正置1h后，倒置培养24h，观察实验结果。
(7)只能在LB上生长不能在LB+kan(卡那霉素25mg/L)上生长的菌株即是发生了第二次同源重组的菌株，能同时在两种平板上生长的是没有发生第二次同源重组，并且sacB基因失效的菌株。将只能在LB平板上生长的菌株进行单菌落PCR，分选出基因缺失突变株与回复突变株。
实例3表达质粒pDXW--8/ppc/pyc的构建
以SEQIDNO:5、SEQIDNO:6为引物，谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，常规PCR扩增出基因后经PCR纯化试剂盒进行纯化。将纯化后的基因片段及质粒pDXW-8用NcoI、HindIII双酶切，酶切后的产物1%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收基因片段及线性化的质粒片段。纯化后的片段进行酶连，连接产物直接转化大肠杆菌JM109感受态细胞。菌落PCR挑选出携带重组质粒大肠杆菌阳性菌。质粒小提得到重组表达质粒pDXW-8/pyc，以SEQIDNO:7、SEQIDNO:8为引物，高产赖氨酸大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增出目的基因后如上述的实验方式构建重组表达质粒pDXW-8/ppc，通过NcoI、EcoRI进行双酶切鉴定。为构建共表达质粒pDXW-8/pyc/ppc，选择重组质粒pDXW-8/ppc及经PCR扩增的pyc基因NcoI、HindIII双酶切后，酶连转化得到共表达的重组质粒。由于重组质粒pDXW-8/pyc/ppc上所连接的pyc基因会被EcoRI酶切，所重组质粒pDXW-8/pyc/ppc酶切验证时选择NcoI、HindIII进行，一条大小为3,400bp左右的pyc条带，另一条带为连接有ppc基因的pDXW-8的线性化条带，其分子量略大于线性化的pDXW-8条带稍有滞后。
实例4谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh--pDXW--8/ppc/pyc基因工程菌的构建
(1)谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态制备
①接单菌于相应抗性的15mLLBG培养基，于合适温度下隔夜培养；
②按1%接种量转接于新鲜的50mL液体EPO培养基于合适温度下培养至OD600约为0.9；
③冰上冷却10min，4℃，5,000r/min离心10min，丢弃上清，收集菌体；
④用20mL预冷的10%甘油洗涤4次；
⑤用1mL10%甘油重悬后，取合适体积的感受态细胞和适量pDXW-8/ppc/pyc于1mm电击杯混匀，置冰上10min；
（2）转化：
①1800V，5ms电击一次，电击参数：Tc(ms)5，Volt(V)1800，Cap(μFd)25，Res(Ω)200；
②立即加入预热到46℃的LBHIS培养基中800μL，46℃热击6min；
③热击后的菌液置于32℃摇床中恢复培养2-3h。
④8,000×g离心1min，留100μL，其余上清丢弃，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板，32℃培养36h；
⑤将长出的阳性转化子转接于LB+kan(卡那霉素25mg/L)液体培养基，培养12h后抽提质粒进行酶切鉴定是否为正确导入pDXW-8/ppc/pyc。
实例5谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh--pDXW--8/ppc/pyc基因工程菌细胞重复利用发酵生产丁二酸
经在种子培养基下好氧培养，将二级种子培养液接种于装有种子培养液的发酵罐，对上述的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌进行培养，获得大量用于厌氧生产丁二酸的菌体。其中，
(1)液体种子培养基（g/L）:葡萄糖25、玉米浆35、K2HPO4·3H2O1.5、MgSO4·7H2O4、尿素5、pH7.0-7.2。一级种子经摇床培养，培养温度32℃，摇床转速100r/min，培养时间12h。二级种子转接到7L发酵罐中装液量5L，接种量5%，控制相对溶氧20%以上，培养时间约14h。6000r/min，10min离心收集菌体。
注：发酵罐中的种子培养液需将葡萄糖分消，接种前混合均匀。
(2)发酵培养基（g/L）：葡萄糖122g/L、生物素0.2mg/L、KH2PO40.5mg/L、K2HPO4·3H2O0.5mg/L、MgSO4·7H2O0.5mg/L、VB10.2mg/L，碳酸氢钠80g/L(间歇性添加)。
注：发酵过程中控制无氧的环境（溶氧控制在0.01ppm以下），葡萄糖分两次流加，当葡萄糖低于20g/L时，开始连续流加800g/L葡萄糖溶液。碳酸氢钠直接在0h、6h、12h、20h直接加入等量粉末碳酸氢钠中浓度80g/L。32℃，缓慢搅拌厌氧发酵40h。
经40h厌氧发酵，最终丁二酸产量在75g/L，糖酸转化率75%。
发酵后经离心收集菌体，发酵液用于残糖分析，有机酸测定。菌体直接再次用于同样方式的丁二酸生产，连续三批生产其丁二酸生产能力没有任何减弱。
Claims (2)
1.一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)构建ldh基因敲除质粒：
使用引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2以野生型的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组为模板进行PCR，获得左同源臂基因片段,再将pk18mobsacB质粒和纯化后的左同源臂基因片段用EcoRI和SalI双酶切后，两者通过琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒进行基因片段回收，然后用T4连接酶将左同源臂连接到质粒上；同样的方式使用引物SEQIDNO:3、SEQIDNO:4以野生型的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组为模板进行PCR，获得右同源臂，然后将连接有左同源臂的重组质粒和右同源臂进行SalI和HindIII双酶切后进行酶连；最后将用于同源重组的左右同源臂依次连接到pk18mobsacB上，获得ldh基因敲除质粒转化后得到谷氨酸棒杆菌的ldh基因的缺失突变株；
2)构建ppc基因和pyc基因共表达重组质粒：
以SEQIDNO:5、SEQIDNO:6为引物，谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，PCR扩增后经PCR纯化试剂盒进行纯化，再将纯化后的基因片段及质粒pDXW-8用NcoI、HindIII双酶切，酶切后的产物1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收基因片段及线性化的质粒片段，纯化后的片段进行酶连，连接产物直接转化大肠杆菌JM109感受态细胞，菌落PCR挑选出携带重组质粒大肠杆菌阳性菌；质粒小提得到重组表达质粒pDXW-8-pyc；同样以SEQIDNO:7、SEQIDNO:8为引物，高产赖氨酸大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增出目的基因后构建重组表达质粒pDXW-8-ppc，通过NcoI、EcoRI进行双酶切鉴定后选择重组质粒pDXW-8-ppc及经PCR扩增的pyc基因进行NcoI、HindIII双酶切后，酶连转化得到ppc基因和pyc基因共表达的重组质粒；
3)将ppc基因和pyc基因共表达重组表达质粒转化到ldh基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株后，得到高产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的方法构建的工程菌应用于丁二酸生产，其特征在于所述丁二酸生产包括如下步骤：
1)在有氧条件下培养谷氨酸棒状杆菌基因工程菌，然后离心收集菌体；
2)在厌氧条件下降收集到菌体用于发酵生产丁二酸；
所述有氧培养条件：培养基(g/L):葡萄糖25、玉米浆35、K2HPO4·3H2O1.5、MgSO4·7H2O4、尿素5、pH7.0-7.2。一级种子经摇床培养，培养温度32℃，摇床转速100r/min，培养时间12h；二级种子转接到发酵罐中装液量5L，接种量5％，控制相对溶氧20-50％，控制pH6.5-7.5，培养时间约14h；所述厌氧培养条件：培养基(g/L)：葡萄糖122g/L、生物素0.2mg/L、KH2PO40.5mg/L、K2HPO4·3H2O0.5mg/L、MgSO4·7H2O0.5mg/L、VB10.2mg/L，碳酸氢钠80g/L；溶氧控制在0.01ppm以下，葡萄糖分两次流加，当葡萄糖低于20g/L时，开始连续流加800g/L葡萄糖溶液，碳酸氢钠直接在0h、6h、12h、20h直接加入等量粉末碳酸氢钠中浓度80g/L，32℃，缓慢搅拌厌氧发酵40h；所述发酵离心等到的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌可以连续用于丁二酸的发酵生产。
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